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抑制褪黑素分泌对青春期前大鼠NE、E的影响及滋阴泻火方药的作用
优质期刊推荐大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）ELISA 试剂盒使用说明书中国教育装备采购网围观128次我要分享我要投稿大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用
目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）含量。实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）水平。用纯化的大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），再与HRP标记的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）浓度。试剂盒组成：试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保存说明书 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1个 1个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存标准品：27ng/mL 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存浓缩洗涤液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为18 ng/mL，12 ng/mL ，6ng/mL，3 ng/mL， 1.5 ng/mL）。2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物请避光保存。7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9．本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释
倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释
倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。2.批内与批见应分别小于9%和15%检测范围：
0.7ng/mL -22ng/mL
保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6个月相关下载：来源：作者：
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益母草水苏碱对NE诱导的新生大鼠心肌细胞肥大肌浆网钙摄取功能的影响
在体外培养的心肌细胞中研究益母草水苏碱对心肌细胞肌浆网钙摄取功能的调控作用。　　
1、心肌细胞的培养:采用“双酶联合”法来消化心肌组织，90min差速贴壁消除成纤维细胞，细胞培养的第3天，进行形态观察、存活率鉴定、活力分析等。　　
2、NE诱导心肌肥大模型的制作与鉴定:心肌细胞原代培养48h后，在培养液中加入NE进行造模。心肌细胞培养第5天收集细胞时，分别进行心肌细胞存活率、活力分析等，同时测定NE诱导的细胞蛋白质浓度、DNA浓度及其比值。　　
3、益母草水苏碱(Sta)的有效性及剂量关系:在确定Sta有效的基础上，心肌细胞原代培养48h后，然后将细胞如下分组:①对照组；②NE组，给予NE10-6mol/L诱导心肌细胞肥大；③在NE存在的基础上，加入不同剂量的Sta。观察心肌肥大的相关指标。　　
4、益母草水苏碱对肌浆网钙摄取功能的调控作用:收集培养的心肌细胞，测定心肌细胞肌浆网对钙的摄取能力；测定肌浆网钙泵活性以及蛋白浓度；PLN的蛋白浓度以及p-PLN的蛋白浓度。　　
1、心肌细胞培养结果显示，正常培养的心肌细胞的存活率为95.93％，搏动频率平均为100次/分。达到细胞培养的目的，能满足后续实验的要求。　　
2、NE(10-6 mol/l)作用于心肌细胞3天后，可以造成心肌细胞数目不变(即DNA浓度不变)，心肌细胞蛋白浓度增加，其蛋白/DNA比值增加，从而反映单个心肌细胞发生肥大。　　
3、模型组与不同剂量的益母草水苏碱比较，蛋白浓度和蛋白/DNA的比值都是增加的，说明不同浓度的益母草水苏碱对心肌细胞肥大具有一定的抑制作用，对心肌细胞具有保护作用，也证明了益母草水苏碱的有效性；不同剂量的益母草水苏碱各组之间并无统计学意义，不存在剂量依赖关系。　　
4、①在心肌细胞肌浆网钙的摄取能力方面:模型组的摄取速率为正常组的67％左右，摄取能力和速度有明显的下降，两者相比具有显著的统计学差异(P<0.05)；与模型组相比，益母草大剂量组的钙摄取速率明显提高15％，两者具有显著的统计学差异(P0.05)，但是具有升高的趋势。②心肌肌浆网的钙泵的活性方面:与正常组相比，模型组的钙ATP酶活性明显下降，两者相比具有显著的统计学差异(P0.05)；益母草中、大剂量组的SERCA2a的活性有较大的提高，基本提高都在50％左右，均有统计学差异(P<0.05)。③在SERCA蛋白浓度方面，各组之间并无统计学差异。④在PLN蛋白浓度和磷酸化蛋白浓度方面:两者的变化趋势是一致的。与正常组相比，模型组PLN、磷酸化的PLN的蛋白浓度都比正常组显著低，两者具有显著的统计学差异(P<0.05):与模型组相比，不同剂量的益母草水苏碱对PLN、磷酸化的PLN蛋白浓度都有所增加，说明益母草水苏碱可以不同程度的提高磷酸化的PLN蛋白浓度。　　
1、益母草水苏碱能降低NE诱导的新生大鼠的心肌肥大细胞的蛋白质浓度、蛋白/DNA比值，对心肌细胞具有一定的保护作用。　　
2、益母草水苏碱提高NE诱导新生大鼠心肌细胞肌浆网对钙的摄取能力，提高SERCA的活性而蛋白浓度不变、、提高PLN的蛋白浓度和p-PLN的蛋白浓度，但是不同浓度的益母草水苏碱之间并无剂量依赖关系。可能机制为益母草水苏碱就是通过提高肌浆网上的磷酸化的PLN浓度来增加SERCA活性，使心肌肌浆网的钙摄取能力提高，调整心肌肥大细胞钙浓度在正常水平范围内，随后通过一系列传导途径，抑制了心肌细胞的肥大，对心肌细胞具有一定的保护作用。
学科专业：
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