[硕博论文][病理学与病理生理学]EB病毒和p16基因甲基化在子宫颈鳞状细胞癌和癌前病变中的表达及意义-免费论文
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[硕博论文][病理学与病理生理学]EB病毒和p16基因甲基化在子宫颈鳞状细胞癌和癌前病变中的表达及意义
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泸州医学院 硕士学位论文EB病毒和p16基因甲基化在子宫颈鳞状细胞癌和癌前病变中的表 达及意义 姓名：刘秀华 申请学位级别：硕士 专业：病理学与病理生理学 指导教师：龙汉安
英汉缩略词对照表英文缩写 英文全称 中文ＷＨＯ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ 世界卫生组织 ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎＣＩＮ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ 子宫颈上皮内瘤变 Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｕｍｏｒ 多肿瘤抑制因子 Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｉｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ 细胞周期素依赖性激 Ｋｉｎａｓｅ ４ 酶４ＥＢＶ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｅｓ ＥＢ病毒ＨＰＶ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ 人乳头状瘤病毒ＣＳＣＣ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ 子宫颈鳞状细胞癌 ＣａｒｃｉｎｏｍａＭＳＰＣＲ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ―Ｓｐｅｃｉｆｉｃ 甲基化特异性聚合酶 Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ Ｃｈａｉｎ 链反应 Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｌａｔｅｎｃｙ Ｍｅｍｂｒａｎｅ 潜伏膜蛋白１ ＰｒｏｔｅｉｎＰＢＳ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂａｌａｎｃｅｄ 磷酸盐缓冲液 Ｓｏｌｕｔｉｏｎ狂ＩＣ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 免疫组织化学ＥＢ Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ 溴化乙锭ＦＩＳＨ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｒｅ 荧光原位杂交 ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＥＢＮＡ．２ Ｅｐｓｔｅｉｎ―Ｂａｒｒ Ｎｕｃｌｅａｒ ＥＢ病毒相关核抗原 Ａｎｔｉｇｅｎ Ｈｏｍｏ―ｓａｐｉｅｎｓ Ｔ ｃｅｌｌ 人类Ｔ细胞白血病病 Ｉ，ｅｕｋａｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ 毒１ ４２ＣｐＧ Ｃｙｔｉｄｙｌｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ 磷酸胞苷酰基鸟苷 ＧｕａｎｏｓｉｎｅＣ Ｃｙｔｏｓｉｎｅ 胞嘧啶Ｕ Ｕｒａｃｉｌ 尿嘧啶ＳＰ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ 链霉亲和素．过氧化物 Ｍｅｔｈｏｄ 酶染色法ＦＩＧＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ 国际妇产科联盟 Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓＳＣ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔａｇｅ 临床分期ＡＧＥ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ 琼脂糖凝胶电泳 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ４３ 泸州医学院硕士研究生 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。&&&&学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。&&&&其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。&&&&学位论文作者签名：刘秀华 签字日期：抄７年 岁月ｇ Ｅｔ 泸州医学院学位论文版权使用授权书 本人完全了解泸州医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：泸州医学院有权保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。&&&&本人授权泸州医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存学位论文，即：泸州医学院具有学位论文的数字化制品复制权，信息网络传播权和汇编权。&&&&保密的学位论文在解密后适用本授权书。&&&&学位论文作者签名：刘鸯华 导师签名：签字日期：；一７年厂月 Ｅｔ 签字日期：７●７年厂月矿日 ｇ ＥＢ病毒和ｐ１６基因甲基化在 子宫颈鳞状细胞癌和癌前病变中的表达及意义 摘 要 目的：采用甲基化特异性聚合酶链反应（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ―ＳｐｅｃｉｆｉｃＰｏｌｙｍｅｒｉｚｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＭＳＰＣＲ）检测不同子宫颈组织中ｐ１６基因甲基化的情况并结合免疫组化（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）技术检测ＥＢ病毒 （Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）和ｐ１６基因蛋白表达，分析ＥＢＶ感染与子宫颈鳞状细胞癌（Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＣＳＣＣ）的发病关系，探讨ＥＢＶ的可能致癌机制，以期为ＣＳＣＣ的早期诊断和子宫颈上皮内瘤变 （Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ：ＣＩＮ）恶性潜能的评估提供线索和依据。&&&&方法：１．收集泸州医学院附属医院病理科２００５年１月～１１月存档的子宫颈病变的石蜡标本和相应的临床病理资料共８２例，其中包括ＣＳＣＣ组织２９例，ＣＩＮ组织４０例及正常子宫颈鳞状上皮组织１３例。&&&&组织病理分级：ＣＩＮ Ｉ～ＩＩ级２０例，ＣＩＮⅡＩ级２０例。&&&&临床分期（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔａｇｉｎｇ，ＳＣ）按２００２年国际妇产科联盟（Ｉｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，ＦＩＧｏ）公布的新分期方法：Ｉ期１４例，ＩＩ、ⅡＩ期１５例。&&&&２．构建组织芯片（Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）结合链霉亲和素――过氧化物酶染色法 （Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ Ｍｅｔｈｏｄ，ＳＰ法）检测正常子宫颈鳞状上皮组织、ＣＩＮ、ＣＳＣＣ组织中ｐ１６蛋白和ＥＢＶ的表达情况（切片过程中ＣＩＮＩＩＩ级和ＣＳＣＣ ＩＩ、Ⅲ期组织各缺失１例，将缺失的病例从实验组中删除，实际入选病例为８０例）。&&&&３．以ＭＳＰＣＲ技术扩增并鉴定ｐ１６基因甲基化的发生率。&&&&４．实验结果应用ＳＰＳＳｌ２．０ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ软件包对实验数据进行统计学处理。&&&&采用四格表，检验和Ｆｉｓｈｅｒ’Ｓ精确概率法检验，以Ｐ＜０．０５为有统计学 １ 意义。&&&&结果：１．正常子宫颈鳞状上皮组织、ＣＩＮ和ＣＳＣＣ组织中，ＥＢＶ蛋 白阳性表达率分别为１５．３８％（２／１３）、５１．２８％（２０／３９）、６７．８６％（１９／２８），表达率呈递增趋势。&&&&其中正常子宫颈鳞状上皮组织与ＣＩＮ比较差异有显著性（，＝５．１４７，Ｐ＝－０．０２３＜０．０５）；正常子宫颈鳞状上皮与ＣＳＣＣ比较差异有显著性（细．７８４，Ｐ＝－０．００２＜０．０５）；ＣＩＮ组间、ＣＳＣＣ组织学分级及临床分期之间比较差异无显著性。&&&&２．正常子宫颈鳞状上皮组织、ＣＩＮ和ＣＳＣＣ中，ｐ１６蛋白阳性表达率分别为７．６９％（１／１３）、６４．１０％（２５／３９）、７８．５７％（２２／２８），。&&&&表达率呈递增趋势。&&&&其中正常子宫颈鳞状上皮组织与ＣＩＮ比较差异有显著性（，＝１２．４１，Ｐ＝０．０００＜０．０５）；正常子宫颈鳞状上皮组织与ＣＳＣＣ比较差异有显著性（庐１８．１１，Ｐ＝－０．０００＜０．０５）；而ＣＩＮ与ＣＳＣＣ比较差异无显著性 （存１．６２９，Ｐ＝－０．２０２＞０．０５）。&&&&ＣＩＮ Ｉ～ＩＩ与Ｃ１ＮＩＩＩ级阳性表达率分别为４５．００％（９／２０）和８４．２１％（１６／１９），两者比较差异有显著性（矿－６．５ １ ０，Ｐ＝－０．０１ １＜０．０５）；ＣＳＣＣ组织学分级及临床分期之间比较差异无显著性 （胗Ｏ．０５）。&&&&３．ｐ１６０Ｍ和ｐ１６－Ｕ扩增的目标序列长度分别为１５０ｂｐ、１５１ｂｐ，产物经琼脂糖凝胶电泳（Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＡＧＥ）分离后在ＤＮＡｍａｒｋｅｒ指示的相应位置上分别出现ｐ１６．Ｍ和ｐ１６．Ｕ两条明亮、边缘清晰的单一条带或只出现ｐ１６－Ｍ单一条带为阳性（＋）结果，只有ｐ１６．Ｕ相应位置上出现清晰条带而ｐ１６．Ｍ相应位置没有或仅有非特异性条带者为阴性 （一）结果。&&&&正常子宫颈鳞状上皮组织、ＣＩＮ和ＣＳＣＣ组织中，ｐ１６ ＭＳＰＣＲ阳性者分别为０．００％（０／１３）、１７．９５％（７／３９）、２５．００％（７／２８），表达率呈递增趋势。&&&&正常子宫颈鳞状上皮组织与ＣＳＣＣ比较差异有显著性（ｘＺ＝３．９１９，Ｐ＝－０．０４８＜０．０５）；ＣＳＣＣ组织学分级与临床分期之间比较差异无显著性 （尸＞Ｏ．０５）。&&&&４．应用免疫组化检测８０例子宫颈组织，ＥＢＶ阳性表达４１例，ｐ１６蛋白阳性表达４８例：应用ＭＳＰＣＲ方法检测ｐ１６基因甲基化１４例阳性。&&&&４１例ＥＢＶ阳性表达的子宫颈组织中甲基化ｐ１６阳性８例，ｐ１６蛋白阳性２６例；而ＥＢＶ阴性３９例中甲基化ｐ１６阳性６例，ｐ１ ６蛋白阳性２２例。&&&&应用Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ精确概率法检验ｐ１６基因甲基化在ＥＢＶ阳性和阴性表达的病例中两组间的差异无显著性（尸＝Ｏ．７７１＞Ｏ．０５），ｐ１６蛋白在ＥＢＶ阳性和阴性表达的病例中两组间的差异无显著性（Ｐ－－０．６４９＞０．０５）。&&&&结论：１．ＥＢＶ表达增加随子宫颈病变恶性程度的增高而增加，与ＣＳＣＣ组织学分级及临床分期无关，提示ＥＢＶ在ＣＳＣＣ的发生、发展过程中起～定的作用。&&&&２．ＥＢＶ在子宫颈鳞状细胞癌变的过程中可能不是导致ｐ１６基因甲基化的原因，ｐ１６基因甲基化是通过其它途径引发子宫颈鳞状细胞癌变。&&&&３．ｐ１６蛋白表达缺失与ＣＳＣＣ无明显关系，相反其表达增加与之有密切关系，这表明在ＣＳＣＣ中，ｐ１６基因可能是一个具有抑癌和致癌双向作用的基因。&&&&４．ｐ１６基因甲基化在ＣＳＣＣ中是频发事件，并且随着子宫颈病变恶性程度的增高而发生率升高，表明甲基化事件的发生在ＣＳＣＣ的发生、发展过程中起一定作用。&&&& 关键词：子宫颈肿瘤；ＥＢＶ；甲基化ｐ１６；ＭＳＰＣＲ：免疫组化；组织芯片 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ?－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｐ１６ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ Ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ Ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｒｖｉｘ Ｕｔｅｒｉ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ―Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓｃｅｒｖｉｘ ｎｅｏｐｌａｓｍ，ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＥＢＶ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＥＢＶ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｒｉｓｋ ｉｎ ＣＩＮ．Ｗｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ １ ６ ｇｅｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｅｒｖｉｃａｌｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ―ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｄｚｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＭＳＰＣＲ）ａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：１．８２ Ｃａｓｅｓ ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｕｚｈｏｕ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｌｌｅｇｅ ｆｒｏｍ Ｊａｎｕａｒｙ ｔｏ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２００５，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ２９ ｃａｓｅｓ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ｃ ｓｃｃ），４０ Ｃａｓｅｓｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ（ＣｒＮ３，ａｎｄ １３ ｃａｓｅｓ ｎｏｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｒｖｉｃｅｓ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ―ｇｒａｄｉｎｇ：２０ ＣＩＮ Ｉ～ＩＩ，２０ ｃｉＮｍ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｗ ｃｌｉｎｉｃａｌｓｔａｇｅ（ｓｃ）ｍｅｔｈｏｄ ｂｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ（ＦＩＧＯ，２００２），１ ４ ｃａｓｅｓ ｏｆ Ｉ ｓｔａｇｉｎｇ，１ ５ ｃａｓｅｓ ｏｆ ＩＩ ａｎｄ ＲＩ ｓｔａｇｉｎｇ．２．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＥＢＶ ａｎｄ ｐ １ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅｍｅｔｈｏｄ（ＳＰ）ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＴＭＡ）ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｅｒｖｉｃａｌｔｉｓｓｕｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｎｏｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｒｖｉｃｅｓ，ＣＩＮ ａｎｄ ＣＳＣＣ（１ ｓａｍｐｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＣｌＮＫＩａｎｄ ＣＳＣＣ ＩＩ ａｎｄ １１Ｉ ｓｔａｇｉｎｇ ｈａｄ ｒａｋｅｄ ｏｆｆ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆｓｌｉｃｉｎｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，８０ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｉｎ ｆａｃｔ）．３．Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｐ１ ６ ｇｅｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＭＳＰＣＲ．４．Ｔｈｅ ４ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＳＰＳＳ（Ｖ．１ ２）ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ．Ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ Ｔｅｓｔａｎｄ Ｆｉｓｈｅｒｓ ｅｘａｃｔ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ２ ｇｒｏｕｐｓ，ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｔｏ ｈａｖｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｆｏｒ Ｐ＜０．０５．Ｒｅｓｕｌｔｓ：１．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ＥＢＶ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｎｏｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｒｖｉｃｅｓ，ＣＩＮ ａｎｄ ＣＳＣＣ ｗｅｒｅ １５．３８％（２／１３），５ １．２８％（２０／３９），６７．８６％（１ ９／２８），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ＥＢＶ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＢＶ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｍａｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｒｖｉｃｅｓ ａｎｄ ＣＩＮ‖＝５．１４７，Ｐ＝０．０２３＜０．０５），ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＢＶ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｒｍｅｏｐｌａｓｔｉｃｃｅｒｖｉｃｅｓ ａｎｄ ＣＳＣＣ Ｃ－－９．７８４，Ｐ＝０．００２＜０．０５）．Ｔｈｅｒｅ ＷａＳ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＩＮ，ＣＳＣＣ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ―ｇｒａｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｅ．２．Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｐ １ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｒｖｉｃｅｓ，ＣＩＮ ａｎｄＣＳＣＣ ｗｅｒｅ ７．６９％（１１１３），６４．１０％（２５／３９），７８．５７％（２２／２８），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｐ １ ６ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｆｉ ｏｆ ｐ １ ６ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｒｖｉｃｅｓ ａｎｄ ＣＩＮ０（２＝１２．４１，Ｐ＝－Ｏ．０００＜０．０５），ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐＩ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｒｖｉｃｅｓ ａｎｄ ＣＳＣＣ（存１ ８．１ １，胆Ｏ．０００＜０．０５）．Ｂｕｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＣＩＮ ａｎｄＣＳＣＣ‖２１．６２９，芦ｏ．２０２＞０．０５），Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｐ ｌ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ ＣＩＮ Ｉ～ＩＩ ａｎｄ ＣＩＮＩｌｌ ｗｅｒｅ ４５．００％（９／２０）ａｎｄ ８４．２ １％（１ ６／１ ９），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ ｌ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒｏｕｐｓ‖＝６．５ １ ０，Ｐ＝０．０ １ １＜０．０５）。&&&&Ｔｈｅｒｅ Ｗａｓ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＣＳＣＣｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ－ｇｒａｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｅ．３．Ｔｈｅ ｏｂｊ ｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐ １ ６一Ｍ ａｎｄ 气 ａｎｄ １ ５ １ｂｐ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｐ１ ６一Ｕ ｗｅｒｅ １ ５０ｂｐ ｂｙａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＡＧＥ），ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｔｗｏ ｂｒｉｇｈｔ ａｎｄ ｌｉｍｐｉｄ ｓｔｒａｐｓｗｅｒｅ ｓｅｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ｔｏ ｐ １ ６一Ｍ ａｎｄ ｐ １ ６一Ｕ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｏｒ ｏｎｌｙ ｓｅｅｎ ｐ １ ６－Ｍ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔ．Ｔｈｅｒｅ ＷａＳ ｏｎｌｙｓｅｅｎ ｐ １ ６一Ｕ ｂｕｔ ｎｏｔ ｐ １ ６一Ｍ ｆｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｓｕｋ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｐ １ ６ＭＳＰＣＲ ｉｎ ｎｏｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｒｖｉｃｅｓ，ＣＩＮ ａｎｄ ＣＳＣＣ ｗｅｒｅ ０．００％（０／１３），１ ７．９５％（７／３９），２５．００％（７／２８），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｐ １ ６ ＭＳＰＣＲ ＷａＳｉｎｃｒｅａＳｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ １ ６ ＭＳＰＣＲ ｈａｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｏｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｒｖｉｃｅｓ ａｎｄ ＣＳＣＣ Ｃ＝３．９ １ ９，Ｐ＝－０．０４８＜０．０５）．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＣＳＣＣｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ―ｇｒａｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｅ．４．Ｗｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｃｅｒｖｉｘ ｔｉｓｓｕｅ ａｍｏｎｇｔｈｅ ８０ ｃａｓｅｓ，ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ４ １ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＥＢＶ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ １ ４ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＭＳＰＣＲ，ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ４８ ｃａＳｅｓ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐ １ ６ｐ １ ６ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｂｙｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ８ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｐ １ ６ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ２６ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｐ ｌ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ４１ ｃａｓｅｓ ｏｆ ＥＢＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ６ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｐ １ ６ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ２２ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｐ ｌ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ３９ ｃａｓｅｓ ｏｆ ＥＢＶ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅ Ｗａｓ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎ ＥＢＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ＥＢＶ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ（尸＝Ｏ．７７ １＞Ｏ．０５）ｏｎｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐ １ ６ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ＷａＳ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎＥＢＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ＥＢＶ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ俨＝Ｏ．６４９＞０．０５）ｏｎ ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐ１ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ．?Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：１．Ｔｈｅ ６ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＢＶ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌｌｅｓｉｏｎｓ，ｂｕｔ ｉｔ ｈａｓ ｎｏ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉ也ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｒａｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｇｉｎｇｏｆ ＣＳＣＣ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ＥＢＶ ｈａｓ ｐｌａｙ ｃｅｒｔａｉｎ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＣＳＣＣ．２．ＥＢＶ ｉｓ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｎｏｔ ｔｈｅ ｃａｕｓｅ ｆｏｒ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｐ １ ６ ｇｅｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＳＣＣ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐ １ ６ ｇｅｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｓＣＳＣＣ ｂｙ ｏｔｈｅｒ ｗａｙｓ．３．Ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｎｏ ｏｂｖｉｏｕｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐ １ ６ ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ＣＳＣＣ，ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒａｒｙ，ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｃｌｏｓｅ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ ｐ １ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ ＣＳＣＣ，ｗｈｉｃｈ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｔｈａｔ ｐ １ ６ ｇｅｎｅ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｐｌａｙｓ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｉｎ ＣＳＣＣ，ｂｕｔ ｉｔ ｉｓ ｖｅｒｙｐｒｏｂａｂｌｙ ａ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｈａｓ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ－ｗａｙ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｎｄｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．４．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ １ ６ ｇｅｎｅ ｉｓ ａ ｆｆｅｑｕｅｍ ｅｖｅｎｔ ｉｎ ＣＳＣＣ，ａｎｄ ｉｔｓ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｒａｔｅ ｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌｌｅｓｉｏｎｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｍｐｌｉｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｈａｓ ｐｌａｙｉｎｇ ａ ｃｅｒｔａｉｎｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＣＳＣＣ． Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：Ｃｅｒｖｉｘ Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ／Ｅｐｓｔｅｉｎ―Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ／Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐ１ ６／ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ―ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ／Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／Ｔｉｓｓｕｅｍｌｃｒｏａｒｒａｙ ７ ．ｊＬ‘．－－■―－ 刖 吾 子宫颈癌是全球女性恶性肿瘤中发病率仅次于乳腺癌和肺癌居第三位的常见肿瘤，在发展中国家女性中发病率居第一位。&&&&据世界卫生组织统计 （Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ），８０年代全世界每年子宫颈癌新发病例约为４５．９４万。&&&&我国每年子宫颈癌有１３．１５万，约占全球新发病例的ｌ／３，每年死亡约５．３万人，死亡率平均为１４．６／１０万，居世晃子宫颈癌死亡率最高国家的第二位‘１１。&&&&尽管子宫颈细胞学检查在子宫颈癌的筛查中广泛应用，使子宫颈癌的发病得到了有效控制，但其发病率和死亡率仍居高不下，且发病有年轻化的趋势【２】。&&&&因此，子宫颈癌的病因及发病机制的研究受到国内外学者的高度重视。&&&& 子宫颈上皮内瘤变（Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，ＣＩＮ）是一组与子宫颈鳞状细胞癌（Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＣＳＣＣ）密切相关的癌前病变的统称，它包括不典型增生（Ａｔｙｐｉｃａｌ Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）和子宫颈原位癌（Ｃａｒｃｍｏｍａ ｉｎ Ｓｉｔｕ），反映了子宫颈鳞状细胞癌变发生、发展中连续的过程，即由ＣＩＮ（Ｉ级、ＩＩ级、Ⅲ级）＿原位癌＿早期浸润癌＿浸润癌的一系列病理变化过程中重要的早期病变。&&&& 随着肿瘤遗传学和分子生物学的迅猛发展，人们已逐渐认识到肿瘤的发生是多因素相互作用的结果，其中癌基因（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）的激活（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）和抑癌基因（Ａｎｔｉ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ）的失活（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）是细胞癌变的重要分子基础。&&&&目前已经发现１００多种癌基因和２０余种抑癌基因。&&&&ｐ１６基因是１９９３年正式发现的肿瘤抑制基因（Ｔｕｍｏｒ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｇｅｎｅ），又称多肿瘤抑制因子（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｆａｃｔｏｒ，ＭＴＳｌ），定位于人类染色体９ｐ２１的甲基嘌呤磷酸酶和ａ．干扰素（ａ．ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）两个基因位点之间，由２个内含子（Ｉｎｔｒｏｎ）和３个外显子（Ｅｘｔｒｏｎ）组成，全长８．５Ｋｂ，编码１４ＫＤ，含１４８个氨基酸（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）。&&&&ｐ１６是细胞周期素依赖性激酶４（Ｃｅｌｌ ＣｙｃｌｉｎＤｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｋｉｎａｓｅ ４，ＣＤｋ）的特异性因子，故ｐ１６又被称为ｐ１６ＩＮＫ４。&&&&因其蛋白的Ｎ末端含有Ｃｙｃｌｉｎｂｏｘ同源序列，所以ｐ１６可与Ｃｙｃｌｉｎ １３４结合，促使ＣＤＫ４失活，阻止ＣＤＫ４／Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ复合物的形成，从而抑制细胞由Ｇｌ期向Ｓ期转化。&&&&对细胞周期（Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ）起负性调节（Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）作用，抑制肿瘤细胞的分裂。&&&&ＤＮＡ异常有多种方式，除常见的缺失 （Ａｂｓｅｎｃｅ）、突变（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）（点突变（Ｐｏｉｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎ）、移位突变（ＳｈｉｆｔＭｕｔａｔｉｏｎ）、无义突变（Ｎｏｎｓｅｎｓｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ）、错义突变（Ｍｉｓｓｅｎｓｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ））外，还有一种重要的畸变方式――甲基化（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）。&&&&甲基化一般发生在ＤＮＡ ５’起始区或调节区ＣｐＧ岛（Ｃｙｔｉｄｙｌｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＧｕａｎｏｓｉｎｅＩｓｌａｎｄ），一般认为抑癌基因甲基化后不能正常转录翻译出抑癌蛋白，无法发挥抑癌作用，细胞即可癌变。&&&&正常体细胞抑癌基因ｃｐＧ岛呈非甲基化状态，而在肿瘤形成过程中可观察到广泛的抑癌基因ＣｐＧ岛甲基化。&&&&导致甲基化的因素至今未明，但局部ＤＮＡ结构异常，重金属射线照射是唯一已知的原因。&&&&研究表明ｐ１６基因甲基化在ＣＳＣＣ的发生中起关键作用【王４１。&&&&近年来ＤＮＡ甲基化与癌变的关系逐渐成为又一研究热点。&&&& 船病毒（Ｅｐｓｔｅｉｎ―Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）是１９６４年Ｅｐｓｔｅｉｎ和Ｂａｒｒ在研究非洲儿童的恶性淋巴瘤的病因时，从瘤细胞培养中发现的一种新病毒，属疱疹病毒科丫亚科中唯一能引起人类感染的淋巴滤泡病毒。&&&&目前发现在人群中流行的ＥＢＶ可分为两个亚型，亚型１与亚型２间的区别仅限于个别基因的不同，正是由于这些亚型特异性基因的存在，导致了两个不同亚型病毒在遗传学上的差异。&&&&ＥＢＶ具有嗜Ｂ淋巴细胞的特性，能够在Ｂ淋巴细胞中建立起隐性感染，刺激细胞的增生和转化。&&&&现已证明ＥＢＶ与伯基特淋巴瘤（Ｂｕｒｋｉｔｔ－ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、胃癌及未分化的鼻咽癌【５】等多种人类肿瘤的发生关系密切。&&&&人类是ＥＢＶ的自然宿主，ＥＢＶ首次进入细胞后，在Ｂ细胞中可引起三种形式的感染〔６１：裂解性感染（Ｌｙｔｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、缺损性感染 （Ｄｅｆｅｃｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、隐性感染（Ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（潜伏感染一引起细胞转化＿恶性转化）。&&&&这种潜伏状态的ＥＢＶ ＤＮＡ，在适当的环境条件下能整合宿主基因进而发挥致癌效应。&&&& 人乳头状瘤病毒（Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ，Ｉ－ＩＰＶ）感染与ＣＳＣＣ发病关系已被公认，ＨＰＶ阳性者比ＨＰＶ阴性者侵害子宫颈鳞状上皮导致细胞表达更多的ｐ１６蛋白，这种关系现在已被作为代表ＨＰＶ感染的生物学标记。&&&&基于在ＣＳＣＣ和ＣＩＮ组织中存在较高的ＥＢＶ感染率，ＥＢＶ在子宫颈的致癌作用中被提议作为另一种致癌病毒，由此引发了许多争议【７一。&&&&大量研究证明ＣＳＣＣ显示高水平的ＥＢＶ感染率‘９，１０１，ＥＢＶ在子宫颈鳞状细胞癌变过程中的辅助作用不能除外，在子宫颈的致瘤作用中ＥＢＶ存在直接或间接的影响。&&&&考虑到肿瘤如胃癌和鼻咽癌，它们是已知与ＥＢＶ致瘤作用相关的肿瘤，已被鉴定出高频ｐ１６甲基化【ｌｌ’１２】，因此在ＥＢＶ和ｐ１６之间存在亲缘关系（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）。&&&&近几年来国外对ＥＢＶ感染导致ＣＳＣＣ的报道较少，对其确切的机制尚未阐明。&&&&但对ｐ１６异常甲基化导致多种肿瘤的报道较多，如ｐ１６异常甲基化导致肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌掣１３，１４，１５１，对其机制的研究有待于进一步完善。&&&& 随着社会的发展，性开放、性自由观念的影响，年轻女性子宫颈癌的发病率有增高趋势，这就成为防治子宫颈癌的新动向，而其中子宫颈癌的早期诊断又是防治的重要策略之一。&&&&如何在癌前病变人群中发现癌变的高危个体，对开展针对性较强的重点预防，降低子宫颈癌的发病率和死亡率，具有重要的意义。&&&&ｐ１６基因的失活和ＥＢＶ感染与ＣＳＣＣ的发生密切相关，这两者有可能提供这方面的依据。&&&& 本实验应用甲基化特异性聚合酶链反应（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．ＳｐｅｃｉｆｉｃＰｏｌｙｍｅｒｉｚｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＭＳＰＣＲ）对正常子宫颈鳞状上皮组织、ＣＩＮ以及ＣＳＣＣ组织中ｐ１６基因甲基化进行定性检测，应用免疫组化方法对ｐ１６蛋白和ＥＢＶ感染情况进行研究，以探讨ＥＢＶ感染和ｐ１６基因甲基化之间是否存在协同作用，这可能是ＣＳＣＣ发生的又一机制。&&&&同时也为临床早期发现ＣＳＣＣ及判断ＣＩＮ恶性潜能提供线索和依据，又可为进一步的研究工作奠定基础，如探讨ＥＢＶ如何参与基因失活机制等。&&&& 材料与方法 １ 标本来源 收集泸州医学院附属医院病理科２００５年１月～１ １月存档的子宫颈病变的石蜡标本和相应的临床病理资料，包括ＣＳＣＣ组织２９例，ＣＩＮ组织４０例及正常子宫颈鳞状上皮组织１３例。&&&&组织病理学分级：ＣＩＮ Ｉ～ＩＩ级２０例，ＣＩＮＩＩＩ级２０例。&&&&临床分期按２００２年ＦＩＧＯ公布的新分期方法【１６】： Ｉ期１４例，ＩＩ、Ⅲ期１５例。&&&&入选病历最小年龄２１岁，最大年龄６８岁，平均４３．２５岁。&&&&所有病例在取材前均未接受放射、化学药物、激素、中药等治疗。&&&&２组织芯片和免疫组化实验２．１主要实验试剂（１）采用链霉亲和素一一过氧化物酶染色法（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ Ｍｅｔｈｏｄ，ＳＰ法）：即用型鼠抗人ｐ１６单克隆抗体（产品编号：ＭＡＢ．０２２３； 克隆号：ＺＪｌｌ；稀释度１：１００），即用型鼠抗人ＥＢＶ单克隆抗体（潜 伏膜蛋白１（Ｌａｔｅｎｃｙ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＭＰｌ），产品编号：ＭＡＢ．００６３； 克隆号：ＣＳｌ―４；稀释度ｌ：１００），山羊抗鼠、山羊抗兔免疫组织化学 ｓＰ检测试剂盒（购自北京中杉生物技术有限公司）。&&&&（２）粘片剂：多聚一Ｌ一赖氨酸（Ｐｏｌｙ―Ｌ―Ｌｙｓｉｎｅ）（购自北京中杉生物技术有 限公司）。&&&&（３）Ｏ．１Ｍ鳞酸盐缓冲液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＰＢＳ）（ｐＨ７．２～７．４， 配法：１０００ｍｌ双蒸水加ＮａＣｌ ９９，Ｎａ２Ｉ－ＩＰ０４?１２１－１２０ ６９，ＮａＨ２Ｐ０４?２Ｈ２０ ０．４９）。&&&&（４）０．０１Ｍ枸橼酸盐缓冲液（Ｃｉｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ）（配法：１０００ｍｌ双蒸水加 １２ Ｃ６Ｉ－１５Ｎａ３０７‘２Ｈ２０ ３９，Ｃ６Ｈ８０７ Ｈ２０ ０．４９）。&&&&（５）ＤＡＢ显色试剂盒（购自北京中杉生物技术有限公司）。&&&&（６）中性树胶封片剂（购自博士德公司）。&&&&２．２主要实验仪器（１）组织芯片制备仪（恒泰ＨＴ－１，朝阳市恒泰科技发展有限责任公司）。&&&&（２）石蜡切片机（ＬｅｉｃａＲＭ２１３５，上海）。&&&&（３）电热恒温鼓风干燥箱（ＤＨＧ．９０７０，上海益恒实验仪器公司）。&&&&（４）自动恒温孵育箱（ＷＨ８９１，重庆）。&&&&（５）酸度计（ＰＨＳ．３Ｃ，成都方舟科技开发公司）。&&&&（６）ＳＡＮＹＯ低温冰箱（ＤＷ－４０Ｌ１３８，无锡中天科学仪器有限公司）。&&&&（７）１０００Ｗ电炉（ＪＺＧ９－０１，武汉）。&&&&（８）显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳＣＨ２０ＢＩＭＦ２００，日本）。&&&&（９）显微摄影仪（ＰＭ－１０Ａ，日本）。&&&&２．３ 实验方法２．３．１组织芯片的制备 组织芯片（Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｅｒｏａｒｒａｙ）制作８２例子宫颈组织，经２名有经验的病理医师再次对目标蜡块的ＨＥ切片作形态学观察，核对病理诊断，确定打孔区域。&&&&应用组织芯片制作仪制备４２（７ｘ６）点列阵的子宫颈芯片两枚，定位点位于芯片的一角，即４２例子宫颈标本组成组织芯片一套。&&&& 步骤：（１）标记病变典型区；（２）用组织芯片仪在空白蜡块上钻孔；（３）钻孔采集病变区组织芯；（４）将织芯转移到空白蜡块相应的孔中组成新的芯片蜡块。&&&&组织芯片连续切片２０张，切片厚约０．４“ｒｎ。&&&&用预先制备的ＡＰＥＳ载玻片捞片后置于６０℃的烤箱中备用。&&&&切片过程中ＣＩＮⅢ级和ＣＳＣＣ ＩＩ、 ⅡＩ期组织各缺失１例，缺失率０．０２４％。&&&&将缺失的病例从实验组中删除， 实际入选病例为８０例。&&&&２．３．２ ＨＥ染色 将其中２张连续切片做ＨＥ染色，核对组织类型及形态学观察（图ｌ、２）。&&&&（１）石蜡切片常规脱蜡至水。&&&&（２）放入苏木素（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）染色１０ｍｉｎ，自来水冲洗５ｍｉｎ。&&&&（３）经盐酸酒精分色ｌｍｉｎ，自来水冲洗５ｍｉｎ。&&&&（４）经饱和碳酸锂返蓝３ｍｉｎ，自来水冲洗５ｍｉｎ。&&&&（５）放入伊红（Ｅｏｓｉｎ）复染３ｍｉｎ。&&&&（６）放入梯度乙醇（７５％、８５％、９５％、１００％）脱水各５ｍｉｎ。&&&&（７）二甲苯透明。&&&&（８）中性树胶封片。&&&&２．３．３免疫组化染色 按ｓＰ试剂盒提供的说明书进行。&&&&（１）石蜡切片常规脱蜡至水。&&&&（２）抗原修复，用装有抗原修复液的高压锅加热至１ ＩＯ’Ｃ以上，持续５ｍｉｎ。&&&&（３）滴加３％Ｈ２０２，消除内源性过氧化物酶活性，室温放置４０ｍｉｎ，ＰＢＳ冲 洗。&&&&（４）自然冷却后加第一抗，４”Ｃ冰箱孵育过夜，ＰＢＳ液冲洗。&&&&（５）滴加辣根过氧化酶（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）标记的第二抗，３７。&&&&Ｃ孵育 ２ｈ，ＰＢＳ液冲洗。&&&&（６）ＤＡＢ显色，室温下２０ｍｉｎ，自来水冲洗３０ｍｉｎ。&&&&（７）苏木素复染，常规脱水透明后中性树胶封片。&&&& ｐ１６、ＥＢＶ用己知表达阳性的ＣＳＣＣ切片作为阳性对照，ＰＢＳ液代替第一抗作为阴性对照。&&&&２．４结果判定 阳性反应为黄色、棕黄色或黄褐色颗粒，ｐ１６阳性颗粒定位于胞核和胞浆。&&&&ＥＢＶ阳性反应颗粒定位于细胞核。&&&&参照Ｓｈｉｎｇｏ等【１刀标准以上皮细胞胞浆或胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达。&&&&每例组织随机计数５００个细胞，阳性细胞数＜２０％记为阴性，≥２０％记为阳性。&&&&３ ＭＳＰＣＲ实验３．１主要仪器 电子分析天平（ＪＡｌ００３Ａ，上海伦捷机电仪表有限公司） 超净工作台（ＳＪ．ＣＪ．２Ｄ，苏州苏洁净化设备有限公司） ＳＡＮＹｏ低温冰箱（ＤＷ．４０Ｌ１３８，无锡中天科学仪器有限公司）。&&&& 德国ＳＩＧＭＡ低温高速离心机（３Ｋ１５，德国） ＰＣＩ滞增仪（９７００型，美国ＡＢ） 可调式微量移液器（Ｏ．１－２．５山；０．５一ｌＯｐｌ；２０―２００ｐ１；２００．１０００“１，深 圳三利化学品有限公司） 紫外分光光度计（ＷＺ．２６Ａ型，天津天光光学仪器） 恒压恒流电泳仪（ＥＰＺ３００，上海） 紫外凝胶成像系统（ＷＦＨ．１０１型，上海精科实业有限公司）３．２试剂 基因组聊妣提取纯化试剂盒.
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