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&&&&&&&&&&&&　　同济大学生命科学与技术学院的高绍荣（Shaorong Gao）教授，近期在iPS细胞及转基因小鼠研究中连续取得突破性成果，两篇研究论文相继发表在《Scientific Reports》和《Stem Cells Translational Medicine》杂志上(延伸阅读：)。
Na&ve Induced Pluripotent Stem Cells Generated From β-Thalassemia Fibroblasts Allow Efficient Gene Correction With CRISPR/Cas9. Stem Cells Transl Med. 2015 Dec 16. pii: sctm.
在这篇文章中，高绍荣教授与同济大学的王译萱( wangyixuan)副教授领导团队，利用β-地中海贫血患者的成纤维细胞生成了原始态（Na&ve）诱导多能干细胞(iPSCs)，并证实在这些细胞中采用CRISPR/Cas9基因组编辑系统可以有效完成基因修正。
常规的始发态（primed）胚胎干细胞和iPSCs显示出不同于原始态多能干细胞的分子和生物学特征。尽管原始态多能干细胞显示出更高的自我更新能力和多向分化能力，目前尚不清楚是否可以用患者的体细胞直接生成原始态多能干细胞，以及它是否优于始发态iPSCs。
在当前的研究中，研究人员利用建立的5i/L/FA系统，将一位β-地中海贫血患者的成纤维细胞直接重编程成为了非转基因且具有基态多能性分子标记的原始态iPSCs。这些原始态的iPSCs可以有效地生成跨物种嵌合体。
重要地是，研究人员利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统证实，相比于对应的始发态iPSCs，这些原始态iPSCs显示基因修正效率大大提高。此外，他们还证实通过非侵袭性方式收集的泌尿细胞可以直接生成人类原始态iPSCs，由于容易获得这些细胞，其代表了进一步临床试验一种极好的细胞资源。
由此，研究结果证实了利用这种原始态的患者特异性iPSCs来进行疾病建模、基因编辑及用于未来临床治疗的可行性和优越性。
Efficient Generation of Mice with Consistent Transgene Expression by FEEST.Scientific Reports 5, Article number: 1)doi:10.1038/srep16284
在这篇文章中，高绍荣教授与北京生命科学研究所的陈良（Liang Chen）研究员合作，证实采用一种叫做FEEST的技术可有效生成转基因一致表达的小鼠。
转基因小鼠模型被广泛应用于生物医学研究中；然而由于转基因表达的不可预知性，当前的转基因小鼠构建技术有限。
研究人员报告了一种新型高效的技术，可用于生成单拷贝整合转基因，保证表达目的基因(GOI)的转基因小鼠。研究人员将这一技术命名FEEST（functionally enriched ES cell transgenics）。利用包含可诱导Cre基因的ES细胞，他们能够在Cre介导重组前利用潮霉素来有效选择出转基因ES细胞。并在Cre重组后通过分析GFP证实GOI的表达。
作为一种原理证明，研究人员构建出了包含Cre可激活tTA (cl-tTA6)的转基因小鼠品系。这一tTA小鼠模型在与包含强力霉素可诱导癌基因的一个转基因小鼠品系杂交时能够诱导肿瘤形成。他们还证实这种cl-tTA6小鼠是一种有价值的工具，能够真实重演临床肿瘤形成过程。通过构建条件性激活EGFR L858R转基因小鼠模型，他们还证实FEEST很容易适用于其他的基因。
因此，研究结果证实了FEEST是一种有潜力在基因组水平上构建转基因小鼠模型的强大技术。
作者简介：
同济大学生命科学与技术学院教授
研究方向与主要学术成就：
主要利用体细胞核移植与诱导多能干细胞技术从事哺乳动物早期胚胎发育和体细胞重编程分子机制与干细胞研究。与中科院动物研究所周琪实验室在2009年分别独立报道了iPS小鼠的研究成果，从而在世界上首次证明了iPS细胞的真正多能性，被美国TIMES评为2009年世界十大医学突破之一。最近的研究证明DNA羟甲基化酶Tet1可以有效替代Oct4将体细胞重编程为iPS细胞并进一步阐释了其分子机制，而所形成的T-iPS细胞可以经四倍体补偿产生iPS小鼠并且没有肿瘤的发生。已经在包括Science, Nature Genetics, Cell Stem Cell, PNAS, Human Molecolar Genetics, Stem Cells等国际知名学术期刊发表论文60余篇。
荣誉：2013&& 国家杰出青年科学基金2011&& 周光召基金会“杰出青年基础科学奖”2009&& 第三届药明康德生命化学研究奖
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转基因技术在动物遗传改良上的应用进展
□ 刘中华 王华岩 乔宪凤 郑新民
摘　要:简要介绍了几种比较常用的转基因方法，包括显微注射法、脂质体介导法、电转染法、胚胎干细胞法、病毒载体法、精子载体法、卵巢直接注射法。传统的转基因方法与基因打靶、体细胞核移植、RNA干扰以及线粒体转移技术相结合．在基因功能研究和疾病治疗中发挥越来越重要的作用。特别是近年来在植物上出现的外源基因清除技术．为我们在动物上彻底去除外源基因的影响提供了新思路。
　　摘要：简要介绍了几种比较常用的转基因方法，包括显微注射法、脂质体介导法、电转染法、胚胎干细胞法、病毒载体法、精于载体法、卵巢直接注射法。传统的转基因方法与基因打靶、体细胞核移植、RNA干扰以及线粒体转移技术相结合，在基因功能研究和疾病治疗中发挥越来越重要的作用。特别是近年来在植物上出现的外源基因清除技术，为我们在动物上彻底去除外源基因的影响提供了新思路。
　　关键词：转基因技术；动物；外源基因：遗传改良
　　中图分类号：Q812；S813 文献标识码：A 文章编号：09)02-0481-06
　　动物转基因技术是将外源基因导入人或动物细胞内，使外源性基因整合在染色体基因组上并稳定的传给下一代。1976年。Jaenisch等利用反转录病毒感染胚胎的方法进行基因转移，这是最早的动物转基因方法的应用。随后各国研究者相继在小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、山羊、鸡、蛙、鱼类等动物上获得成功，使用的方法也不尽相同，包括显微注射法、脂质体介导法、电转染法、病毒载体法、精子载体法等。传统的转基因方法与前沿的生物学技术如基因打靶、体细胞核移植、RNA干扰等相结合，越来越显示了其强大的生命力。随着转基因动物技术的发展，转基因产品已经广泛渗透到医疗、卫生、农产品和食品等中。
　　1　动物转基因技术
显微注射法
　　显微注射法(microiniection)是指通过显微操作仪将外源基因注入受体动物受精卵的细胞核中，外源基因整合到受体细胞染色体上，发育成转基因动物的技术。1980年，Gordon等L2)利用显微注射的方法将构建的HSV-Tx融合基因转入小鼠的基因组，在得到的78只仔鼠中有2只为转基因动物。1982，Palmiter等L3)应用显微注射技术成功地将大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄原核中，获得了整合并表达外源性生长激素的超级转基因“硕鼠”。
　　显微注射法是发展最早、使用最为广泛也是最，为有效的转基因方法之一。Zhu等利用显微注射法生产出转sFat-I基因小鼠。Tang等利用此法制备㈩乳腺中可表达重组抗CD 20抗体的转基因小鼠、Manoi等将TAIL-PCR技术用于分析显微注射导致的整合位点不确定中，进一步拓展了该方法的应用范围。目前，利用此方法已成功的生产出了小鼠、兔、绵羊、猪、牛、鱼和鸡等各种转基因动物。
脂质体介导法
　　脂质体(liposome)特别是阳离子脂质体(cation-ic liposome)目前是实验室进行转基因研究的一种常规方法。该方法具有生产简便、毒性低、无感染危险等优点。有别于其他类型的脂质体，阳离子脂质并不将DNA包裹在其脂质双分子层中，只需将二者直接混合即可得到一种稳定的复合物——liooplexes，因此，复合物的形成不受DNA体积大小的限制。
　　自Muramatsu等将电转染(eleetroporation)应用于小鼠睾丸细胞获得成功以来，电转染目前已成为基因转移的高效且常规的手段之一。董菊子等对转染前孵育温度、渗透压、电转染参数、细胞周期等对电转染效率有影响的因素进行了系统研究，摸索出电转染的合适条件。Umemoto等将pCA GGS-lacZ基因电转染小鼠睾丸并设计了一系列对照，结果电转染对小鼠后代的数量并无显著影响。Nataeha等川’在研究改进一种新的WISH方法时也使用了电转染方法。
胚胎干细胞法
　　胚胎干细胞(ESC)是从早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系，注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎形成嵌合体，直至达到种内嵌合，因此可将其作为一种载体，导入外源基因，获得转基因动物。Capeeehi等首先对小鼠ES细胞进行了基因打靶，然后将此打靶的ES细胞移植进入小鼠囊胚，将此重组胚移植进入代孕母鼠，最后产出嵌合体仔鼠，通过相互交配获得基因敲除的纯合小鼠。ES细胞介导技术是公认的研究基因转移、基因定位整合的一类极有前途的实验方法。此法可使受体动物细胞中基因整合率达到50％，其中生殖细胞整合率达30％。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。
　　1．5　病毒载体法
　　目前使用较多的是逆转录病毒感染法(retro-virus-mediated gene transfer)。该方法是利用逆转录病毒DNA的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中。携带外源基因的逆转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。1974年，Jaenish等将SV40 DNA注入小鼠囊胚腔中，发现获得的小鼠体内有SV40 DNA整合。次年，他又成功地用鼠白血病病毒(MuLV)作为载体，将外源基因导入小鼠胚胎。1990年，Harvcy用猫白血病病毒作为载体，也成功地将外源基因导入去透明带的羊胚胎中。目前，逆转录病毒载体已广泛应用于各种动物的转基因研究中。
　　另一种常用的是腺病毒感染法(adenovirus-mediated gene transfer)。科学研究者已经对这类载体进行了3次改造，使其在外源DNA装载容量、安全性、外源基因表达的稳定性和转染效率等方面得到了很大提高。Matthias等利用腺病毒将转化多能干细胞的4个必需基因转染到小鼠的正常细胞内，腺病毒直接作用于蛋白质而不是染色体，不会改变宿主DNA，并且经过几次分裂后就会被清除，因此不会对细胞产生危害。通过这种方法，研究者已经从大鼠皮肤细胞、胚胎肝细胞以及成熟肝细胞成功且安全地诱导出了多能干细胞。
　　总的来说。病毒介导的基因转染效率高，可携带大片段的DNA进行转移，但其靶向性和组织特异性差。生物危害比较大，可引起感染及炎症反应，因此其应用受到一定程度的限制。
精子载体法
　　早在1971年，Brackett等研究发现，兔精于和3H-胸腺嘧啶标记的SV40 DNA共温育，在精子头部的顶体后区可检测到放射性物质存在，当这些精于和CV-1肾细胞融合后可以分离到具有感染性的SV40病毒，这些证据显示兔精于具有吸附外源DNA的能力。1989年Lavitrano等首次利用小鼠附睾精于与DNA温育产生转基因小鼠，称之为精于介导的转基因法(SMGT)。Sato等通过直接注射外源DNA到小鼠睾丸内完成转基因，发展了一种新的转基因途径，即睾丸介导的转基因法(TMGT)。Sato等向小鼠睾丸内注射台盼蓝和Hoechst33342染料，发现这些染料1min内即可通过附睾头导管传遍睾丸网。Shen等直接向雄兔睾丸内注射携带绿色荧光表达的外源DNA及二甲基亚枫的介质，使DNA能够进入睾丸细胞和生精细胞，1个月后用处理的雄兔与雌兔交配，所产后代中56％的仔兔能高效地表达所导入的外源基因，Ko-jima等rD将携带报告基因LacZ的腺病毒载体直接注射到小鼠睾丸内，之后利用PCR、RT-PCR、免疫组化对其生殖系细胞和后代进行检测，发现腺病毒载体只能感染非生殖细胞，不能传给下一代，因而研究者可以将腺病毒介导的转基因技术应用于体细胞功能障碍引起的雄性不育研究中。
卵巢内直接注射
　　人们在研究利用精于作为载体进行动物转基因同时，也试验了雌性生殖系统转基因的可行性、Gordon率先尝试向小鼠卵巢内直接注射包含报告基因LacZ的腺病毒载体。结果表明腺病毒载体不能感染卵子，这种载体在雌性生殖系转染效率是很低的。两年后，Sato等将质粒DNA注射到小鼠卵巢中并进行体内电转染，转基因效率变化较大(8％～60％)。Yang等直接对小鼠的卵巢注射表达质粒plRES-EGFP，得到了转基因小鼠，检测后代的阳性率达54％，并且发现获得的转基因小鼠6代以内都具有较好的遗传稳定性。
动物转基因技术的应用
基因打靶与转基因
　　基因打靶(cerie targeting)是基因同源重组技术的一种，就是利用同源重组的原理，用外源性DNA定点修饰改造染色体目的基因的方法，包括基因敲除(knock out)和基因敲入(knock in)技术。基因打靶实际上是转基因学、同源重组和胚胎干细胞3种技术结合的产物。
　　Brown等成功地在人正常二倍体成纤维细胞中敲除了p21基因，揭示了p21与细胞衰老间的关系。Chan等在HC7116细胞系中成功敲除了14-3-3σ基因，证明该基因在DNA发生损伤后参与维持G2期检验点并阻止细胞死亡。但质粒载体转入细胞及整合进特异位点的效率较低，增加了试验的成本和操作的复杂性。重组腺相关病毒(rAAV)载体的出现在一定程度上克服了上述缺点。Topaloglu等分别利用质粒载体和腺病毒相关载体对人直肠癌细胞系p53基因进行打靶，结果显示腺病毒相关载体打靶效率是质粒载体的25倍。人们在常规基因打靶的基础上引入Cre/loxP系统，建立了一种可以在特定的发育阶段和特定的组织细胞中开启或关闭特定基因的时空特异性基因打靶(spatiotempo-ral gene targeting，STGT)技术。He等用Syn-Cre小鼠研究大脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体在癫痫发病中的作用，Lin等构建Ksp-Cre小鼠特异性地敲除肾脏上皮细胞纤毛蛋白KIF3A和转录因子HNF-1B，均采用了该技术。
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金月芽期刊网 2018现代生物技术发展----转基因技术 现代生物技术发展----转基因技术 ----摘要： 转基因技术是 20 世纪 80 年代初发展起来，主要就是将外源基因或体外重组的基因结构转移到 动物受精卵内组成新的融合基因。使其在动物体内整合和表达，产生具有新的遗传特征或性状的动物， 并能将新的遗传信息稳定遗传给后代， 获得转基因系或转基因群体， 或者将外源基因在特定调控元件作 用下在某些宿主组织中进行独立的复制， 并在一定时间内表达外源蛋白。 文章综述了体细胞核移植技术、 慢病毒载体法、转座子介导的基因转移法、RNA 干扰介导的基因敲除法和锌指核酸酶-基因打靶技术等 近年发展起来的方法。而近来诱导多能干细胞(iPS 细胞)的成功为尚未获得 ES 细胞的大动物建立多能 干细胞系提供了一种新的方案, 为转基因动物研究开创一片更广阔的天地。 文章在前人研究的基础上重 点总结了以上各种转基因技术的最新研究动态并对各种转基因技术的特点进行了探讨。 关键词: 转基因技术; RNAi; 基因打靶[4]1997 年, Willmut 等 通过体细胞核移植技术制备出了世界上第一头哺乳动物转基因克隆绵羊, 开 创了哺乳动物体细胞核移植的先例。 这项技术为转基因动物的制备开辟了崭新的天地, 转基因技术研究 进入了新的发展历程。 近年来, 随着转基因技术研究的继续深入, 出现了许多动物转基因新技术、 新方法。 包括慢病毒载 体法、RNA 干扰介导的基因敲除法、锌指核酸酶-基因打靶技术。这些技术方法不仅提高了转基因动物 的制备效率, 同时使转基因动物的基因表达调控更加精确。 而近来诱导多能干细胞(iPS 细胞)技术在在 小鼠、恒河猴、人、大鼠和猪这些物种上的成功对那些还未建立 ES 细胞的物种建立多能干细胞系提供[5]了一种新的方案,也将给这些物种的胚胎干细胞的建立、基因修饰动物的产生带来新的希望 , 显示了 iPS 细胞技术在转基因动物研究领域的巨大前景。1转座子介导的基因转移法利用转座子可以在基因组内插入和切离并改变自身位置的特性, 使之能携带外源基因整合到动物 基因组内, 从而制作转基因动物。1951 年, McClintock 在玉米中首先发现转座子, 直到 50 年之后, McClintock 的工作才得到科学界的肯定, 荣获 1983 年的诺贝尔生理学医学奖。 此后, 转座子及其相关 技术得到迅速地发展, 成为生物基因功能分析的有效工具之一。Fadool 等将 mariner 元件成功地转入[7]Mariner 元件 了斑马鱼中, 并实现了种系传递。 Sang 等 将 mariner 元件成功地对鸡进行了种系转化。1[2]对斑马鱼和禽类种系转化的成功为转基因动物制备提供了新的有效基因导入方法。Ivics 等 根据积累 的系统发生数据, 将鲑鱼基因组中一个已经失活的转座系统进行分子重建, 获得了睡美人(sleeping[3]beauty) 转座子。Dupuy 等 将带有 GFP 基因的 SB 转座子线性化后, 与体外转录的编码 SB10 转座酶的 mRNA 一同注射入小鼠的单细胞胚胎, 转入的外源基因通过生殖细胞传递给后代。PiggyBac 转座子首次 在杆状病毒浸染粉纹夜蛾 Trichoplusiani TN-368 细胞株系中发现。 利用 PiggyBac 转座子构成的载体[4]辅助质粒系统已成功地获得了转基因地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕。丁N等 首次报道 PiggyBac 转座 子系统能在哺乳动物细胞和小鼠中高效转座, 并成功培育出带有荧光的转基因小鼠, 从而在世界上首 次建立一种高效的哺乳动物转座系统, 具体图解见图 3。PiggyBac 转座子属于 DNA 转座子。PiggyBac 转座子在转座酶作用下, 切出和插入发生在特征性(TTAA)核苷酸序列目标位点, 使其在动物体内能进 行准确转座, 目前是哺乳动物中转座活性最强的 DNA 转座子。 近年来, 利用转座子技术进行转基因动物[5]功能研究得到了迅速的发展。Wu 等 利用 PiggyBac 与 Cre-loxP 系统相结合培育出大量基因突变老鼠[6]并进行了广泛的功能基因研究。Woltjen 等开展利用 PiggyBac 转座子对细胞进行重编程的研究, 研究人员利用来自病毒的 2A 肽序列生成一种结合重编程因子的“多顺反子载体”, 该载体被 piggyBac 转座子载体送入细胞中, 从而在人和小鼠成纤维细胞中都生成了稳定的 iPS 细胞。 然后, 又从已经生成 的 iPS 细胞系中除去与 2A 结合的重编程因子。此项研究开发了一种更安全的 iPS 细胞制备方法。 较之传统的基因剔除和化学诱变等方法, 转座子介导的基因转移法整合效率高, 承载容量大, 可 同时携带多个基因, 且转基因以单拷贝形式整合, 易于模拟内源基因的表达, 同时易于确定整合位点。 但在基因组中转座子的移动(转座)可诱导剪切和插入位点的突变, 以可移动 DNA 片段作为载体尚存在[7]转移基因结果的不稳定性和与内源跳跃基因相互作用的可能性。 Klattenhoff 等 认为, 生殖细胞对 而 转座子特别敏感, 为了给遗传物质向下一代的传递提供更多的忠实性, 某些多细胞真核生物进化产生 了基于 RNA 的令生殖细胞转座子沉默的途径。这使得基于转座子介导的基因转移法又困难重重。2体细胞核移植技术[4]1997 年, Wilmut 等 利用成年绵羊乳腺上皮细胞作为核供体, 然后将其移植到去核的卵母细胞中, 重构胚胎经过激活和培养后, 移植到代孕动物中, 成功获得了体细胞克隆绵羊多莉(Dolly), 具体图[6]解见图 1。此项成果拉开了动物体细胞克隆技术的序幕。随后, Schnieke 等 通过体细胞核移植, 率先[7] [8]在世界上培育了表达人凝血因子的转基因克隆绵羊。Cibelli 等 获得了转基因牛, Macháty 等 得到[9]了转基因猪。在国内, 此研究领域也得到了快速地发展并达到了国际领先水平。龚国春等 成功地获得[1] [1]了我国首例转基因体细胞克隆牛。张运海等 获得我国第一头体细胞克隆猪。杨鹏华等 首次成功培育[2]出第一批乳铁蛋白转基因奶牛。 Yang 等 构建亨廷顿蛋白转基因载体, 运用体细胞核移植技术, 成功获2得 6 头亨廷顿舞蹈症转基因猪。 该研究成果表明运用转基因技术建立人类遗传性疾病的转基因大动物模 型的重要性。 体细胞核移植许多环节, 从而减少受体动物的数目, 不需要用受技术的突出优点是可以在细胞水 平上早期验证修饰事件, 简化了转基因动物生产的体母畜来承担那些非转基因的胚胎, 表现了强大的 生命力。 且产生的转基因后代遗传背景及遗传稳定性一致, 不需选配即可建立转基因群体, 具有很大的 优越性。 但由于体细胞核移植技术涉及核质互作核重编程等复杂过程, 产生的转基因后代部分个体表现 出生理或免疫缺陷。且传统核移植操作程序复杂, 对设备和技术要求较高。3 慢病毒载体法慢病毒属于逆转录病毒科。 慢病毒感染宿主细胞后, 病毒 RNA 反转录为 DNA 后可以整合到宿主细胞 的染色体上并长期稳定表达。 慢病毒能感染分裂细胞和静止细胞, 不易诱发宿主免疫反应, 因此成为有[3]效的基因转移载体。近年来, 慢病毒载体法, 制备转基因动物被广泛应用。Pfeifer 等 用重组绿色荧 光蛋白(GFP)慢病毒感染小鼠 ES 细胞和桑椹胚, 发现早期胚胎和出生后仔鼠稳定表达 GFP, 具体图解[4]见图 2。同年, Lois 等 利用慢病毒载体法成功制备转基因小鼠和大鼠。他们在 GFP 基因下游连接旱獭 肝炎病毒转录后调控元件(WRE), 以提高 GFP 基因的转录水平。将病毒液进行受精卵卵周隙注射, 注射[5]后胚胎移植到假孕母鼠体内, 所产仔鼠 86%携带 1 个以上 GFP 转基因拷贝。 Hofrnann 等 利用慢病毒载[6]体法首次成功制备绿色荧光蛋白转基因猪,[7]McGrew 等 报道利用该方法高效制备了转基因鸡,效率比以往任何方法高出 100 倍。 Sasaki 等 通过自我失活的慢病毒液进行受精卵卵周隙注射, 首次培育出 了带有增强的绿色荧光蛋白(EGFP)转基因的非人类转基因灵长类动物―普通狨猴, 在国际上引起了巨[1] [6]大轰动。张敬之等 也利用慢病毒载体法成功制备 GFP 转基因小鼠。Niu 等 利用基于猿猴免疫缺损病 毒的慢病毒载体成功获得转基因猕猴。 慢病毒载体法的优点是外源基因的整合率较高; 外源基因多属单拷贝整合; 宿主范围广。 但是慢病 毒载体容量有限, 外源基因片断长度通常小于 10 kb, 因而转入的基因很容易缺少其邻近的调控序列, 同时慢病毒 DNA 序列可能会干扰外源基因的表达, 以致整合后的表达率低。且外源基因难以植入生殖 系统, 所得转基因家畜大多为嵌合体, 需要广泛的杂交, 以建立转基因系。 携带外源基因的病毒载体在 导入受体细胞基因组过程中有可能激活基因组 DNA 序列上的原癌基因或其他有害基因, 安全性令人担 忧。4 RNAi 介导的基因敲除法3RNA 干涉(RNAi)是一种普遍存在于绝大多数生物体内序列特异性的转录后基因沉默机制(PTGS),[8]它通过一段双链 siRNA 或单链 miRNA 导致同源靶 mRNA 降解, 从而阻断目的基因的表达。 Fire 等首次阐明此现象为转录后沉默机制, 通过注射与秀丽新小杆线虫机体同源基因(靶基因)的双链 RNA 阻断了[9]靶基因的表达, 并将其命名为 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)。Elbashir 等 首次报道哺乳动物 培养细胞中通过 siRNA 成功诱导了特异性靶基因表达沉默, RNAi 技术成功地从植物研究发展到哺乳动 物的相关研究上。Hasuwa 等[30]首次报道成功建立了 RNAi 转基因小鼠, 其利用 RFP 作为 RNAi 载体导 入的报告基因, 向表达 GFP 小鼠中导入表达 siRNA 的 shRNA 质粒, 获得没有 GFP 表达而有 RFP 表达的[3]转基因小鼠, 具体图解见图 4。Jagdeece 等 利用核移植克隆法与 RNAi 技术相结合, 成功获得体内不[3]繁殖猪内源性逆转录病毒(PERV)的转基因猪。杨志峰等 构建了针对 IKKα基因 RNAi (敲低)的慢病毒 载体, 并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,[3]获得携带该载体的转基因小鼠模型, 转基因小鼠外周血细胞IKKα mRNA 表达量明显降低。Li 等 报道了 siRNA 制备的新方法, 通过构建质粒 pAd-hTR(human telomerase RNA, hTR), 将 pAd-hTR 转染 哺乳动物细胞系 HEK-293, 获得了携带有 hTR 靶向的 siRNA(Ad-hTR-siRNA)腺病毒, 证明了 hTRsiRNA 在 HeLa 细胞系中能有效特异地进行端粒酶的敲除, 从而指出了这种 siRNA 表达重组腺病毒系统在癌症 基因治疗方面的前景。 与传统的基因敲除方法相比, RNAi 的方法具有明显优点――高效、周期短、特异性强和操作简 单, 因此 RNAi 可以作为一种简单有效的代替基因敲除的工具。通过制备针对靶基因 mRNA 不同区段的 siRNA 转基因动物, 有可能获得对靶基因不同程度的缄默效果, 从而可以模拟动物数量遗传性状。但 RNA 干扰载体导入率不高, 很多设计的 dsRNA 不能产生抑制靶基因转录后沉默的效果, 且不能产生稳 定地干涉作用。 RNAi 的研究中, 研究人员一般利用逆转录病毒传递编码 shRNA 的基因。 在 有研究表明, 大量的 shRNA 会阻断细胞 miRNA 路径, 影响内源性正常 miRNA 的水平和活性。5基因打靶技术基因打靶技术是基于同源重组原理, 使外源 DNA 定点整合到靶细胞的特定基因座上, 对动物基因 组进行精细地修饰和改造的技术, 其具有位点专一性强和打靶后目的片段可以和染色体 DNA 共同稳定[4]遗传的特点。Thomas 等 首先对小鼠胚胎干细胞(ES 细胞)进行了基因打靶, 然后将此打靶的 ES 细胞 移植进入小鼠囊胚, 将此重组胚移植进入代孕母鼠, 最后产出嵌合体仔鼠, 通过相互交配获得基因敲 除的纯合小鼠。 在大家畜体内至今还没有成功获得胚胎干细胞系, 因此在大家畜上主要结合克隆技术与[5]体细胞基因打靶技术来产生转基因动物。McCreath 等 首先在成纤维细胞中进行基因靶位操作, 用体[3]细胞核移植生产出了基因打靶绵羊。Lai 等 运用基因打靶结合克隆的方法制作出了敲除α-1, 3-糖苷4[7]转移酶的转基因猪。Kuroiwa 等 通过敲除牛朊蛋白( PRNP) 基因制作了无疯牛病的牛。在家禽上, van[8]de Lavoir 等 对原始生殖细胞(PGC)进行基因打靶, 获得携带能表达绿色荧光蛋白基因的打靶载体, 将其注入孵化 3 d 发育至 13~15 d 的鸡胚内, 获得 8 只公雏, 成长后与母鸡交配产生 7 只生殖腺有转入[3]外源基因和带有绿色荧光的转基因雏鸡。Tong 等 利用大鼠胚胎干细胞首次成功建立了 p53 抑癌基因 敲除大鼠模型。 这一突破解开了 20 多年来 “无法用基因敲除的方法来构建大鼠疾病动物模型” 的难题, 使得这种“与人类更接近”的动物能更好地为人类疾病研究效力。 基因打靶技术克服了随机整合的盲目性和偶然性, 整合位点精确、表达水平高, 是一种理想的修 饰、 改造生物遗传物质的方法。 但这一方法在技术上仍有一些问题, 主要是基因打靶的效率太低, 产生 的串联重复序列不稳定, 能自发进行二次同源重组, 对此尚须进一步的研究。6展 望通过转基因技术，除了能提高动物的生长速度外，还可改变乳的成分、改善肉质、增加产毛量。与 提高家畜生产性能和改善畜产品质量一样，利用转基因技术提高动物的抗病性具有十分乐观的应用前 景。 利用转基因动物生产某些具有生物活性的蛋白质， 即建立动物生物反映器是当前转基因动物研究的 热点。转基因生物反映器具有投资少、成本低、产量大等优势。转基因技术经过大约 30 年的发展日渐 成熟。 随着动物转基因领域新的研究方法不断涌现, 转基因技术的应用范围也不断扩展, 相续取得新进 展、 新突破。 动物转基因技术的研究成果在改善肉奶质量, 生产生物医药产品以及人类疾病模型的建立, 特别是在治疗人类的疑难病症方面都显示出了广阔的应用前景。 转基因动物已深刻影响到农业、 畜牧业、 医药业等许多重要领域, 同时也推动了生命科学研究的发展。因此, 充分利用转基因技术的潜在价值, 实现转基因技术实用化、商业化和转基因动物的产业化, 是科学工作者努力的目标。参考文献[1] Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, Mycock K, Scott AR, Ritchie M, Wilmut I, Colman A, Campbell KHS. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts.Science,
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