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RT-PCR引物设计求助
我设计过两次RT-PCR引物，第一次用的是primer premier 5.0 设计的引物，用的软件自带的搜索引物功能，然后参照Tm，GC含量（选取45%-60%之间Tm值相近的作为引物）以及还有dimer&&hairpin，false priming，选取自认为最优组合，然后发给公司合成回来之后，先用easy taq 酶体系跑普通pcr，凝胶检测结果条带比较暗，然后又用RT-PCR检测了一次，无数据出现，电泳检测，也没有目的条带出现
第二次设计RT-PCR是用NCBI网站来设计的，直接在上面输入CDS序列，搜索引物，然后按照上面搜过结果，选取成对的引物，Tm值在60+-3 大都很相近& &,然后引物自身的dimer（NTI检测，约2~5个），偶尔有发夹结构存在， 直接送公司合成回来后，直接用的RT-PCR检测，也无条带出现
已确定cDNA无问题，RT-PCR试剂盒为&&快精（英文名字好像是QIjin还是什么的，公司当初取名快精还被笑称过猪饲料）
引物长度为20~22左右，经过NCBI与目的材料全基因组比对之后，除了目的染色体上面引物全部匹配外，还有其他染色体约7~8个，是14~16个碱基连续匹配的，我有一个疑问，就是按照这个匹配度来说，RT-PCR是不是至少会有带出现，不会出现无数据的情况吧、？
还有一个就是RT-PCR引物设计问题，小白一个，初次接触这个，真心不懂，设计了两次之后，都没效果，不知道该咋办了，真心求助！！！
GC含量还好，没那么高，初次判断可能还是引物有问题，一次性设计了六对引物，一个都没有条带，反向引物可能有点问题，等这次反向引物回来了，验证一下就知道什么情况了，谢谢你哈
自己设计引物，然后送公司合成
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RT-PCR引物设计原则和方法
来源：生物帮
作者：生物帮
责任编辑：wlladmin
摘要：RT-PCR引物设计原则和方法
在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。
此窗口可以链接到&引物搜索&、&引物编辑&以及&搜索结果&选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择&PCR primers&，&Pairs&，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp。
点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在&引物窗口&中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3&端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3&不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为&None&为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5。
在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。
在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3&端的Delta G。3&端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3&端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。
Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。
Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之间。
第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使错误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
Analyze中，有参考价值的最后一项是&PCR&，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。
引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。
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单位名称：可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的
条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组
织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）
从这两种组织中提取的rna的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这
有关呢？ 请高手指教！
1.rt-pcr有两种做法：
条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再pcr。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比
较利于pcr的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。
2.rt-pcr应具备的条件
高质量的rna（保留后可做5‘，3’race）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量
的话还应考虑rna的浓度或是cdna的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将
rna的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
我做过race（3’race是宝生物的kit；5‘race是gibico），但现在再进行另一个同源
基因的3‘race时却怎么也p不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已
经获得了全序列（race的方法），而另一个基因的3’utr却增么也扩不出来，我推测是不是
该基因的3‘utr太长的缘故，我都快绿了，有无
rt-pcr的常用内标b－actin 和gapdh的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺
有关内参：
rt-pcr内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引
物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。
问：我曾经作过同一管的pcr，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带
但图片质量不理想（而且酶量、mg2+加倍）。请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的pcr
的各成分的浓度？
答： it should determined the amount of rna. but it not for the quantitity of
the pcr. it just was convienent to guess the amount ot the template&(for rt and
pcr) and bettrer for publication and editor
if he don not know the preocedure much. but the amount just using accurate piptte
is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene
everytime.
在同一管中做rt，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，
（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多
贴子里应该都谈到了。mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。
关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必
要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，
所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。
有关内参的建议：
一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的
电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，
再说一边我得观点，1、半定量和定量rt-pcr做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，
除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量rt-pcr
本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量rt-pcr应
该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，gc含量相似，或者实在
穷的要省pcr管和taq。
关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是
相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这
个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知
道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中
一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选
线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你
一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在 *** 帖过。
关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据
要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组pcr）、长度小于500bp－600bp
引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。
我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。
我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，
还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？
18s的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能
用总rna为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说gapdh这个破烂了。18s
除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，
我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概
括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。更
不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。
pe有专门的用于实时pcr的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，
不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。
正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针
还没有完，当初和成了一堆。
有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？
原位杂交最好用rna做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保
证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。
我觉得做rt-pcr的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描
述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆
的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：
做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
记得我开始我的ｒｔ－
pcr时，按常规方法，提取总ｒｎａ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变
反应条件，进行了ｎ次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的pcr的片断位于我们实验另一
位同学克隆的片断当中，而该同学已经用rt-pcr克隆出她的片断（尽管她用这些ｒｔ－ｐｃ
ｒ产物做模版再进行ｐｃｒ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增
出她的片断，然后用她的ｒｔ－ｐｃｒ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随
机引物），用我的引进物进行一般pcr，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这
个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重
要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制
1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上
的tm值吗？
2 pcr时20微升体系中cdna应加多少比较合适？mgcl2应加多少？各个成分的量有无确
3 pcr结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cdna的量少有关吗？
mg离子太多是否会抑制taqase的活性？
一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可
20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,
但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.
如果内参照有,目的没有,至少证明不是美丽惹的祸.原因书里应该都说了.
在所有rna实验中，最关键的因素是分离得到全长的rna。而实验失败的主要原因是核
糖核酸酶（rna酶）的污染。由于rna酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而
rna制剂中只要存在少量的rna酶就会引起rna在制备与分析过程中的降解，而所制备的rna
的纯度和完整性又可直接影响rna分析的结果，所以rna的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性rna酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性
的rna酶。rna酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
外源性的rna酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物
学实验中使用的rna酶也会造成污染。这些外源性的rna酶可污染器械、玻璃制品、塑料制
品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的rna酶。
一、 防止rna酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% depc水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，
故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% h2o2
室温10min，然后用0.1% depc水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% depc，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去
残留的depc。不能高压灭菌的试剂，应当用depc处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm
滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置rna操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的rna酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯（depc）：是一种强烈但不彻底的rna酶抑制剂。它通过和rna酶的活
性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的rna酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使rna
酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对rna酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和rna酶结合形成过渡
态类物质，几乎能完全抑制rna酶的活性。
4. rna酶的蛋白抑制剂（rnasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。rnasin
是rna酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种rna酶结合，使其失活。
5. 其它：sds、尿素、硅藻土等对rna酶也有一定抑制作用。
mrna的分离与纯化
真核细胞的mrna分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7g）和3’端的poly(a)
尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mrna的3’端存在20-30个腺苷酸组成的poly（a）尾，通
常用poly（a+）表示。这种结构为真核mrna的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚
（dt）纤维素或寡聚（u）琼脂糖亲合层析分离纯化mrna的理论基础就在于此。
mrna的分离方法较多，其中以寡聚（dt）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。
此法利用mrna 3’末端含有poly（a+）的特点，在rna流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐
缓冲液的作用下，mrna被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水
的情况下，mrna被洗脱，经过两次寡聚（dt）纤维柱后，即可得到较高纯度的mrna。
寡聚(dt)纤维素柱纯化mrna
一、试剂准备
1．3m醋酸钠（ph 5.2）
2．0.1m naoh
3．1×上样缓冲液：20mm tris-hcl(ph 7.6)；0.5m nacl；1m edta（ph 8.0）；0.1%sls(十
二烷基氨酸钠。配制时可先配制tris-hcl(ph 7.6)、nacl、edta（ph 8.0）的母液，经高压
消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）
的10%sls至终浓度为0.1%。
4．洗脱缓冲液：10mm tris-hcl(ph 7.6)；1mm edta(ph 8.0)；0.05% sds
5．无水乙醇、70%乙醇
二、操作步骤
1．将0.5-1.0g寡聚（dt）-纤维悬浮于0.1m的naoh溶液中。
2．用depc处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dt）-纤维素装柱0.5-1ml，用3
倍柱床体积的depc h2o洗柱。
3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液ph值小于8.0。
4．将rna溶解于depc h2o中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×
上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当rna上样液全部进入柱床后，再用1×上样
缓冲液洗柱，继续收集流出液。
5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。
6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，od260测定rna含量。
前部分收集管中流出液的od260值很高，其内含物为无poly(a)尾的rna。后部分收集管中流
出液的od260值很低或无吸收。
7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱poly(a+)rna，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体
8．od260测定poly(a+)rna分布，合并含poly(a+)rna的收集管，加入1/10体积3m naac
（ph5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。
9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时
poly(a+)rna的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。
10. 用适量的depc h2o溶解rna。
三、注意事项
1．整个实验过程必须防止rnase的污染。
2．步骤（4）中将rna溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是
破坏rna的二级结构，尤其是mrna poly(a+)尾处的二级结构，使poly(a+)尾充分暴露，从
而提高poly(a+)rna的回收率；另一个目的是能解离mrna与rrna的结合，否则会导致rrna
的污染。所以此步骤不能省略。
3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃
最好用licl替代nacl。
4．寡聚（dt）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用naoh、灭菌 ddh2o、
上样缓冲液洗柱。细胞库/细胞培养
ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
RT-PCR实验方法总结大全
RT-PCR实验方法总结大全
来源：丁香园论坛
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RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。3.RACE我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。有关内参：RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template&(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using &accurate piptte& is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。有关内参的建议：一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在 *** 帖过。关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？18s的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。18s除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问：1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.如果内参照有,目的没有,至少证明不是&美丽惹&的祸.原因书里应该都说了.在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。一、 防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA一、试剂准备1．3M醋酸钠（pH 5.2）2．0.1M NaOH3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS5．无水乙醇、70%乙醇6．DEPC二、操作步骤1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。8．OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。三、注意事项1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2． 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7． 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。一、试剂准备1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。2. 杂交缓冲液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml二、操作步骤1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。（1）设计含T7启动子的PCR引物由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：上游引物下游引物Ⅱ T7 启动子序列下游引物Ⅰ（2）PCR先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。（3）探针合成标记与纯化在0.5ml 离心管中加入下列试剂：RNasin （40U/μl） 0.5μlGACU POOL GAC（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μlDTT (二硫苏糖醇，0.1M) 1μl5×转录 buffer 2μl模板（50ng/μl） 1μlT7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl混合后，短暂离心，37OC保温1hr。加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。加入：饱和酚 50μl氯仿 50μl酵母tRNA（2μg/μl） 4μlDEPC H2O 100μl室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。2．杂交（1） RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。（2）取8μl RNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。（2） 80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。3. 消化(1) 杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 OC保温10min。(3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。(4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g×10min。(5) 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。4、电泳与放射自显影（1）配制凝胶：(50ml)40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1） 6.25ml5×TBE 10ml尿素 24g加H2O至50ml溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。（2）预电泳以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。（3）加样将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。（3） 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。三、注意事项1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。　可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了第二次的引物设计要求可以低一点以50μl体系为例引物各1μl第一次PCR产物5μl二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应，以期增加产物的量我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:100稀释后测OD260和OD280,后根据公式:RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.luoyu10 wrote:各位大哥：我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？最低到1.8，最好2.0，我感觉稍微低一点影响不算太大。问：我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想请教引物如何设计？好的引物所具有的令人满意的特点：* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。* 选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。* 设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。* 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。* 避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。* 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。【经验】如何确认RNA的质量各位都知道，提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多思考啊！以下两种方法，相信大家都知道的：1）检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是&2.2的）。当R&1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R&2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNA的A260/A280的比值为2.0。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。2）RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的（见下图）。以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。3）保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰，那么你的实验应该是很难失败了！
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