具有二级酰胺酶活性的酶及其应用方法
专利名称具有二级酰胺酶活性的酶及其应用方法
技术领域本发明一般地涉及分子和细胞生物学和生物化学。本发明提供了 酰胺酶、编码该酰胺酶的多聚核苷酸、这些多聚核苷酸和多肽的应用，
并且， 一方面，本发明提供了具有二级酰胺酶(secondary amidase)活 性例如具有酰胺水解活性的酶，包括具有肽酶、蛋白酶和/或乙内酰脲 酶活性的酶。在别的方面，本发明的酶可以用于加工食品，例如，增 强食品风味(例如，酶催熟奶酪)、促进杀灭细菌和真菌、精细化学 中间物的修饰和去保护、合成肽键、进行手性拆分、水解头孢菌素C。 本发明的酶可以用于产生7-氨基头孢烷酸(7-ACA)和半合成的头孢 菌素抗生素，包括头孢噻吩、头孢噻啶和头孢呋辛。本发明的酶可以 用作抗微生物试剂，例如，细胞壁水解剂。
背景技术二级酰胺酶包括许多有用的酶，包括肽酶、蛋白酶和乙内酰脲酶。 此类酶可以用于一定范围的商业应用。例如，二级酰胺酶可以用于1) 增强食品风味，特别是奶酪(称之为酶催熟奶酪)；2)促进杀灭细菌 和真菌；3)精细化学中间物的修饰和去保护；4)合成肽键；5)进行 手性拆分。特别地，在本领域内需要一种能够水解头孢菌素C的酶。 头孢菌素C是头孢菌素生物合成途径的发酵产物，虽然作为抗生素本 身，头孢菌素C表现出一些抗革兰氏阴性微生物的活性，但是头孢菌 素C的主要商业用途是作为别的类似于头孢菌素的抗生素的构建基 础。例如，可以除去D-a-氨基己二酰侧链，产生7-氨基头孢烷酸
(7-ACA)， 7-ACA是多种半合成的头孢菌素抗生素，包括头孢噻吩、 头孢噻啶和头孢呋辛，的前体。
半合成的头孢菌素属于最广泛使用的抗生素。这些抗生素从7-氨 基头孢烷酸(7-ACA)开始合成，7-氨基头孢烷酸是通过头孢菌素C
(Ceph C)脱酰基作用获得的一种化合物。传统上是使用化学工艺进 行脱酰基作用。然而，化学工艺涉及使用许多有毒化合物，产生许多代价大的化学废物。因此，从Ceph C产生7-ACA的酶促途径是非常 吸引人的。目前，从CephC酶促产生7-ACA是应用一种双酶工艺(图 7)完成的。第一种酶，D-氨基酸氧化酶，用于把Ceph C氧化为酮酸 中间产物，然后该酮酸中间产物被过氧化氢脱羧，产生戊二酰-7-ACA。 然后戊二酰-7-ACA通过第二种酶，戊二酰-7-ACA酰基转移酶的作用 脱酰基形成7-ACA。虽然一些戊二酰-7-ACA酰基转移酶可以直接把 Ceph C转化为7-ACA，但是它们效率很低。虽然如此，对Ceph C具 有可测量出的活性的戊二酰-7-ACA酰基转移酶可以归类为头孢菌素C 酰基转移酶。
对二级酰胺酶的寻找由于缺少适于高通量筛选的底物/分析组合而 受到限制。以前的研究努力所使用的底物或分析存在着低通量、缺乏 灵敏度和/或缺少特异性的不足。
在此被讨论的出版物仅仅是提供了它们的公开内容，这些公开是 在本申请的申请日之前。在此并不承认，本发明一定不具相对于在先 发明的公开内容占先的资格。
本发明提供具有酰胺酶活性的多肽，例如具有肽酶、蛋白酶和/或 乙内酰脲酶活性的酶，这里的酰胺酶活性包括二级酰胺酶活性，例如 催化酰胺的水解。在可供选择的方面，本发明的酶可以用于加工食品， 例如，增强食品风味(例如，酶促熟奶酪)、促进杀灭细菌和真菌、 精细化学中间物的修饰和去保护、合成肽键、进行手性拆分、水解头 孢菌素C。本发明的酶可以用于产生7-氨基头孢烷酸(7-ACA)和半 合成的头孢菌素抗生素，包括头孢噻啶、头孢噻啶和头孢呋辛。本发 明的酶可以用作抗微生物试剂，例如，作为细胞壁水解剂。
本发明提供分离的或重组的核酸，其包含的核酸序列在至少大约 100个残基的范围内，与SEQIDNO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQID NO:15， SEQIDNO:17， SEQIDNO:19， SEQIDNO:21， SEQIDNO:23, SEQIDNO:25， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:39， SEQ IDNO:41， SEQIDNO:43， SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:47， SEQ IDNO:49, SEQIDNO:51， SEQ IDNO:53， SEQ IDNO:59， SEQ IDNO:61， SEQIDNO:63， SEQIDNO:65， SEQIDNO:67， SEQIDNO:69， SEQ IDNO:71, SEQIDNO:75， SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQ ID NO:81， SEQIDNO:83, SEQIDNO:85， SEQIDNO:87， SEQ IDNO:91， SEQIDNO:93， SEQIDNO:95， SEQIDNO:97， SEQIDNO:101， SEQ ID NO: 103， SEQ ID NO: 105， SEQ ID NO: 107， SEQ ID NO: 109， SEQ IDNO:lll具有至少50%序列一致性(identity)，与SEQIDNO:35， SEQIDNO:73， SEQIDNO:89， SEQ IDNO:113具有至少55%序列一 致性，与SEQIDNO:27， SEQIDNO:29， SEQ ID NO:57具有至少60 %序列一致性，与SEQ ID NO:99具有至少65 %序列一致性，与SEQ ID NO:55具有至少90%序列一致性，与SEQ ID NO:37具有至少99%序 列一致性，其中该核酸编码至少一种具有酰胺酶活性的多肽，所述的 序列一致性通过应用序列比较算法的分析或通过观察验证(visual inspection)确定。
一方面，所述分离的或重组的核酸包括在至少大约100个残基范 围内，与SEQIDNO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:B， SEQIDNO:15， SEQID NO:17， SEQ ID NO:19， SEQ ID NO:21， SEQ ID NO:23， SEQ ID NO:25， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQIDNO:39， SEQID NO:41 ， SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:47， SEQ ID NO:49, SEQIDNO:51， SEQIDNO:53， SEQIDNO:59， SEQIDNO:61， SEQ IDNO:63， SEQIDNO:65， SEQ ID NO:67， SEQ ID NO:69， SEQ ID NO:71 ， SEQ ID NO:73， SEQ ID NO:75， SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQIDNO:81， SEQIDNO:83， SEQIDNO:85， SEQIDNO:87， SEQ IDNO:89, SEQ ID NO:91， SEQ ID NO:93， SEQ ID NO:95， SEQ ID NO:97， SEQIDNO:101， SEQIDNO:103， SEQIDNO:105， SEQ ID NO:107， SEQIDNO:109， SEQIDNO:lll， SEQ ID NO:113具有至少 55 %序列一致性的核酸序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约100个残基范围内，与SEQID NO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQ ID NO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQ IDNO: 19， SEQ ID NO:21 ， SEQ ID NO:23 ， SEQ ID NO:25， SEQ ID NO:27， SEQ丽0:29， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQ ID NO:39， SEQ ID NO:41, SEQ ID NO: 43， SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:47， SEQIDNO:49， SEQIDNO:51， SEQIDNO:53， SEQIDNO:57， SEQ ID NO:59， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63， SEQ IDNO:65， SEQIDNO:67， SEQIDNO:69， SEQIDNO:71， SEQIDNO:73， SEQIDNO:75， SEQ IDNO:77， SEQ ID NO:79， SEQ ID NO:81， SEQ ID NO:83， SEQ ID NO:85， SEQ ID NO:87， SEQ ID NO:89， SEQ ID NO:91 ， SEQ ID NO:93， SEQIDNO:95， SEQIDNO:97， SEQIDNO:101， SEQIDNO:103， SEQ IDNO:105， SEQIDNO:107， SEQIDNO:109， SEQIDNO:lll ， SEQ IDNO:113具有至少60%序列一致性的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约100个残基范围内，与SEQID NO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQ IDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQ IDNO:15， SEQIDNO:17， SEQIDNO: 19， SEQIDNO:21， SEQIDNO:23， SEQIDNO:25， SEQIDNO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQ IDNO:39， SEQIDNO:41, SEQIDNO:43， SEQIDNO:45， SEQ ID NO:47， SEQIDNO:49， SEQIDNO:51， SEQIDNO:53， SEQIDNO:57， SEQIDNO:59， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63, SEQIDNO:65， SEQ IDNO:67， SEQ ID NO:69， SEQIDNO:71， SEQIDNO:73， SEQ ID NO:75， SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQ ID NO:81 ， SEQ ID NO:83， SEQ ID NO:85， SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93， SEQ ID NO:95， SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99， SEQ ID NO:101， SEQIDNO:103， SEQIDNO: 105， SEQIDNO:107， SEQID NO:脂，SEQIDNO:lll, SEQ ID NO: 113具有至少65%序列一致性 的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约100个残基范围内，与SEQID NO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQ IDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17, SEQ ID NO:19， SEQIDNO:21， SEQIDNO:23， SEQIDNO:25， SEQIDNO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31 ， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQIDNO:39， SEQIDNO:41' SEQIDNO:43， SEQIDNO:45, SEQ ID NO:47， SEQIDNO:49， SEQ IDNO:51， SEQIDNO:53， SEQIDNO:57， SEQIDNO:59， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63， SEQIDNO:65， SEQ IDNO:67， SEQ ID NO:69， SEQIDNO:71， SEQ ID NO:73， SEQ ID NO:75， SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQ ID NO:81， SEQ ID NO:83， SEQ ID NO:85， SEQ ID NO:87， SEQ ID NO:89， SEQ ID NO:91， SEQ ID NO:93， SEQ ID NO:95， SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99， SEQ ID NO:101， SEQ ID NO: 103, SEQIDNO:105, SEQIDNO:107， SEQID NO:109， SEQ ID NO: 111， SEQ ID NO:113具有至少70%序列一致性 的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约100个残基范围内，与SEQ ID NO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQ ID NO: 11 ， SEQ ID NO: 13 ， SEQ ID NO: 15 ， SEQ ID NO: 17 ， SEQ ID NO: 19， SEQIDNO:21， SEQIDNO:23， SEQIDNO:25， SEQIDNO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35, SEQ IDNO:39， SEQIDNO:41， SEQIDNO:43， SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:47， SEQ ID NO:49， SEQ ID NO:51 ， SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:57， SEQIDNO:59， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63， SEQIDNO:65， SEQ IDNO:67， SEQ ID NO:69， SEQIDNO:71， SEQIDNO:73， SEQ ID NO:75， SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQ ID NO:81 ， SEQ ID NO:83， SEQIDNO:85, SEQIDNO:87， SEQIDNO:89， SEQIDNO:91, SEQ IDNO:93, SEQIDNO:95, SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99， SEQ ID NO:101， SEQIDNO:103， SEQIDNO:105， SEQIDNO:107， SEQID NO:109， SEQIDNO:lll， SEQ ID NO:113具有至少75%序列一致性 的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约100个残基范围内，与SEQID NO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQID NO: 19， SEQ ID NO:21 ， SEQ ID NO:23， SEQ ID NO:25， SEQ ID NO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQ IDNO:39， SEQIDNO:41， SEQ ID NO: 43， SEQIDNO:45， SEQIDNO:47， SEQIDNO:49， SEQIDNO:51， SEQIDNO:53， SEQIDNO:57， SEQIDNO:59， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63， SEQIDNO:65, SEQ IDNO:67， SEQ ID NO:69， SEQIDNO:71， SEQIDNO:73， SEQ ID NO:75， SEQIDNO:77， SEQIDNO:79, SEQIDNO:81， SEQIDNO:83， SEQIDNO:85， SEQIDNO:87， SEQIDNO:89, SEQIDNO:91， SEQ IDNO:93， SEQ ID NO:95， SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99， SEQ ID NO:101， SEQIDNO:103， SEQIDNO:105， SEQIDNO:107, SEQID NO:109， SEQIDNO:lll， SEQ ID NO:113具有至少80%序列一致性 的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约100个残基范围内，与SEQID NO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQ ID NO:7， SEQ ID NO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQ ID NO: 19， SEQ ID NO:21 ， SEQ ID NO:23， SEQ ID NO:25， SEQ ID NO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQIDNO:39， SEQIDNO:41， SEQIDNO:43， SEQIDNO:45， SEQ IDNO:47， SEQ ID NO:49， SEQIDNO:51， SEQ ID NO:53， SEQ ID NO:57， SEQ IDNO:59， SEQIDNO:61， SEQ IDNO:63， SEQIDNO:65， SEQIDNO:67， SEQIDNO:69， SEQIDNO:71， SEQIDNO:73， SEQ IDNO:75， SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQIDNO:81， SEQ ID NO:83， SEQ IDNO:85， SEQIDNO:87， SEQ ID NO:89， SEQIDNO:91， SEQIDNO:93， SEQIDNO:95， SEQIDNO:97， SEQIDNO:99， SEQ IDNO:101， SEQIDNO:103， SEQIDNO:105， SEQIDNO:107， SEQ IDNO:109， SEQIDNO:lll， SEQ IDNO: 113具有至少85%序列一致 性的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约100个残基范围内，与SEQID NO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQ ID NO:7， SEQ ID NO:9， SEQIDNO:ll, SEQIDNO:13， SEQIDNO:15, SEQIDNO:17， SEQ ID NO: 19， SEQ ID NO:21 ， SEQ ID NO:23， SEQ ID NO:25， SEQ ID NO:27， SEQ IDNO:29， SEQ ID NO:31， SEQ IDNO:33， SEQIDNO:35， SEQIDNO:39， SEQIDNO:41, SEQIDNO:43， SEQIDNO:45， SEQ IDNO:47， SEQ ID NO:49， SEQIDNO:51， SEQ ID NO:53， SEQ IDNO:55， SEQ ID NO:57， SEQ ID NO:59， SEQ ID NO:61 ， SEQ ID NO:63， SEQIDNO:65， SEQIDNO:67， SEQIDNO:69， SEQIDNO:71， SEQ IDNO:73， SEQIDNO:75, SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81 ， SEQ ID NO:83， SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87， SEQ ID NO:89, SEQIDNO:91， SEQIDNO:93， SEQIDNO:95， SEQIDNO:97， SEQ IDNO:99， SEQIDNO:101， SEQ ID NO: 103， SEQIDNO:105， SEQ ID NO: 107， SEQ ID NO: 109， SEQ ID NO: 111， SEQ ID NO:113具有至少 90%序列一致性的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约100个残基范围内，与SEQ ID NO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQ IDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQIDNO: 19， SEQIDNO:21， SEQIDNO:23， SEQIDNO:25, SEQIDNO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQ IDNO:39， SEQIDNO:41, SEQIDNO:43， SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:47， SEQIDNO:49， SEQIDNO:51, SEQ IDNO:53， SEQIDNO:55， SEQIDNO:57， SEQIDNO:59， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63， SEQ IDNO:65， SEQIDNO:67， SEQ ID NO:69， SEQIDNO:71， SEQ ID NO:73， SEQ ID NO:75， SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQ ID NO:81 ， SEQIDNO:83， SEQIDNO:85, SEQIDNO:87， SEQIDNO:89， SEQ IDNO:91， SEQIDNO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99， SEQIDNO:101， SEQIDNO:103， SEQIDNO:105， SEQ ID NO:107， SEQIDNO:109， SEQIDNO:lll， SEQ ID NO:113具有至少 95%序列一致性的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约100个残基范围内，与SEQID NO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQ ID NO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQ ID NO: 19， SEQIDNO:21， SEQIDNO:23， SEQIDNO:25， SEQ ID NO:27， SEQ IDNO:29， SEQ IDNO:31, SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQIDNO:37， SEQIDNO:39， SEQIDNO:41， SEQIDNO:43， SEQ IDNO:45， SEQIDNO:47， SEQ ID NO:49， SEQIDNO:51， SEQ ID NO:53， SEQIDNO:55， SEQIDNO:57， SEQIDNO:59， SEQ IDNO:61，SEQIDNO:63， SEQIDNO:65， SEQIDNO:67， SEQIDNO:69， SEQ IDNO:71， SEQIDNO:73， SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQIDNO:81, SEQIDNO:83, SEQIDNO:85, SEQIDNO:87, SEQIDNO:89， SEQIDNO:91， SEQIDNO:93, SEQIDNO:95， SEQ IDNO:97， SEQIDNO:99， SEQIDNO:101， SEQIDNO:103， SEQ ID NO:105， SEQIDNO:107， SEQIDNO:109， SEQIDNO:lll， SEQ ID NO:113具有至少99%序列一致性的序列。
一方面，所述核酸序列包括在SEQIDNO:l， SEQIDNO:3， SEQ IDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQIDNO:19， SEQIDNO:21, SEQ IDNO:23， SEQIDNO:25， SEQIDNO:27， SEQ ID NO:29， SEQ ID NO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQIDNO:37， SEQ IDNO:39, SEQIDNO:41， SEQIDNO:43, SEQIDNO:45， SEQIDNO:47， SEQ IDNO:49， SEQIDNO:51， SEQ ID NO:53， SEQ ID NO:55， SEQ ID NO:57， SEQ ID NO:59， SEQ ID NO:61 ， SEQ ID NO:63， SEQ ID NO:65， SEQIDNO:67， SEQIDNO:69， SEQE)NO:71， SEQIDNO:73， SEQ IDNO:75， SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQIDNO:81, SEQ ID NO:83， SEQIDNO:85， SEQIDNO:87， SEQIDNO:89， SEQIDNO:91， SEQIDNO:93， SEQIDNO:95， SEQE)NO:97， SEQIDNO:99， SEQ ID NO: 101， SEQ ID NO: 103， SEQ ID NO: 105， SEQ ID NO: 107, SEQ IDNO:109， SEQ ID NO: 111， SEQIDNO:113中阐明的序列。
本发明提供编码包括在SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:4， SEQ ID NO:6， SEQIDNO:8， SEQ ID NO: 10， SEQIDNO:12， SEQIDNO:14， SEQIDNO:16， SEQIDNO:18， SEQIDNO:20， SEQIDNO:22， SEQ IDNO:24， SEQ ID NO:26， SEQIDNO:28， SEQ ID NO:30， SEQ ID NO:32， SEQ ID NO:34， SEQ ID NO:36， SEQ ID NO:38， SEQ ID NO:40， SEQIDNO:42， SEQIDNO:44， SEQIDNO:46， SEQIDNO:48， SEQ ID NO.50, SEQ ID NO:52， SEQ ID NO:54， SEQ ID NO:56， SEQ ID NO:58, SEQIDNO:60， SEQIDNO:62， SEQIDNO:64， SEQIDNO:66， SEQ IDNO:68， SEQ ID NO:70， SEQ ID NO:72， SEQ ID NO:74， SEQ ID NO:76， SEQ ID NO:78， SEQ ID NO:80， SEQ ID NO:82， SEQ ID NO:84,SEQIDNO:86， SEQIDNO:88， SEQIDNO:90， SEQIDNO:92， SEQ IDNO:94， SEQIDNO:96， SEQIDNO:98， SEQIDNO:100， SEQ ID NO:102， SEQIDNO:104， SEQIDNO:106， SEQIDNO:108， SEQ ID NO:llO， SEQIDNO:113， SEQ ID NO:114中所列序列的多肽的分离的 或重组的核酸。
一方面，所述序列比较运算是BLAST版本2.2.2运算，其中过滤 设置设为blastall-p blastp-d "nr pataa"-F F，其它所有选项都设为默认值。
一方面，所述核酸包括在至少大约200， 300, 400， 500， 550， 600， 或650个残基范围内，与SEQIDNO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQID NO:15， SEQ IDNO:17， SEQIDNO:19， SEQIDNO:21, SEQIDNO:23， SEQIDNO:25， SEQIDNO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31， SEQ IDNO:33， SEQIDNO:35， SEQ ID NO:37， SEQ ID NO:39， SEQ ID NO:41. SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:47， SEQ ID NO:49， SEQ ID NO:51， SEQ ID NO:53， SEQ ID NO:55， SEQ ID NO:57， SEQ ID NO:59， SEQ IDNO:61， SEQIDNO:63， SEQIDNO:65， SEQIDNO:67， SEQIDNO:69， SEQIDNO:71， SEQIDNO:73， SEQIDNO:75， SEQ IDNO:77， SEQ ID NO:79， SEQIDNO:81， SEQIDNO:83， SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87， SEQ ID NO:89， SEQ ID NO:91 ， SEQ ID NO:93， SEQIDNO:95， SEQIDNO:97， SEQIDNO:99， SEQIDNO:101， SEQ ID NO: 103， SEQIDNO:105, SEQIDNO:107, SEQIDNO:109， SEQ ID NO: 111， SEQIDNO:113具有至少50X序列一致性的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约700个残基范围内，与SEQID NO:l, SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQ IDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQIDNO: 19， SEQIDNO:21， SEQIDNO:25， SEQIDNO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQIDNO:37， SEQ IDNO:39， SEQIDNO:41， SEQIDNO:43， SEQ ID NO:47， SEQ ID NO:49， SEQIDNO:51， SEQIDNO:53, SEQIDNO:55， SEQIDNO:57， SEQIDNO:59， SEQIDNO:61， SEQEDNO:63， SEQIDNO:65， SEQ IDNO:67， SEQ ID NO:69， SEQIDNO:71， SEQ ID NO:73， SEQ IDNO:75， SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQ ID NO:81 ， SEQ ID NO:83， SEQIDNO:85， SEQIDNO:87， SEQIDNO:89， SEQIDNO:91, SEQ IDNO:93， SEQIDNO:95， SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99， SEQID NO:101， SEQIDNO:103， SEQ ID NO: 105, SEQIDNO:107, SEQID NO:109， SEQIDNO:lll， SEQ ID NO: 113具有至少50%序列一致性 的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约800个残基范围内，与SEQ ID NO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQ ID NO:7， SEQ ID NO:9， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQIDNO:19， SEQ IDNO:21， SEQIDNO:25, SEQ ID NO:27， SEQIDNO:31， SEQ ID NO:33， SEQIDNQ:35， SEQIDNO:39， SEQIDNO:41， SEQIDNO: 43, SEQIDNO:47， SEQIDNO:49， SEQIDNO:51, SEQIDNO:53， SEQIDNO:59， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63， SEQIDNO:65， SEQ IDNO:67， SEQ ID NO:69， SEQIDNO:73， SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77， SEQIDNO:79， SEQ IDNO:81， SEQIDNO:83， SEQIDNO:85， SEQIDNO:87， SEQIDNO:89， SEQIDNO:91， SEQIDNO:93， SEQ IDNO:95， SEQIDNO:97, SEQIDNO:99， SEQIDNO:101， SEQ ID NO:103， SEQIDNO:105, SEQIDNO:107， SEQIDNO:lll， SEQID NO:113具有至少50%序列一致性的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约900个残基范围内，与SEQID NO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:9， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQIDNO:19, SEQIDNO:21, SEQIDNO:31， SEQ IDNO:35， SEQ ID NO:39， SEQ ID NO:47， SEQ ID NO:49， SEQ ID NO:53， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63， SEQIDNO:65， SEQIDNO:73， SEQIDNO:75, SEQIDNO:81， SEQIDNO:83， SEQIDNO:87， SEQ IDNO:89， SEQIDNO:95， SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99， SEQ ID NO:101, SEQIDNO:103， SEQIDNO:105， SEQIDNO:107， SEQ ID NO: 111 ， SEQ ID NO: 113具有至少50 %序列一致性的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约900个残基范围内，与SEQ ID NO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:9， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQIDNO:19， SEQIDNO:21， SEQIDNO:31， SEQIDNO:35， SEQ ID NO:39， SEQ ID NO :47， SEQ ID NO :49， SEQID NO:53， SEQ IDNO:61， SEQIDNO:63， SEQIDNO:65， SEQIDNO:73， SEQIDNO:75， SEQIDNO:81， SEQIDNO:83， SEQIDNO:87， SEQ IDNO:89， SEQIDNO:95， SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99， SEQ ID NO:101， SEQIDNO:103， SEQIDNO:105， SEQIDNO:107， SEQID NO: 111 ， SEQ ID NO: 113具有至少50%序列一致性的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约1000个残基范围内，与SEQID NO:15， SEQ IDNO:17， SEQIDNO:19， SEQIDNO:21， SEQIDNO:31， SEQIDNO:35， SEQIDNO:47， SEQIDNO:49， SEQIDNO:53, SEQ IDNO:61， SEQIDNO:63， SEQ ID NO:65， SEQIDNO:73， SEQ ID NO:75， SEQIDNO:81， SEQIDNO:87， SEQIDNO:89， SEQIDNO:95， SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101 ， SEQ ID NO: 103， SEQIDNO:105， SEQIDNO:107， SEQIDNO:lll， SEQ ID NO: 113 具有至少50%序列一致性的序列。
一方面，所述核酸包括在至少大约1200个残基范围内，与SEQID NO:31， SEQIDNO:35, SEQIDNO:47， SEQIDNO:49， SEQIDNO:53， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63， SEQIDNO:65, SEQIDNO:73, SEQ IDNO:75， SEQ ID NO:81， SEQ ID NO:87， SEQ ID NO:89， SEQ ID NO:97, SEQIDNO:99， SEQ ID NO:101， SEQ ID NO: 105， SEQID NO:107， SEQIDNO:lll具有至少50%序列一致性的序列。
本发明提供分离的或重组的核酸，其中所述核酸包括在严紧条件 下与包括在SEQ IDNO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQID NO:17， SEQIDNO:19， SEQ IDNO:21， SEQ IDNO:23， SEQIDNO:25， SEQIDNO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQ ID NO:35， SEQ ID NO:37， SEQ ID NO:39， SEQ ID NO:41 ， SEQ ID NO: 43， SEQIDNO:45， SEQIDNO:47， SEQIDNO:49， SEQIDNO:51， SEQIDNO:53， SEQIDNO:55， SEQIDNO:57， SEQIDNO:59， SEQ IDNO:61， SEQIDNO:63， SEQ ID NO:65， SEQ ID NO:67， SEQ ID NO:69, SEQIDNO:71， SEQIDNO:73, SEQIDNO:75， SEQIDNO:77， SEQ ID NO:79， SEQ ID NO:81， SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85， SEQ IDNO:87， SEQ ID NO:89， SEQIDNO:91， SEQIDNO:93， SEQ IDNO:95， SEQIDNO:97， SEQIDNO:99， SEQIDNO:101， SEQIDNO:103， SEQ IDNO:105， SEQIDNO:107, SEQIDNO:109, SEQIDNO:lll, SEQID NO:113中所列序列的核酸杂交的序列，其中所述核酸编码具有酰胺酶 活性的多肽。
一方面，所述核酸的长度为至少大约50， 100， 150， 200， 300， 400或500个残基。 一方面，所述核酸的长度为至少大约600， 700, 800， 900， 或1200个残基或者基因或转录物的全长。
一方面,所述严紧条件包括洗涤步骤，该洗涤步骤包括在大约65°C 的温度，在0.2xSSC中洗涤大约15分钟。
一方面，所述酰胺酶活性包括水解酰胺键。所述酰胺酶活性可以 包括二级酰胺酶活性。 一方面，所述酰胺酶活性包括内酰胺酶活性。 一方面，所述酰胺酶活性包括C-端酰胺酶活性。所述酰胺酶活性可以 包括N-端酰胺酶活性。所述酰胺酶活性可以包括水解蛋白中的函胺键。 所述酰胺酶活性可以包括水解在药物或药物组合物中的酰胺键，所述 药物例如头孢菌素，如头孢菌素C。 一方面，所述酰胺酶活性包括水 解在头孢菌素C中的酰胺键产生7-氨基头孢垸酸(7-ACA)。
一方面，所述酰胺酶活性具有对映选择性。所述酰胺酶可以从消 旋混合物中产生对映结构纯的L-氨基酸。所述酰胺酶可以通过氨基酸 垸基酯或N-保护的肽烷基酯的酶促转化产生肽。
一方面，所述酰胺酶在包括温度在约37t到约95"C的条件下保持 活性。所述酰胺酶在包括温度在约55'C到约85"C的条件下可以保持活 性。
一方面，所述酰胺酶活性是耐热性的。在暴露于大于37""C到大约 95"C的温度后，所述酰胺酶可以是耐热性的。
本发明提供核酸探针，所述核酸探针用于确定编码具有酰胺酶活 性的多肽的核酸，其中所述探针包括本发明的一种核酸序列的至少10 个连续碱基。本发明提供核酸探针，所述核酸探针用于确定编码具有 酰胺酶活性的多肽的核酸，其中所述探针包括含有与本发明的核酸序 列具有至少50%， 55%， 60%， 65%, 70%， 75%， 80%, 85%， 90 %， 95%， 98%, 99%或更高序列一致性的核酸序列的核酸，其中所述序列一致性通过应用序列比较运算的分析或通过观察验证确定。一 方面，所述探针可以包括含有一种核酸序列的至少大约10到50，大约
20到60，大约30到70，大约40到80，或大约60到100，或大约70 到150个连续碱基的寡聚核苷酸。
本发明提供扩增引物序列对，所述扩增引物序列对用于扩增编码 本发明的多肽，例如具有酰胺酶活性的多肽的核酸，其中所述引物对 可以扩增本发明的核酸序列。所述扩增引物序列对的一个或者每个构 件都包括可以含有序列的至少大约10到50个连续碱基的寡聚核苷酸。 本发明提供扩增编码具有酰胺酶活性的多肽的核酸的方法，包括用能 够扩增本发明的核酸序列的扩增弓I物序列对扩增模板核酸。
本发明提供包括本发明的核酸的表达序列盒。 一方面，所述核酸 可以有效连接(operably linked to)于动物或植物启动子。 一方面，所 述表达序列盒可以进一步包括植物表达载体。所述植物表达载体可以 包括植物病毒。 一方面，所述植物启动子可以包括马铃薯，水稻，玉 米，小麦或大麦启动子。 一方面，所述启动子可以包括来源于根癌农 杆菌(v4gra^cten'wm fwme/adews)的T-DNA的启动子。 一方面，所述 启动子可以是组成型启动子。所述组成型启动子可以是CaMV35S。另 一方面，所述启动子可以是诱导型启动子。 一方面，所述启动子可以 是具有组织特异性的启动子。所述的组织特异的启动子可以是种子特 异的，叶特异的，根特异的，茎特异的或脱落诱导的(abscission-induced) 启动子。
本发明提供包括本发明的核酸的载体。本发明提供包括本发明的 载体或本发明的核酸的克隆媒介物(vehicle)。 一方面，所述克隆媒介 物可以包括病毒载体，质粒，噬菌体，噬粒(phagemid)，粘粒(cosmid)， fos-质粒(fosmid)，细菌噬菌体或人工染色体。 一方面，所述病毒载体 可以包括腺病毒载体，逆转录病毒载体或腺相关病毒载体。另一方面， 所述克隆媒介物可以包括细菌人工染色体(BAC)，质粒，细菌噬菌 体P1衍生的载体(PAC)，酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工 染色体(MAC)。
本发明提供包含本发明的载体、本发明的核酸或本发明的克隆媒 介物的转化细胞。 一方面，所述细胞可以是细菌细胞，哺乳动物细胞，真菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞或植物细胞。 一方面，所述植物细胞 可以是马铃薯，水稻，玉米，小麦，烟草或大麦细胞。
本发明提供包含本发明的载体、本发明的核酸或本发明的克隆媒 介物的转基因非人动物。
一方面，所述动物可以是鼠。
本发明提供包含本发明的载体、本发明的核酸或本发明的克隆媒 介物的转基因植物。
一方面，所述植物可以是玉米植物，高梁植物， 马铃薯植物，西红柿植物，小麦植物，油籽植物，油菜籽植物，大豆 植物，水稻植物，大麦植物，草或烟草植物。
本发明提供包含本发明的载体、本发明的核酸或本发明的克隆媒 介物的转基因种子。
一方面，所述种子可以是玉米种，小麦种，油籽， 油菜籽，大豆种，棕榈仁，向日葵籽，芝麻籽，水稻，大麦，花生， 或烟草植物的种子。
本发明提供包括本发明的核酸序列或其子序列(subsequence)的 反义寡聚核苷酸。 一方面，所述反义寡聚核苷酸的长度可以是大约10 个碱基到50个碱基，大约20碱基到60个碱基，大约30个碱基到70 个碱基，大约40个碱基到80个碱基，或大约60个碱基到100个碱基。
本发明提供抑制酰胺酶信息(message)在细胞内的翻译的方法， 包括往所述细胞内注入或在所述细胞内表达反义寡聚核苷酸，所述反 义寡聚核苷酸包括在严紧条件下与本发明的核酸互补或能够杂交的核 酸序列。
本发明提供分离的或重组的多肽，所述多肽包括(a)在至少大约 100个残基的范围内，与SEQIDNO:2， SEQIDNO:4， SEQIDNO:6， SEQIDNO:8， SEQIDNO:10， SEQIDNO:12， SEQIDNO:14， SEQID NO:16， SEQ IDNO:18， SEQIDNO:20， SEQIDNO:22， SEQIDNO:24, SEQIDNO:26， SEQIDNO:32， SEQIDNO:34， SEQIDNO:40， SEQ IDNO:42， SEQ ID NO:44， SEQ ID NO:46， SEQ ID NO:48， SEQ ID NO:50， SEQ ID NO:52， SEQ ID NO:54， SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62， SEQIDNO:64， SEQIDNO:66， SEQIDNO:68， SEQIDNO:70， SEQ IDNO:72， SEQ ID NO:76， SEQ ID NO:78， SEQ ID NO:80， SEQ ID NO:82， SEQ ID NO:85， SEQ ID NO:87， SEQ ID NO:88， SEQ ID NO:92， SEQIDNO:94, SEQIDNO:96， SEQIDNO:98， SEQIDNO:102， SEQIDNO:104， SEQIDNO:106， SEQIDNO:108， SEQIDNO:llO， SEQ ID NO:112具有至少50%序列一致性，与SEQ ID NO:36， SEQ ID NO:74， SEQ ID NO:90， SEQ ID NO:114具有至少55%序列一致性， 与SEQ ID NO:28， SEQ ID NO:30， SEQ ID NO:58具有至少60%序列 一致性，与SEQ ID NO:100具有至少65X序列一致性，与SEQ ID NO:56 具有至少90%序列一致性，与SEQ ID NO:38具有至少99%序列一致 性的序列；或者(b)由本发明的核酸编码的多肽。 一方面，所述多肽可以具有酰胺酶活性。
一方面，所述多肽包括在至少大约150， 200， 250， 300， 350， 400， 450或500个残基的序列区域具有至少50%—致性的氨基酸序列。一 方面，所述多肽包括在至少大约100个残基的区域具有至少55%, 60 %， 65%, 70%， 75%, 80%， 85%， 90%, 95%或99%—致性的氨 基酸序列。
一方面，所述分离的或重组的多肽可以包括在SEQIDNO:2， SEQ IDN0:4， SEQIDNO:6， SEQ IDNO:8， SEQIDNO:10， SEQIDNO:12， SEQIDNO:14， SEQIDN0:16， SEQIDNO:18， SEQIDNO:20， SEQ IDNO:22， SEQ ID NO:24， SEQ ID NO:26， SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ IDNO:32, SEQIDNO:34， SEQIDNO:36， SEQIDNO:38， SEQIDNO:40， SEQIDNO:42， SEQIDNO:44， SEQIDNO:46， SEQ IDNO:48, SEQ ID NO:50， SEQ ID NO:52， SEQ ID NO:54， SEQ ID NO:56， SEQ ID NO:58， SEQ ID NO:60， SEQ ID NO:62， SEQ ID NO:64， SEQIDNO:66， SEQIDNO:68， SEQIDNO:70, SEQIDNO:72, SEQ IDNO:74, SEQ ID NO:76， SEQ ID NO:78， SEQ ID NO:80， SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84， SEQ ID NO:86， SEQ ID NO:88， SEQ ID NO:90, SEQIDNO:92， SEQIDNO:94， SEQIDNO:96， SEQIDNO:98， SEQ IDNO:100, SEQIDNO:102, SEQIDNO:104， SEQIDNO:106， SEQ IDNO:108， SEQIDNO:110， SEQIDNO:113， SEQ ID NO:114中所 列的氨基酸序列。
一方面，所述酰胺酶活性包括水解酰胺键。所述酰胺酶活性可以 包括二级酰胺酶活性。 一方面，所述酰胺酶活性包括内酰胺酶活性。 一方面，所述酰胺酶活性包括C-端酰胺酶活性。所述酰胺酶活性可以包括N-端酰胺酶活性。所述酰胺酶活性可以包括水解蛋白中的酰胺键。 所述酰胺酶活性可以包括水解在药物或药物组合物中的酰胺键，所述 药物例如头孢菌素，如头孢菌素C。
一方面，所述酰胺酶活性包括水
解在头孢菌素C中的酰胺键产生7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。
一方面，所述酰胺酶活性具有对映选择性。所述酰胺酶可以从消
旋混合物中产生对映结构纯的L-氨基酸。所述酰胺酶可以通过氨基酸 烷基酯或N-保护的肽烷基酯的酶促转化产生肽。
一方面，本发明提供分离的或重组的多肽，其中所述酰胺酶活性 是热稳定的。 一方面，所述多肽在包括温度在大约37X:到大约95'C的 条件下可以保持酰胺酶活性。另一方面，所述多肽可以在包括大约55°C 到大约85t:的温度范围，大约7(TC到大约95'C的温度范围，或者大约 90'C到大约95t:的温度范围的条件下保持酰胺酶活性。
另一方面，本发明提供分离的或重组的多肽，其中所述酰胺酶活 是耐热的。 一方面，所述多肽在暴露于大于37X:到大约95-C的温度范 围，大于55'C到大约85t:的温度范围，大于9(TC到大约95'C的温度 范围后保持酰胺酶活性。
本发明提供包含本发明的多肽并缺少信号序列的分离的或重组的 多肽。
一方面，本发明提供本发明的分离的或重组的多肽，其中所述酰 胺酶活性包括在大约37°C，大约100到大约1000单位(units)每毫克 蛋白的范围内的比活。 一方面，所述酰胺酶活性可以包括在大约37。C， 大约500到大约750单位每毫克蛋白的范围内，大约500到大约1200 单位每毫克蛋白的范围内，或者大约750到大约1000单位每毫克蛋白 的范围内的比活。 一方面，所述耐热性可以包括被加热到一个提高的 温度后，仍保留该酰胺酶在37。C时的比活的至少一半。另一方面，所 述耐热性可以包括被加热到一个提高的温度后，仍保留在37。C时大约 500到大约1200单位每毫克蛋白的范围内的比活。
一方面，本发明的分离的或重组的多肽可以包括至少一个糖基化 位点。 一方面，糖基化可以是N-连接的糖基化。 一方面，本发明的多 肽可以在毕赤酵母(尸.pa^on》)或裂变酵母(5*. ; om&)中被表达之 后进行糖基化。本发明提供本发明的分离的或重组的多肽，其中所述多肽在包括
大约pH4.5或pH5或更小pH的条件下保持酰胺酶活性。 一方面，所 述多肽在包括大约pH 8.0， pH 8.5， pH 9， pH 9.5， pH 10或pH 10.5
或更大pH的条件下保持酰胺酶活性。
本发明提供包含本发明的多肽的蛋白制备物，其中所述蛋白制备 物包含液体，固体或凝胶。
一方面，本发明提供包括本发明的多肽和第二结构域的异源二聚 体。 一方面，所述第二结构域可以是一个多肽，所述异源二聚体是融 合蛋白。另一方面，所述第二结构域可以是抗原决定部位(epitope) 或标记(tag)。本发明提供包括本发明的多肽的同型二聚体。
本发明提供具有酰胺酶活性的固定化多肽，其中所述多肽包括本 发明的多肽或含有本发明的多肽的异源二聚体。 一方面，所述多肽可 以固定在细胞，金属，树脂，聚合物，陶瓷，玻璃，微电极，石墨颗 粒，珠子，凝胶，平板，阵列或毛细管上。本发明提供包括本发明的 固定化多肽的阵列。 一方面，阵列可以包含本发明的固定化核酸。
本发明提供分离的或重组的抗体，所述抗体特异地与本发明的多 肽结合，或者与由本发明的核酸编码的多肽结合。 一方面，所述抗体 可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明提供包括本发明的抗体的杂 交瘤细胞。
本发明提供包含本发明的多肽的动物食品添加剂。本发明提供包 含本发明的多肽的可食用的酶释放基质(enzyme delivery matrices)。
本发明提供分离或鉴定具有酰胺酶活性的多肽的方法，包括步骤 (a)提供本发明的抗体；(b)提供包含多肽的样品；(c)把步骤(b) 的样品与步骤(a)的抗体在所述抗体可以特异地与多肽结合的条件下 接触，由此分离或鉴定具有酰胺酶活性的多肽。
本发明提供制备抗酰胺酶抗体的方法，包括对非人动物按足以导 致体液免疫应答的量施用本发明的核酸，本发明的多肽，或由本发明 的核酸编码的多肽，由此制备抗酰胺酶抗体。
本发明提供产生重组多肽的方法，包括步骤(a)提供与启动子 有效连接的核酸，其中所述核酸包括本发明的核酸；(b)在允许多肽 表达的条件下表达步骤(a)的所述核酸，由此产生重组多肽。 一方面，该方法可以进一步包括用步骤(a)的所述核酸转化宿主细胞，然后再 表达步骤(a)的所述核酸，从而在被转化的细胞中产生重组多肽。 本发明提供鉴定具有酰胺酶活性的多肽的方法，包括以下步骤-
(a) 提供本发明的多肽；(b)提供酰胺酶底物；(c)将多肽与步骤
(b) 的底物接触，检测底物的量的减少或者反应产物的量的增加，其 中所述底物的量的减少或所述反应产物的量的增加表示检测到具有酰 胺酶活性的多肽。 一方面，所述底物可以是蛋白质或酰胺。 一方面， 所述底物可以是头孢菌素C。
本发明提供鉴定酰胺酶底物的方法，包括以下步骤(a)提供本 发明的多肽；(b)提供受测底物；(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b) 的受测底物接触，受测底物的量的减少或者反应产物的量的增加，其 中所述底物的量的减少或所述反应产物的量的增加确定所述受测底物 是酰胺酶底物。
本发明提供确定受测化合物是否与多肽特异性结合的方法，包括 以下步骤(a)在允许核酸翻译为多肽的条件下，表达核酸或包含核
酸的载体，其中所述核酸包括本发明的核酸，或者，提供本发明的多
肽；(b)提供受测化合物；(c)将所述多肽与所述受测化合物接触； (d)确定步骤(b)的受测化合物是否特异性地与所述多肽结合。 本发明提供鉴定酰胺酶活性的调节物的方法，包括以下步骤(a) 提供本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供受测化合 物；(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的受测化合物接触，并测定 .酰胺酶活性，其中在受测化合物存在的情况下测定的酰胺酶活性与无 受测化合物的情况下测定的酰胺酶活性的变化确定所述受测化合物调 节了酰胺酶活性。 一方面，所述酰胺酶活性可以通过提供酰胺酶底物， 并检测所述底物的量的减少或反应产物的量的增加，或者所述底物的 量的增加或反应产物的量减少来测定。 一方面，与没有受测化合物时 底物或反应产物的量相比较，在有所述受测化合物时所述底物的量的 减少或所述反应产物的量的增加确定所述受测化合物是酰胺酶活性的 激活剂。另一方面，与没有受测化合物时底物或反应产物的量相比较， 在有所述受测化合物时所述底物的量的增加或所述反应产物的量的减 少确定所述受测化合物是酰胺酶活性的抑制剂。本发明提供包括处理器和数据储存设备的计算机系统，其中所述 数据储存设备储存有本发明的多肽，或由本发明的核酸编码的多肽。 一方面，所述计算机系统可以进一步包括序列比较运算和储存有至少 一个参考序列的数据储存设备。所述序列比较运算可以包括说明多态 性的计算机程序。另一方面，所述计算机系统可以进一步包括识别所
述序列的一个或多个特征的识别器(identifier)。
本发明提供储存有多肽序列或核酸序列的计算机可读介质，其中 所述多肽序列包括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽。'
本发明提供识别在序列中的特征的方法，包括步骤(a)应用识 别序列中一个或多个特征的计算机程序读出序列，其中所述序列包括 多肽序列或核酸序列，其中所述多肽序列包括本发明的多肽或由本发 明的核酸编码的多肽；(b)用计算机程序识别所述序列中的一个或多 个特征。
本发明提供比较第一序列和第二序列的方法，包括步骤(a)通 过应用比较序列的计算机程序读出第一序列和第二序列，其中所述第 一序列包括多肽序列或核酸序列，其中所述多肽序列包括本发明的多 肽或由本发明的核酸编码的多肽；(b)用计算机程序确定所述第一序 列和所述第二序列之间的不同。 一方面，确定第一序列和第二序列之 间的不同的步骤可以进一步包括识别多态性的步骤。 一方面，所述方 法可以进一步包括识别序列中一个或多个特征的识别器。另一方面， 所述方法可以包括应用计算机程序读出第一序列，并识别该序列中的 一个或多个特征。
本发明提供从环境样品中分离或回收编码具有酰胺酶活性的多肽 的核酸的方法，包括步骤(a)提供用于扩增编码具有酰胺酶活性的
多肽的核酸的扩增引物序列对，其中所述引物对能够扩增本发明的核
酸或其子序列；(b)从所述环境样品中分离核酸或者处理所述环境样 品，以便所述样品中的核酸可以与所述扩增引物对杂交；(c)把步骤 (b)的核酸与步骤(a)的扩增引物对组合，扩增从所述环境样品中 得到的核酸，由此从环境样品中分离或回收编码具有酰胺酶活性的多 肽的核酸。 一方面，所述扩增引物序列对的一个或各个构件可以包括 含有本发明的序列或其子序列的至少大约10到50个连续碱基的寡聚核苷酸。
本发明提供从环境样品中分离或回收编码具有酰胺酶活性的多肽 的核酸的方法，包括步骤(a)提供包含本发明的核酸的多核苷酸探 针；(b)从所述环境样品中分离核酸或者处理所述环境样品，以便所
述样品中的核酸可以与步骤(a)的多核苷酸探针杂交；(c)把步骤(b) 的所述分离的核酸或所述被处理的环境样品与步骤(a)的多核苷酸探 针组合；(d)分离与步骤(a)的多核苷酸探针特异杂交的核酸，由此 从环境样品中分离或回收编码具有酰胺酶活性的多肽的核酸。 一方面， 所述环境样品可以包括水样品，液体样品，土壤样品，气体样品或生 物样品。 一方面，所述生物样品可以来源于细菌细胞，原生动物细胞， 昆虫细胞，酵母细胞，植物细胞，真菌细胞或哺乳动物细胞。
本发明提供产生编码具有酰胺酶活性的多肽的核酸的变异体的方 法，包括步骤(a)提供包括本发明的核酸的模板核酸；(b)在所述
模板序列中修改、删除或添加一个或多个核苷酸，或者它们的组合， 产生所述模板核酸的变异体。 一方面，该方法可以进一步包括表达所 述的变异核酸，产生变异的酰胺酶多肽。 一方面，所述修改、添加或
删除可以通过包括易错PCR、重排、寡聚核苷酸诱导的定点突变、装 配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数 整体诱变、位点专一性诱变、基因重装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、 合成连接重装配(SLR)和它们的组合的方法引入。另一方面，所述修 改、添加或删除可以通过包括重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰 的DNA诱变、含有尿嘧啶的模板诱变、缺口二重诱变、点错配修复诱 变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制 选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚 体生成和它们的组合的方法引入。
一方面，所述方法可以迭代重复，直到与所述模板核酸编码的多 肽相比具有改变的或不同的活性或者具有改变的或不同的稳定性的酰 胺酶产生。 一方面，所述变异的酰胺酶多肽可以是耐热性的，在暴露 于提高的温度后仍保持一些活性。另一方面，所述变异的酰胺酶多肽 与模板核酸编码的酰胺酶相比具有更高的糖基化。 一方面，所述变异 的酰胺酶多肽在高温下可以有酰胺酶活性，其中由所述模板核酸编码的酰胺酶在高温下没有活性。
一方面，所述方法可以迭代重复，直到
与所述模板核酸相比具有改变的密码子使用"odon usage)的酰胺酶 编码序列产生。另一方面，所述方法可以迭代重复，直到与所述模板 核酸相比具有更高或更低水平的信息表达或稳定性的酰胺酶基因产 生。
本发明提供修饰编码具有酰胺酶活性的多肽的核酸中的密码子以 增加其在宿主细胞中的表达的方法，包括以下步骤(a)提供编码具 有酰胺酶活性的多肽的核酸，包括本发明的核酸；(b)确定步骤(a) 的核酸中的非优选的或较不优选的密码子，把它替换为编码相同氨基 酸的优选的或中性使用的密码子，其中优选的密码子是在宿主细胞基 因的编码序列中偏爱的密码子，非优选或较不优选的密码子是在宿主 细胞基因的编码序列中偏废的密码子，由此修饰所述核酸，从而提高 它在宿主细胞中的表达。
本发明提供修饰编码酰胺酶多肽的核酸中的密码子的方法，所述 方法包括以下步骤(a)提供编码具有酰胺酶活性的多肽的核酸，包 括本发明的核酸；(b)确定步骤(a)的核酸中的密码子，把它用编码 相同氨基酸的不同密码子取代，由此修饰编码酰胺酶的核酸中的密码 子。 '
本发明提供修饰编码酰胺酶多肽的核酸中的密码子以增加其在宿 主细胞中的表达的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供编码酰胺 酶多肽的核酸，包括本发明的核酸；(b)确定步骤(a)的核酸中非优 选的或较不优选的密码子，把它用编码相同氨基酸的优选的或中性使 用的密码子替换，其中优选的密码子是在宿主细胞基因的编码序列中 偏爱的密码子，非优选或较不优选的密码子是在宿主细胞基因的编码 序列中偏废的密码子，由此修饰所述核酸，从而提高它在宿主细胞中 的表达。
本发明提供修饰编码具有酰胺酶活性的多肽的核酸中的密码子以 降低其在宿主细胞中的表达的方法，所述方法包括以下步骤(a)提 供本发明的核酸；(b)确定步骤(a)的核酸中至少一个优选的密码子， 把它用编码相同氨基酸的非优选的或较不优选的密码子替换，其中优 选的密码子是在宿主细胞基因的编码序列中偏爱的密码子，非优选或较不优选的密码子是在宿主细胞基因的编码序列中偏废的密码子，由 此修饰所述核酸，从而降低它在宿主细胞中的表达。 一方面，所述宿 主细胞可以是细菌细胞，真菌细胞，昆虫细胞，酵母细胞，植物细胞 或哺乳动物细胞。
本发明提供用于产生编码多个修饰的酰胺酶活性位点或底物结合 位点的核酸文库的方法，其中所述修饰的活性位点或底物结合位点衍 生于第一核酸，所述第一核酸包括编码第一活性位点或第一底物结合 位点的序列，所述方法包括以下步骤(a)提供编码第一活性位点或 第一底物结合位点的第一核酸，其中所述第一核酸序列包括在严紧条 件下与本发明的序列或其子序列杂交的序列，并且所述核酸编码酰胺 酶活性位点或酰胺酶底物结合位点；(b)提供一套诱变的寡核苷酸， 其编码在第一核酸的多个靶密码子处的天然氨基酸变体；(C)应用这 套诱变的寡核苷酸来产生一套编码活性位点或编码底物结合位点的变 异核酸，所述变异核酸在被诱变的每个氨基酸密码子处编码一定范围 的氨基酸变体，从而产生编码多个修饰的酰胺酶活性位点或底物结合 位点的核酸文库。 一方面，所述方法可以进一步包括诱变步骤(a)的 第一核酸，进行诱变的方法包括优化的定向进化系统、易错PCR、重 排、寡聚核苷酸诱导的定向突变、重装配PCR、有性PCR诱变、体内 诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点专一性诱变、 基因重装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR) 以及它们的组合。另一方面，所述方法可以进一步包括诱变步骤(a) 的第一核酸或变异体，进行诱变的方法包括重组、递归序列重组、硫 代磷酸酯修饰的DNA诱变、含有尿嘧瞎的模板诱变、缺口二重诱变、 点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺 失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、 嵌合核酸多聚体生成和它们的组合。
本发明提供制造小分子的方法，包括以下步骤(a)提供能够合 成或修饰小分子的多种生物合成酶，其中这些酶中的一种包括由包括 本发明的核酸的核酸编码的酰胺酶；(b)提供步骤(a)的至少一种酶 的底物；(c)步骤(b)的底物与所述酶在有利于多个生物催化反应进 行的条件下反应，通过一系列生物催化反应产生小分子。本发明提供修饰小分子的方法，包括以下步骤(a)提供酰胺酶, 其中所述酶包括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提
供小分子；(c)步骤(a)的酶与步骤(b)的小分子在有利于由所述 酰胺酶催化的酶促反应进行的条件下反应，由此通过酰胺酶酶促反应 修饰小分子。 一方面，所述方法可以包括步骤(a)的酶的多个小分子 底物，由此通过至少一种由所述酰胺酶催化的酶促反应产生修饰的小 分子库。另一方面，所述方法可以包括多个额外的酶，在有利于所述 酶的多个生物催化反应进行的条件下，通过多个酶促反应形成多个修 饰的小分子。作为选择，所述方法可以进一步包括检验所述文库的步 骤，以确定表现有所要活性的特定修饰的小分子是否出现在该文库中。 检验所述文库的步骤可以进一步包括系统地消去除一个以外的所有生 物催化反应，以产生所述文库内多个修饰的小分子的一部分，检测所 述的这一部分内是否存在具有所要活性的特定修饰的小分子，并确定 产生具有所要活性的特定修饰的小分子的至少一个特定的生物催化反 应。
本发明提供确定酰胺酶的功能片断的方法，包括步骤(a)提供 酰胺酶，其中该酶包括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽； (b)从步骤(a)的序列中删除多个氨基酸残基，检验剩余的子序列 是否具有酰胺酶活性，从而确定酰胺酶的功能片断。 一方面，所述酰 胺酶活性可以通过提供酰胺酶底物，并检测所述底物的量的减少或反 应产物的量的增加来测定。
通过应用实时代谢流分析(real-time metabolic flux analysis)，本 发明提供用于新的或修饰的表型的全细胞工程的方法，所述方法包括 以下步骤(a)通过修饰所述细胞的遗传组成，产生修饰的细胞，其 中所述遗传组成通过往所述细胞中添加包括本发明的核酸的核酸而被 修饰；(b)培养所述修饰的细胞，产生多个修饰的细胞；(C)通过 以实时方式监控步骤(b)的细胞培养物，测量所述细胞的至少一种代 谢参数；(d)分析步骤(c)的数据，确定测量到的参数是否与在相 似条件下的未修饰细胞有所不同，从而应用实时代谢流分析确定所述 细胞中工程化的表型。 一方面，所述细胞的遗传组成可以通过包括删 除细胞中的序列或修饰细胞中的序列，或者敲除基因的表达的方法而被修饰。 一方面，所述方法可以进一步包括选择含有新的工程化表型 的细胞。另一方面，所述方法可以进一步包括培养被选择的细胞，由 此产生含有新的工程化表型的细胞株。
本发明提供水解酰胺键的方法，包括以下步骤(a)提供具有酰 胺酶活性的多肽，其中所述多肽包括本发明的多肽或由本发明的核酸 编码的多肽；(b)提供包括酰胺键的化合物；(c)将步骤(a)的多肽 与步骤(b)的化合物在所述多肽水解所述酰胺键的条件下接触。 一方
面，所述化合物可以包括内酰胺键。另一方面，所述化合物可以包括c
端酰胺键或N端酰胺键。
本发明提供从组合物中溶解或除去含有酰胺键的化合物的方法， 包括以下步骤(a)提供具有酰胺酶活性的多肽，其中所述多肽包括 本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供包含含有酰胺 键的化合物的组合物；(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物 在所述多肽除去或溶解含有酰胺键的化合物的条件下接触。
本发明提供增加酰胺酶多肽的耐热性或热稳定性的方法，所述方 法包括糖基化酰胺酶多肽，其中所述多肽包括本发明的多肽或者由本 发明的核酸编码的多肽的至少30个相邻氨基酸，由此增加所述酰胺酶 多肽的耐热性或热稳定性。 一方面，所述酰胺酶的特异活性可以在大 于37'C到大约95'C的范围内是热稳定或耐热的。
本发明提供用于在细胞中过量表达重组酰胺酶多肽的方法，包括 表达含有本发明的核酸的表达载体，其中过量表达通过应用高活性的 启动子、双顺反子的载体或者通过载体的基因扩增来完成。
本发明提供包括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的去 垢剂组合物，其中所述多肽包含酰胺酶活性。 一方面，所述酰胺酶可 以是非表面活性的酰胺酶。另一方面，所述酰胺酶可以是表面活性的 酰胺酶。
本发明提供用于洗涤物体的方法，包括以下步骤(a)提供包含
具有酰胺酶活性的多肽的组合物，其中所述多肽包括本发明的多肽或
由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供一个物体；(c)将步骤(a)的 多肽与步骤(b)的物体在所述组合物可以洗涤所述物体的条件下接触。 本发明提供在动物消耗词料或食物之前水解饲料或食物中的蛋白质或酰胺的方法，包括以下步骤(a)获得包括蛋白质的词料材料， 其中所述蛋白质可以被具有酰胺酶活性的多肽水解，其中所述多肽包
括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽；(b)把足量的步骤(a)
的多肽添加到所述饲料或食物材料中，经过以致于可以水解所述蛋白 质和形成经过处理的食品或饲料的足够长的时间，由此在动物消耗所 述饲料或食物之前水解饲料或食品中的蛋白质。 一方面，所述食品或 饲料包括水稻，玉米，大麦，小麦，豆类或马铃薯。
本发明提供拆分光学活性化合物的外消旋混合物的方法，包括以
下步骤(a)提供包括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的
多肽，其中所述多肽对于光学活性化合物的一种对映异构体是具有选
择性的；(b)提供光学活性化合物的外消旋混合物；(c)将步骤(a) 的多肽与步骤(b)的混合物在所述多肽可以选择性地转化光学活性化 合物的仅仅一种对映异构体的条件下接触，由此导致外消旋混合物的 拆分。 一方面，所述多肽可以对于L-对映异构体是选择性的。另一方 面，所述多肽可以对R-对映异构体是选择性的。 一方面，所述多肽是 立体专一性的。
本发明提供合成含有酰胺键的化合物的方法，包括以下步骤(a) 提供包括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的多肽，其中所 述多肽包含酰胺酶活性；(b)提供前体；(c)把步骤(a)的多肽与 步骤(b)的前体在所述多肽可以催化酰胺键合成的条件下接触。 一方 面，所述多肽可以是立体选择的或立体专一的，包含酰胺键的化合物 可以是手性的。 一方面，所述前体可以具有弱的水溶性。另一方面， 所述前体可以是非手性的，包含酰胺键的化合物是手性的。 一方面， 包含酰胺键的化合物可以是氨基酸或氨基酰胺。 一方面，所述化合物 可以是甲基多巴。
本发明提供水解青霉素的方法，包括以下步骤(a)提供包括本 发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的多肽；(b)提供包括青霉 素的组合物；(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物在所述多 肽可以水解青霉素的条件下组合。
本发明提供水解头孢菌素的方法，包括以下步骤(a)提供包括 本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的多肽；(b)提供包括头孢菌素的组合物；(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物在所 述多肽可以水解头孢菌素的条件下组合。 一方面，所述头孢菌素可以 是头孢菌素C。
本发明提供合成7-氨基头孢垸酸(7-ACA)的方法，包括以下步 骤(a)提供包括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的多肽; (b)提供包括头孢菌素C的组合物；(c)将步骤(a)的多肽与步骤 (b)的组合物在所述多肽可以把头孢菌素C转化为7-氨基头孢烷酸 (7-ACA)的条件下组合。
本发明提供水解细胞壁的方法，包括以下步骤(a)提供包括本 发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的多肽；(b)提供包括细胞 壁的组合物；(c)把步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触，其 中所述多肽可以水解所述细胞壁。
本发明提供影响食品加工中的发酵的方法，包括以下步骤(a) 提供包括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的多肽；(b)提 供包括在食品加工中使用的细菌的组合物；(c)把步骤(a)的多肽 与步骤(b)的组合物在所述多肽可以改变所述细菌的发酵特性的条件 下接触。 一方面，所述细菌的发酵特征可以包括生长速度，酸的产生 或存活。
本发明提供催熟乳酪和形成风味的方法，包括以下步骤(a)提 供包括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的多肽；(b)提供 包括乳酪的组合物；(c)把步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物在 所述多肽水解牛奶酪蛋白的条件下接触，由此促进奶酪成熟和奶酪风 味的形成。
本发明提供制造转基因植物的方法，包括以下步骤(a)把异源 核酸序列导入到细胞中，其中所述异源核酸序列包括本发明的核酸， 由此产生转化的植物细胞；(b)由所述转化细胞获得转基因植物。一 方面，步骤(a)可以进一步包括通过电穿孔或植物细胞原生质体的微 注射，导入所述异源核酸序列。另一方面，步骤(a)可以进一步包括 通过DNA颗粒轰击(DNA particle bombardment)把所述异源核酸序 列直接导入植物组织中。可替代的，步骤(a)可以进一步包括应用根 癌农杆菌宿主把所述异源核酸序列导入所述植物细胞DNA。本发明提供在细胞中，例如在动物或植物细胞中表达异源核酸序 列的方法，包括以下步骤(a)用与启动子有效连接的异源核酸序列 转化所述细胞，其中所述异源核酸序列包括本发明的核酸；(b)在所
述异源核酸序列被所述细胞表达的条件下培养所述细胞。
本发明提供促进细菌或真菌杀死的方法，包括(a)提供包括本 发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的多肽；(b)将步骤(a)的 多肽与组合物接触，由此促进细菌或真菌杀死。本发明提供包括本发 明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的抗微生物组合物。所述抗微 生物组合物可以是杀菌剂或杀真菌剂。
本发明提供包含本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的食 品。本发明提供包含本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的奶 酪。本发明提供包含本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的乳 制品。
本发明提供包含本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的药 物组合物。
本发明提供包含本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽的消 费品和食品，包括可食用的产品，化妆品，清洗织物、硬表面和人的 皮肤等的产品，面包和面包添加剂，黄油，人造黄油，黄油的低热量 替代品，乳酪，调味品，类似蛋黄酱的产品，肉类产品，含有肽的食 物添加剂，香波，例如为了处理人的皮肤的乳脂或洗液，肥皂和肥皂 替代品，洗衣粉或洗衣液，和/或用于清洗食物生产设备和厨房用器皿 的产品。
本发明提供具有在SEQIDNO:l， SEQIDNO:3， SEQIDNO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQID NO:15， SEQ IDNO:17， SEQIDNO:19， SEQ ID NO:21 ， SEQ ID NO:23， SEQIDNO:25， SEQIDNO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31， SEQ IDNO:33， SEQ ID NO:35， SEQ ID NO:37， SEQ ID NO:39， SEQ ID NO:41 ， SEQ ID NO:43， SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:47， SEQ ID NO:49， SEQIDNO:51， SEQIDNO:53， SEQIDNO:55， SEQIDNO:57， SEQ IDNO:59， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63, SEQ ID NO:65， SEQ ID NO:67， SEQ IDNO:69， SEQIDNO:71， SEQ IDNO:73， SEQIDNO:75，SEQIDNO:77， SEQIDNO:79， SEQIDNO:81， SEQIDNO:83， SEQ IDNO:85， SEQ ID NO:87， SEQ ID NO:89， SEQIDNO:91， SEQ ID NO:93， SEQ ID NO:95， SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99， SEQ ID NO:101， SEQIDNO:103， SEQIDNO:105， SEQIDNO:107， SEQID NO:109， SEQIDNO:lll， SEQ ID NO:113中所列序列的分离的核酸， 以及其变异体。所述变异体与本发明的序列具有至少50%序列一致性， 并编码具有酰胺酶活性的多肽，所述酰胺酶活性包括二级酰胺酶活性， 例如催化酰胺的水解，所述具有酰胺酶活性的多肽包括具有肽酶、蛋 白酶和/或乙内酰脲酶活性的酶。
本发明的一方面是具有在SEQ ID NO:l， SEQ ID NO: 3, SEQID NO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQIDNO:19, SEQIDNO:21， SEQ IDNO:23， SEQIDNO:25， SEQ ID NO:27， SEQ ID NO:29， SEQ ID NO:31， SEQ IDNO:33， SEQ IDNO:35， SEQIDNO:37， SEQIDNO:39， SEQIDNO:41， SEQIDNO:43， SEQIDNO:45， SEQIDNO:47， SEQ IDNO:49, SEQIDNO:51， SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55， SEQ ID NO:57， SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61 ， SEQ ID NO:63， SEQ ID NO:65， SEQIDNO:67， SEQIDNO:69， SEQIDNO:71， SEQIDNO:73， SEQ IDNO:75， SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQIDNO:81， SEQ ID NO:83， SEQIDNO:85， SEQIDNO:87， SEQ IDNO:89， SEQIDNO:91， SEQIDNO:93， SEQIDNO:95， SEQIDNO:97， SEQIDNO:99， SEQ IDNO:101， SEQIDNO:103， SEQIDNO:105， SEQIDNO:107， SEQ IDNO:109， SEQIDNO:lll， SEQ ID NO:113中所列序列的分离的核 酸，与其大体上相同(substantiallyidentical)的序列，以及与其互补的 序列。
本发明的另一方面是包括在SEQIDNO:l, SEQIDNO:3， SEQID NO:5， SEQIDNO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13, SEQIDNO:15， SEQIDNO:17， SEQIDNO:19, SEQIDNO:21， SEQ IDNO:23， SEQIDNO:25， SEQIDNO:27， SEQ ID NO:29， SEQ ID NO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35， SEQIDNO:37， SEQ ID NO:39， SEQIDNO:41， SEQIDNO:43， SEQIDNO:45， SEQIDNO:47， SEQIDNO:49, SEQ ID NO :51， SEQ ID NO:53， SEQ ID NO:55， SEQID NO:57， SEQIDNO:59， SEQIDNO:61， SEQIDNO:63， SEQIDNO:65， SEQIDNO:67， SEQIDNO:69， SEQIDNO:71， SEQIDNO:73， SEQ IDNO:75, SEQ ID NO:77， SEQ ID NO:79， SEQIDNO:81， SEQ ID NO:83， SEQ ID NO:85， SEQ ID NO:87， SEQ ID NO:89， SEQ ID NO:91 ， SEQIDNO:93， SEQIDNO:95， SEQIDNO:97， SEQIDNO:99， SEQ ID NO: 101， SEQ ID NO: 103， SEQ ID NO: 105， SEQ ID NO: 107， SEQ IDNO:109, SEQIDNO:lll， SEQ ID NO:113中所列序列的至少10个 连续碱基的分离的核酸，与其大体上相同的序列，以及与其互补的序 列。
另一方面，本发明提供编码具有在SEQIDNO:2， SEQIDNO:4， SEQIDNO:6， SEQIDNO:8， SEQ ID NO: 10， SEQIDNO:12， SEQID NO:14， SEQ ID NO:16, SEQ IDNO:18, SEQIDNO:20, SEQIDNO:22， SEQIDNO:24， SEQIDNO:26， SEQIDNO:28， SEQIDNO:30， SEQ IDNO:32， SEQ ID NO:34， SEQ ID NO:36， SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40， SEQ ID NO:42， SEQ ID NO:44， SEQ ID NO:46， SEQ ID NO:48， SEQIDNO:50， SEQIDNO:52， SEQIDNO:54， SEQIDNO:56， SEQ IDNO:58， SEQ ID NO:60， SEQ ID NO:62， SEQ ID NO:64， SEQ ID NO:66， SEQ ID NO:68， SEQ ID NO:70， SEQ ID NO:72， SEQ ID NO:74， SEQIDNO:76， SEQIDNO:78， SEQIDNO:80， SEQIDNO:82， SEQ IDNO:84， SEQ ID NO:86， SEQ ID NO:88， SEQ ID NO:90， SEQ ID NO:92， SEQ ID NO:94， SEQ ID NO:96， SEQ ID NO:98， SEQ ID NO:画，SEQIDNO:102， SEQIDNO:104， SEQIDNO:106， SEQID NO:108， SEQIDNO:110， SEQIDNO:113， SEQID NO:114中所列序 列的多肽的分离的核酸，以及其变异体，所述变异体编码具有酰胺酶 活性的多肽，并与这样的序列具有至少50%序列一致性，所述酰胺酶 活性包括二级酰胺酶活性。 一方面，所述酰胺酶活性包括水解酰胺， 例如具有肽酶、蛋白酶和/或乙内酰脲酶活性的酶。
本发明的另一方面是编码本发明的多肽的分离的核酸，以及与其 大体上相同的序列。
本发明的另一方面是编码本发明的多肽以及与其大体上相同的序列的分离的核酸。
另一方面，本发明提供具有在SEQIDN0:2， SEQIDN0:4， SEQ ID NO:6， SEQ ID N0:8， SEQ ID NO: 10， SEQ ID NO:12， SEQ ID NO:14， SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:18， SEQ ID NO:20， SEQ ID NO:22， SEQIDNO:24， SEQIDNO:26， SEQIDNO:28, SEQIDNO:30, SEQ IDNO:32， SEQ ID NO:34， SEQ ID NO:36， SEQ ID NO:38, SEQID NO:40， SEQ ID NO:42， SEQ ID NO: 44， SEQ ID NO:46， SEQ ID NO:48， SEQIDNO:50， SEQIDNO:52， SEQIDNO:54， SEQIDNO:56， SEQ IDNO:58， SEQ ID NO :60， SEQ ID NO :62， SEQ ID NO: 64， SEQID NO:66， SEQ ID NO:68， SEQ ID NO:70， SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74， SEQIDNO:76， SEQIDNO:78， SEQIDNO:80， SEQIDNO:82， SEQ IDNO:84， SEQ ID NO: 86， SEQ ID NO:88， SEQ ID NO :90， SEQID NO:92， SEQ ID NO:94， SEQ ID NO:96， SEQ ID NO:98， SEQ ID NO:IOO， SEQIDNO:102， SEQIDNO:104， SEQIDNO:106， SEQID NO駕，SEQIDNO:110, SEQIDNO:113， SEQ IDNO:114中所列序 列的纯化的多肽，以及与其大体上相同的序列。 一方面，所述多肽具 有酰胺酶活性，包括二级酰胺酶活性，包括例如酰胺的水解，所述多 肽包括具有肽酶、蛋白酶和/或乙内酰脲酶活性的酶。
本发明的另一方面是特异地与本发明的多肽结合的分离的或纯化 的抗体，以及与其大体上相同的序列。
本发明的另一方面是特异性结合本发明的多肽的分离的或纯化的 抗体或它的结合片断，以及与其大体上相同的序列。
本发明的另一方面是制备本发明的多肽以及与其大体上相同的序 列的方法。所述方法包括把编码所述多肽的核酸导入宿主细胞，其中 所述核酸与启动子有效连接，并在允许所述核酸表达的条件下培养所 述宿主细胞。
本发明的另一方面是制备具有本发明的多肽的至少10个氨基酸的 多肽以及与其大体上相同的序列的方法。所述方法包括把编码所述多 肽的核酸导入宿主细胞，其中所述核酸与启动子有效连接，并在允许 所述核酸表达的条件下培养所述宿主细胞，由此产生所述多肽。
本发明的另一方面是产生变异体的方法，包括获得本发明的核酸，例如具有在SEQ ID NO:l ， SEQ ID NO:3， SEQ ID NO:5， SEQ ID NO:7， SEQIDNO:9， SEQIDNO:ll， SEQIDNO:13， SEQIDNO:15， SEQID NO: 17， SEQ ID NO:19， SEQ ID NO:21 ， SEQ ID NO:23， SEQ ID NO:25， SEQIDNO:27， SEQIDNO:29， SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQ IDNO:35， SEQ ID NO:37， SEQ ID NO:39， SEQIDNO:41， SEQID NO:43， SEQIDNO:45， SEQIDNO:47， SEQIDNO:49， SEQIDNO:51， SEQIDNO:53, SEQIDNO:55， SEQIDNO:57， SEQIDNO:59， SEQ IDNO:61， SEQIDNO:63， SEQ ID NO:65， SEQ ID NO:67， SEQ ID NO:69， SEQIDNO:71， SEQIDNO:73， SEQIDNO:75， SEQIDNO:77， SEQIDNO:79， SEQIDNO:81， SEQIDNO:83， SEQIDNO:85， SEQ IDNO:87， SEQ ID NO:89， SEQIDNO:91， SEQIDNO:93, SEQ ID NO:95， SEQ ID NO:97， SEQ ID NO:99， SEQ ID NO:101， SEQ ID NO:103， SEQIDNO:105， SEQIDNO:107， SEQIDNO:109, SEQID NO:lll， SEQ ID NO:113中所列序列的多聚核苷酸，与其大体上相同 的序列，与本发明的序列互补的序列，包含前述序列的至少30个连续 核苷酸的片断，然后将所述序列中的一个或多个核苷酸替换为另外的 核苷酸，删去所述序列中的一个或多个核苷酸，或者往所述序列中添 加一个或多个核苷酸。
本发明的另一方面是储存有本发明的核酸以及与其大体上相同的 序列，或本发明的多肽以及与其大体上相同的序列的计算机可读介质。 本发明的另一方面是包括处理器和数据储存设备的计算机系统，其中 所述数据储存设备储存有本发明的核酸以及与其大体上相同的序列， 或本发明的多肽以及与其大体上相同的序列。本发明的另一方面是用 于比较第一序列和参考序列的方法，其中所述第一序列是本发明的核 酸，与其大体上相同的序列，或本发明的多肽，与其大体上相同的序 列。所述方法包括通过应用比较序列的计算机程序读出第一序列和参 考序列；应用计算机程序确定所述第一序列和所述参考序列之间的不 同。本发明的另一方面是确定本发明的核酸和与其大体上相同的序列， 或本发明的多肽和与其大体上相同的序列中的特征的方法，包括通过 应用识别序列特征的计算机程序读出序列；应用计算机程序识别所述 序列中的特征。本发明的另一方面是用于确定本发明的多肽和与之大体上相同的 序列的片断或变异体的分析方法，所述片断或变异体保留有本发明的 多肽和与之大体上相同的序列的酶功能。所述分析包括将本发明的多 肽和与之大体上相同的序列，或多肽片断或变异体与底物分子在可以 使所述多肽片断或变异体发挥功能的条件下接触，并检测底物水平的 降低或者在所述多肽和底物间的反应的特定反应产物的水平的增加， 由此确定这些序列的片断或变异体。
表l是本发明的序列的表格。
本发明提供荧光性酰胺酶底物，例如7-(e-D-2-氨基己二酰胺)-4-甲基香豆素，所述酰胺酶例如二级酰胺酶。本发明提供包含7-(e-D-2-氨基己二酰胺)-4-甲基香豆素的组合物。 一方面，例如为了发现酰胺酶 活性，本发明的7-(e-D-2-氨基己二酰胺)-4-甲基香豆素被用于高通量 (HT)的基于活性的全细胞筛选。一方面，本发明的7-(e-D-2-氨基己 二酰胺)-4-甲基香豆素被用于环境文库的高通量筛选。 一方面，为了发 现头孢菌素C酰胺酶，7-(e-D-2-氨基己二酰胺)-4-甲基香豆素被用作底 物。本发明提供应用7-(e-D-2-氨基己二酰胺)-4-甲基香豆素来发现头孢 菌素C酰胺酶的方法。
本发明的一个或多个具体实施方式
的细节在以下附图和描述中阐 明。本发明的其它特征、目标和优点将在本说明书和附图，以及权利 要求中清楚表明。
在此引用的所有的出版物、专禾U、专利申请、GenBank序列和ATCC
保藏物都出于各种目的而特意地一并引入以供参考。
下面的附图是为了举例说明本发明的具体实施方式
，并不意味着 对权利要求所包含的发明范围的限制。 图l是计算机系统的框图。
图2是说明用于将新的核苷酸或蛋白序列与序列数据库作比较以 确定新序列与数据库序列之间的同源性水平的处理程序的一个方面的 流程图。
图3是说明在计算机中用于确定两个序列是否同源的处理程序的一个方面的流程图。
图4是说明用于检测序列中某个特征的存在的识别处理器300的 一个方面的流程图。
图5是本发明的一种典型方法的说明，如实施例3中例示，采用 两步合成程序来合成荧光性酰胺酶底物7-(^D-2-氨基己二酰胺)-4-甲
基香豆素。
图6是说明在实施例3中发现的二级酰胺酶的氨基酸序列相关性 的图表，它们都能够切割产荧光的底物7-(e-D-2-氨基己二酰酌-4-甲基
图7是头孢菌素C的双酶脱酰基作用的说明。
图8是存在DTT和L-半胱氨酸时SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:IO
的活性的图解。
图9是在实施例5中使用的各种荧光底物的结构说明，包括被合 成的7-(e-D-2-氨基己二酰胺)-4-甲基香豆素。
图IO显示了己经被确认的三个新克隆，为了进行酶的表征和用于 基于序列的筛选，它们被亚克隆。
图11是实施例5的典型方法的说明。
图12说明应用高效液相色谱(HPLC)分析的反应样品，如下面 实施例8所描述的。
各幅附图中同样的参考标记表示同样的元素。
本发明提供酰胺酶、编码所述酶的多聚核苷酸、制造和应用这些 多聚核苷酸和多肽的方法。本发明是关于具有酰胺酶活性的新的多肽， 编码它们的核酸，以及与它们结合的抗体。本发明的多肽可以在各种 诊断、治疗和工业范围内被应用。本发明的酰胺酶可以具有二级酰胺 酶活性，例如具有水解酰胺的活性，包括具有肽酶、蛋白酶和/或乙内 酰脲酶活性的酶。在可供选择的方面，本发明的酶可以用于加工食物， 例如，增加食物中的风味(如，酶催熟奶酪)，促使细菌和真菌杀死， 修饰和去保护精细化学中间产物，合成肽键，进行手性拆分，水解抗 生素，例如，头孢菌素C。本发明的酰胺酶可以在高温和/或低温，或者在广泛的温度范围内
具有活性。例如，它们可以在20。C到90°C， 30。C到8(TC，或者40°C 到7(TC的温度范围有活性。本发明也提供在碱性pH或酸性pH，例如 在低的水酸度，有活性的酰胺酶。在可供选择的方面，本发明的酰胺 酶可以在酸性pH低到pH5.0， pH4.5， pH4.0和pH3.5时有活性。在 可供选择的方面，本发明的酰胺酶可以在碱性pH高到pH9.5， pH10， pH10.5和pH11时有活性。 一方面，本发明的酰胺酶在低水活性(低 的水含量)的条件下，在大约4(TC到大约7(TC的温度范围内有活性。 本发明也提供用于进一步修饰本发明的典型酰胺酶以产生具有所 要特性的蛋白质的方法。例如，利用本发明的方法产生的酰胺酶可以 具有改变的酶活性，热稳定性，pH/活性特征，pH/稳定性特征(例如 在低的pH，例如pIK6或pIK5，或高的pH，例如pH〉9时稳定性增 强)，对氧化作用的稳定性，(^2+依赖性，比活，等等。利用本发明可 以改变任何感兴趣的性质。例如，所述改变可以导致变异体，所述变 异体与亲本酶相比，具有改变的酶活性，或pH或温度活性特征。
术语"酰胺酶(amidase)"包括具有酰胺酶活性的所有多肽，例如， 具有催化水解酰胺的活性的酶。例如，术语酰胺酶包括具有二级酰胺 酶(secondary amidase)活性，例如具有水解酰胺活性的多肽。该术语 包括具有肽酶、蛋白水解酶和/或乙内酰脲酶活性的酶。该术语包括可 以用于增加食品(例如酶促熟奶酪)中的风味、促使细菌和真菌杀死、 修饰和去保护精细化学中间产物、合成肽键、进行手性拆分的酶。该 术语包括可以水解酰胺抗生素，例如头孢菌素C的酶。"酰胺酶变异 体"包括衍生于"前体酰胺酶"的氨基酸序列的氨基酸序列。该前体 酰胺酶可以包括天然发生的酰胺酶和重组的酰胺酶。酰胺酶变异体的 氨基酸序列可以通过对前体氨基酸序列迸行一个或多个氨基酸的替 代、删除或插入而于前体酰胺酶的氨基酸序列"衍生"出来。这样的 修饰可以是针对编码前体酰胺酶的氨基酸序列的"前体DNA序列"， 而不是操作前体酰胺酶本身。操作该前体DNA序列的合适的方法包括 在此公开的方法，和本领域技术人员已知的方法。本发明的酰胺酶也可以有如美国专利号6,500,659; 6,465,204; 6,429,004中描述的活性。 除了在此描述的筛选方法外，还可参见美国专利号6，333，176的常规检 验多肽是否具有酰胺酶活性的可替代方法。
术语"抗体"包括来源于(derived from)、制作于(modeled after) 或大体上编码于(substantially encoded by) —个免疫球蛋白基因或多 个免疫球蛋白基因的肽或多肽或者其片断，它们能特异地结合于抗原 或抗原决定部位，见例如，Fundamental Immunology,第三版，W. E. Paul， ed.， Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97。 术语抗体包括结合抗原的部分，即，具有与抗原结合的能力的"抗原 结合位点"(例如，片断、序列、互补性决定区(CDRs))，包括(i) Fab片断，由VL、 VH、 CL和CHI结构域组成的单价片断；(ii) F
(ab') 2片断，包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片断的二价片 断；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片断；(iv)由抗体单臂的 VL和VH结构域组成的Fv片断；(v)由VH结构域组成的dAb片断
(^Ward等，(1989) Nature 341:544-546)，和(vi)分离的互补性决定区
(CDR)。单链抗体也被包括在术语"抗体"中。
在此使用的术语"片断"包括多肽，例如天然发生的蛋白质，的 部分，可以存在至少两种不同的构象。片断可以具有与多肽相同的或 大体上相同的氨基酸序列，这里的多肽例如天然发生的蛋白质。"大体 上相同"意味着氨基酸序列大体上但并不是完全相同，但是保留有与 之相关的序列的至少一个功能活性。 一方面，氨基酸序列可以是"大 体上相同"或"大体上同源"的，假如它们至少有大约50%， 55%， 60%， 65%, 70%， 75%， 80%, 85%， 90%, 95%， 98%或99%或 更多相同的话。也包括与天然发生的蛋白质有着不同三维结构的片断。 一个这样的例子是"原形式(pro-form)"分子，例如低活性的原蛋白， 它可以通过切除被改变而产生具有显著更高活性的成熟酶。
在此使用的术语"阵列"或"微阵列"或"生物芯片"或"芯片" 是多个靶元素，每个靶元素包括固定在衬底表面的确定区域上的确定 量的一种或多种多肽(包括抗体)或核酸，以下进一步详细描述。 正如在此使用的，术语"计算机"、"计算机程序"和"处理器"使用的是它们最广泛的一般内容，并可与所有设备结合，细节在以下详细 描述。特定的多肽或蛋白质的"编码序列"或"序列编码"是指当置 于合适的调控序列的控制下时，转录和翻译成为多肽或蛋白质的核酸 序列。
在此所用的术语"表达序列盒"指的是可以影响结构基因(即， 蛋白编码序列，例如本发明的酰胺酶编码序列)在与这些序列相容的 宿主中表达的核酸序列。表达序列盒包括与多肽编码序列有效连接的 启动子；可选择地，也可以与例如转录终止信号的其它序列有效连接。
必须的或有助于影响表达的其它要素也可以被使用，例如，增强子。 所以，表达序列盒也包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重
组"裸DNA"载体，等等。
在此使用的"有效连接(operably linked)"是指两个或多个核酸(例 如，DNA)之间的相互关系。典型的，它是指转录调控序列与被转录 序列的功能关系。例如，启动子有效连接到编码序列，例如本发明的 核酸，假如它刺激或调控该编码序列在合适的宿主细胞或别的表达系 统中的转录的话。 一般地，与被转录序列有效连接的启动子转录调控 序列与该被转录序列是物理上邻接的，即，它们是顺式作用。然而， 一些转录调控序列，例如增强子，并不需要物理邻接于或位置上靠近 于转录被其增强的编码序列。
"载体"包括能够感染细胞、转染细胞、短期或永久地转导细胞 的核酸。可以认识到的是，载体可以是裸露的核酸或与蛋白或脂构成 复合物的核酸。载体可选择地包括病毒的或细菌的核酸和/或蛋白质， 和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质被膜等等)。载体包括，但不局限 于复制子(例如，RNA复制子、噬菌体)，DNA可以与复制子相连， 而变得可以复制。载体包括，但不局限于RNA，自动地自我复制的环 状或线状DNA或RNA (例如，质粒、病毒，等等，见，例如美国专 利号5,217,879)，并且包括表达质粒和非表达质粒。当重组微生物或细 胞培养物被描述作为"表达载体"的宿主时，这包括染色体外的环状 和线状DNA，以及整入到宿主染色体的DNA。当载体被宿主细胞保持 时，载体或者可以在细胞有丝分裂期间作为自主结构稳定复制，或者 整入到宿主基因组中。如在此使用的，术语"启动子"包括所有可以驱动细胞例如植物 细胞中的编码序列转录的序列。所以，本发明的构建物中使用的启动 子包括顺式作用转录控制元件和调控序列，它们涉及调控或调节基因 转录的时间和/或速率。例如，启动子可以是顺式作用转录控制元件， 包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5' 和3'不翻译区，或涉及转录调控的内含子序列。这些顺式作用序列一 般与蛋白质或别的生物分子相互作用(启动/关闭，调节，调控，等等) 进行转录。"组成型"的启动子是在多数环境条件和发育或细胞分化 状态下持续驱动表达的启动子。"诱导型"或"调控型"启动子在环 境条件或发育条件的影响下指导本发明的核酸的表达。可以影响诱导 型启动子进行转录的环境条件的例子包括厌氧条件、提高的温度、干 旱或有光。
"组织特异性"启动子是只在特定细胞或组织或器官，例如植物 或动物中，有活性的转录控制元件。组织特异性调控可以通过某些内 在因子实现，内在因子可以确保编码某种组织特异性蛋白的基因的表 达。已知这样的因子存在于哺乳动物和植物中，以使特异性组织发育。
术语"植物"包括整个植物、植物的部分(例如，叶，茎，花， 根，等等)、植物原生质体、种子和植物细胞和其后代。 一般地，可以 在本发明的方法中使用的植物种类宽泛至可适于转化技术的高等植 物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)，还有裸子植物。它 包括多种倍体型的植物，包括多倍体，二倍体，单倍体和半合子。如 在此使用的，术语"转基因植物"包括这样的植物或植物细胞，其中 插入有异源核酸序列，例如本发明的核酸和各种重组构建物(例如， 表达序列盒)。
"质粒"可以从商业上获得、在自由基础上从公众获得、或者根 据公开的程序由可获得的质粒构建。在此描述的等效质粒在技术上是 已知的，并且对本领域技术人员来说是很显然的。
术语"基因"包括一段核酸序列，它含有DNA片断，其涉及产生 转录产物(例如信息)，转录产物又被翻译产生多肽链、或者调控基因 转录、复制或稳定性。基因可以包括编码区域之前或之后的区域，例 如前导物和尾部、启动子和增强子，可适用的话，还包括在各个编码片断(外显子)之间的插入序列(内含子)。
短语"核酸"或"核酸序列"包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸， 它们的片断，可以是单链的或双链的、可以代表正义链或反义链的、
基因组的或合成的DNA或RNA (例如mRNA， rRNA， tRNA)，肽 核酸(PNA)，或天然的或合成的任何DNA类似的或RNA类似的物质， 包括，例如iRNA，核糖核蛋白(例如，iRNPs)。该术语包含例如寡核 苷酸的核酸，其含有天然核苷酸的己知类似物。该术语也包含具有合 成骨架的核酸类似结构，见，例如Mata(1997)Toxicol.App1. Pharmacol. 144:189-197; Stmuss-Soukup( 1997)Biochemistry 36:; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156。
"氨基酸"或"氨基酸序列"包括寡肽、肽、多肽或蛋白序列， 或这些的片断、部分或亚基，天然发生的或合成的分子。术语"多肽" 和"蛋白"包括通过肽键或修饰的肽键彼此连接的氨基酸，后者即肽 等配物，并且可以包含不同于编码基因的20个氨基酸的修饰的氨基酸。 术语"多肽"也包括肽和多肽片断、模体等等。该术语也包括糖基化 的多肽。本发明的肽和多肽也包括所有的"模拟物"和"肽模拟物" 形式，如在以下进一步描述的。
术语"分离的"包括从最初环境例如天然环境中取出的材料，如 果它是天然发生的话。例如，存在于活的动物中的天然发生的多核苷 酸或多肽就不是分离的，但是从天然系统中的一些或全部共存材料分 离到的同样的多核苷酸或多肽就是分离的。这些多核苷酸可以成为载 体的一部分，和/或这些多核苷酸或多肽可以成为组合物的一部分，而 它们仍然是分离的，因为这些载体或组合物不是天然环境的一部分。 如在此使用的，分离的材料或组合物也可以是"被纯化的"成分，艮P, 它并不要求绝对的纯化，相反，它是一个相对的定义。从文库中获得 的单种核酸可以照惯例提纯到电泳同质。在可替代的方面，本发明提 供可以从基因组DNA或文库中或别的环境中的别的序列中提纯的核 酸，其纯度提高至少一、二、三、四、五或更多的数量级。
如在此使用的，术语"重组子"可以包括与"骨架"核酸相邻的 核酸，而在天然环境中它并不与骨架核酸相邻。 一方面，核酸具有5 %或更多的核酸"骨架分子"中的核酸插入物数目。根据本发明的"骨架分子"包括核酸，例如表达载体、自我复制核酸、病毒、整合的核 酸、和用于保持或操作感兴趣的核酸插入物的别的载体或核酸。 一方 面，富集的核酸代表着，在重组骨架分子中核酸插入物数目占10%，
15%, 20%， 30%， 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%或更多。"重组"多肽或蛋白是指由重组DNA技术产生的多肽或 蛋白；例如，由编码所要的多肽或蛋白的外源DNA构建物转化的细胞 所产生的多肽或蛋白。"合成的"多肽或蛋白质是通过化学合成制备的 多肽或蛋白，如以下详细描述。
启动子序列可以"有效连接到"编码序列，这样，在启动子处启 动转录的RNA聚合酶将把该编码序列转录成mRNA，如以下进一步讨 论。
"寡核苷酸"包括可以用化学合成的或者单链的多脱氧核苷酸或 者双矮的互补多脱氧核苷酸。这样合成的寡核苷酸没有5'磷酸，所以 在没有激酶利用ATP增加磷酸基团的情况下，