副主任医师
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出院前血小板5万以上，一个星期后下降至一万多
状态：就诊前
&副主任医师
1)目前激素剂量已经很大了，如果还不能自主上升，要考虑激素冲击治疗。之前建议近一周复查1到2次血小板计数，确定确实血小板数量又下降了。建议做一次骨髓穿刺，评价产生血小板的巨核细胞有无问题。
2）有些时候红斑狼疮的患者出现血小板下降比较顽固，这时候需要进一步调整治疗方案。
&副主任医师
我刚回北京。如果两天内复查一次血小板仍然这么低，就回协和吧，做好再次住院的准备。
状态：就诊前
谢谢王大夫，向您报告一下现在的病情：我十一月三十日血小板1万又住院输血小板一个丙球10克一日后血小板2•9万。用丙球10克五天。5号血小板7•8万。现吃激素60毫克已21天。纷乐仍2片。钙尔奇2片。
1、如停用丙球以后血小板再降至多少激素冲激？还是用骁悉停纷乐？剂量？
2进口激素是否作用更好？付作用小？用法？
3、前天做骨密度腰椎稍低，加其它钙剂吗？
4、如血小板继续升至多少？维持几天？激素开始减量？
&副主任医师
1. 如血小板再降至2万以下，可以考虑冲击；免疫抑制剂等大方向定了以后再说；
2. 不推荐进口激素，作用是强些，但不良反应也突出，特别是脸型改变；
3. 可以加点双磷酸盐类的药物，如福善美；
4. 血小板这个水平已经很好了。激素到一个月就减量吧
状态：就诊前
王大夫您好！我出院后15号查血小板11•3万。昨天下午开始不知什么原因很头痛？能用药吗？他克莫司血药浓度出来了吗？谢谢！
状态：就诊前
真情寄语：
一句问候，一声祝福，一切如愿，一生幸福，一世平安，一帆风顺！
&副主任医师
先监测一下血压。我现在家无法查化验结果。可能已经直接回到病案室了。明天上班时看一下。
状态：就诊后
门诊/住院患者报到
13-01-03找王迁大夫就诊的x***患者，成功报到病历号：w***（保密）医生诊断疾病：系统性红斑狼疮门诊或住院患者：住院最近一次就诊日期：治疗情况：保守治疗（药物）最近一次大夫门诊做的检查项目：肝肾功能、血尿常规、免疫全项最近一次就诊时大夫给的处置方案：每天强的松40毫克、他克莫司4毫克
状态：就诊后
王大夫您好！我感冒已好，血压监测都在正常范围。15日开始持续性头痛头闷（前额），精神欠佳，今天好转。尿常规正常。是药物原因吗？
状态：就诊后
王大夫您好，我从1月3日出院，1月23日激素减至一日6片，已经服用一个月；他克莫司胶囊1月20日开始服用1mg一次，一日两次，1月31日加量至2mg一次，一日两次至今；另外一直服用纷乐一日两片，钙尔奇D一日两片，维生素C一日6片。
1.药是否可以减量，如何减？
2.需要多久复查一次，平时都需检查什么项目？
&副主任医师
如果血小板正常，激素可每周减半片，至每日3片维持。他克莫司可减至一天三次，一次1mg。
&副主任医师
每月一次血常规，肝肾功即可。
状态：就诊后
王大夫您好，我5月5日查血常规，肝肾功能均正常，血小板15.4万。
现FK506一日3次，1mg/次；激素一日3片已经吃3周；纷乐一日两片；钙尔奇D和维生素c每日各两片。
1•药量是否可以减，如何减？
2•还需检查什么，多久查一次，下回什么时候复查？
&副主任医师
1)激素可1周后减至2片半；
2)他克莫司可减至一日2次，1mg/次；
3)上次来随诊后半年复诊。
状态：就诊后
王大夫 我到北京复查，遇到您停诊，想问一下都需要复查哪些项目？
&副主任医师
血常规、尿常规、肝肾功能、血沉、CRP、Ig、补体、ANA＋抗dsDNA
状态：就诊后
王大夫，我的复查结果已经出来，都比较正常，现在激素2.5片／天，纷乐2片／天，fk506每天两次每次1mg，钙尔奇2片／天，维生素c 2片／天。问题：1.药可以减吗？如何减？2.下次何时复查，都查什么项目？
状态：就诊后
真情寄语：
中秋佳节，送您一个圆圆的祝福……愿：好事圆圆！好梦连连！祝：中秋快乐！月圆人更圆！
状态：就诊后
真情寄语：
送上我感恩的心，感谢您温馨的关怀、无私的帮助！
疾病名称：系统性红斑狼疮血小板减少医生不确定&&
病情描述：疾病：系统性红斑狼疮
病情描述：女,41岁。我宫颈活检出血不止，妇科住院治疗血止住了，发现血小板28转血液科治疗，血小板最高提到63.骨穿发现有巨核细胞成熟障碍，身上没有出血点，皮...
疾病名称：系统性红斑狼疮：主要是血小板减少&&
希望得到的帮助：我住在湖北宜昌，想问挂号是当天来挂可以挂到您的号吗？
病情描述：在日因呼吸道发炎导致发烧，检查血常规，发现血小板是15，就开始住院检查，后主要发现右肾中度损伤，开始尿蛋白定量7克多，并未做肾穿，诊断为肾病综合征，从十颗激素开始，到2017年...
投诉类型：
投诉说明：（200个汉字以内）
王迁大夫的信息
各种风湿性疾病常见病（如类风湿关节炎、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、干燥综合征...
王迁，北京协和医院风湿免疫科副主任医师、副教授、硕士生导师。2002年毕业于中国协和医科大学 临床医学（八...
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风湿免疫科【图文】提高血小板数量的饮食偏方_百度文库
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提高血小板数量的饮食偏方
&&羊脊骨汤
羊脊骨(连尾)1条,肉苁蓉10g,菟丝子10g,葱、姜、盐适量。将羊脊骨碎成块;肉苁蓉酒浸一夜,刮去粗皮;菟丝子酒浸3日晒干,捣末,用水适量,放入羊脊与苁蓉,同炖至熟透,调入菟丝子末及调味品。此为1日量,分2次空腹食之。
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你可能喜欢血小板流式细胞术分析PLATELET FLOW CYTOMETRY ASSAYS流式细胞术是血小板分析研究最好的方法，该法可提高检测灵敏度、并减少人为因素的干扰，该法可以精确地检测病人血小板生成方面的情况，即使血小板计数很低时也可检测表面标记。血小板ＲＮＡ含量　（网织血小板）血小板ＲＮＡ含量与血小板生成状态相关，他可以区分是因为骨髓抑制或外周破坏增加引起的血小板减少。在化疗后或移植后，网织血小板可以监测巨核细胞和血小板生成状态。血小板相关免疫球蛋白（ＰＡ－ＩｇＧ）已经确认，血小板相关免疫球蛋白和ＩＴＰ及其它免疫性血小板破坏疾病相关。与血小板结合的ＰＡ－ＩｇＧ　数量检测结果，可以作为临床诊断依据，这比其它单一检测方法更有价值。血小板表面标记活化前的静息血小板表面抗原的低表达与血小板聚集功能降低相关。表面抗原相关的血小板聚集功能减弱可以是先天的（血小板无力症Ｇｌａｎｚｍａｎｎ’ｓ　ｔｈｒｏｍｂａｓｔｈｅｎｉａ　；巨大血小板综合征，Ｂｅｒｎａｒｄ－Ｓｏｕｌｉｅｒ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＢＢＳ）也可以是后天获得的（脊髓发育不良，　白血病，　再生障碍性贫血，骨髓抑制或毒性）。常用表面标记有，ＣＤ４１　（ｇｐ　ＩＩｂ／ＩＩＩａ），　ＣＤ４２ａ　（ｇｐＩＸ），　ＣＤ４２ｂ　（ｇｐＩｂ），　ａｎｄ　ＣＤ６１　（ａｖｂ３，　ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）。活化血小板检测活化血小板表面会出现一些新的标记。主要的有两个ＰＡＣ－１　（活化的　ＩＩｂ／ＩＩＩａ）和　ＣＤ６２Ｐ　（Ｐ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ），　它们是对临床有用的活化血小板标记。此外还有ＣＤ３１　（ＰＥＣＡＭ）和　ＣＤ６３　（ａ　ｌｙｓｏｓｏｍａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ），也是有用的两个活化标记，并已在临床应用。血小板活化研究的全血标本收集要求使用　１９　ｇａ．　（或更大）针头，开始吸出的２ｃｃ血注入试管（或弃用），然后将后续血液轻轻注入另一个试管。血小板生理血小板（platelets ， thrombocyte）是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质。巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总数的0.05%，但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。每个巨核细胞均可产生个血小板。正常成年人的血小板数量是000个/uL （150-350×109/L）。血小板有维护血管壁完整性的功能。当血小板数减少到50000个/uL （50×109/L）以下时，微小创伤或仅血压增高也使皮肤和粘膜下出现血瘀点，甚至出现大块紫癜。可能由于血小板能随时沉着于血管壁以填充内皮细胞脱落留下的空隙；而且，用同位素标记血小板示踪和电子显微镜观察，发现血小板可以融合入血管内皮细胞，因而可能对保持内皮细胞完整或对内皮细胞修复有重要作用。当血小板太少时，这些功能就难以完成而产生出血倾向。循环血液中的血小板一般处于“静止”状态。但当血管受损伤时，通过表面接触和某些凝血因子的作用，血小板转入激活状态。激活了的血小板能释放一系列对止血过程必需的物质。 生成血小板的巨核细胞也是从骨髓中的造血干细胞分化发展来的。造血干细胞首先分化生成巨核系祖细胞，也称巨核系集落形成单位（colony forming unit-megakaryocyte ， CFU-Meg ）。祖细胞阶段的细胞核内的染色体一般是2-3倍体。当祖细胞是2倍体或4倍体时，细胞具有增殖能力，因此这是巨核细胞系增加细胞数量的阶段。当巨核系祖细胞进一步分化为8-32倍体的巨核细胞时，胞质开始分化，内膜系统逐渐完备。最后有一种膜性物质把巨核细胞的胞质分隔成许多小区。当每个小区被完全隔开时即成为血小板，一个个血小板通过静脉窦窦壁内皮间的空隙从巨核细胞脱落，进入血流。巨核细胞增殖、分化的调节机制类似于红细胞系生成的调节，至少受两种调节因子分别对两个分化阶段进行调节。这两种调节因子是：巨核系集落刺激因子（Meg-CSF ）和促血小板生成素（thrombopoietin ，TPO ）。巨核系集落刺激因子是主要作用于祖细胞阶段的调节因子，它的作用是调节巨核系祖细胞的增殖。骨髓中巨核细胞总数减少时促使该调节因子的生成增加，Meg-CSF 是一种低分子糖蛋白，分子量约为46000，它与促血小板生成素具有完全不同的免疫学性质。促血小板生成素也是一种糖蛋白，当血流中血小板减少时，促血小板生成素在血液中的浓度即增加。该调节因子的作用包括：增强祖细胞的DNA 合成和增加细胞多倍体的倍数；刺激巨核细胞合成蛋白质；增加巨核细胞的总数，结果增加了血小板的生成。根据去肾大鼠出现血小板减少时血液中促血小板生成素的浓度不增加的事实，推测肾是产生促血小板生成素的部位。小血管损伤后血液将从血管流出，但在正常人，数分钟后出血将自行停止，称为生理止血。用一个小撞针或注射针刺破耳垂或指尖使血液流出，然后测定出血延续的时间，这一段时间称为出血时间（bleeding time）。出血时间的长短可以反映生理止血功能的状态。正常出血时间为1-3分钟。血小板减少，出血时间即相应延长，这说明血小板在生理止血过程中有重要作用；但是血浆中一些蛋白质因子所完成的血液凝固过程也十分重要。凝血有缺陷时常可出血不止。生理止血过程包括三部分功能活动。首先是小血管于受伤后立即收缩，若破损不大即可使血管封闭；主要是由损伤刺激引起的局部缩血管反应，但持续时间很短。其次，更重要的是血管内膜损伤，内膜下组织暴露，可以激活血小板和血浆中的凝血系统；由于血管收缩使血流暂停或减缓，有利于激活的血小板粘附于内膜下组织并聚集成团，成为一个松软的止血栓以填塞伤口。接着，在局部又迅速出现血凝块，即血浆中可溶的纤维蛋白源转变成不溶的纤维蛋白分子多聚体，并形成了由血纤维与血小板一道构成的牢固的止血栓，有效地制止了出血。与此同时，血浆中也出现了生理的抗凝血活动与纤维蛋白溶解活性，以防止血凝块不断增大和凝血过程漫延到这一局部以外。显然，生理止血主要由血小板和某些血浆成分共同完成。血液离开血管数分钟后，血液就由流动的溶胶状态变成不能流动的胶冻状凝块，这一过程称为血液凝固（blood coagulation）或血凝。在凝血过程中，血浆中的纤维蛋白源转变为不溶的血纤维。血纤维交织成网，将很多血细胞网罗在内，形成血凝块。血液凝固后1-2小时，血凝块又发生回缩，并释出淡黄色的液体，称为血清。血清与血浆的区别，在于前者缺乏纤维蛋白原和少量 参与血凝的其他血浆蛋白质，但又增添了少量血凝时由血小板释放出来的物质。血浆内具备了发生凝血的各种www.wenku1.com物质，所以将血液抽出放置于玻璃管内即可凝血。血浆内又有防止血液凝固的物质，称为抗凝物质（anticoagulant ）。血液在血管内能保持流动，除其他原因外，抗凝物质起了重要的作用。血管内又存在一些物质可使血纤维再分解，这些物质构成纤维蛋白溶解系统（简称纤溶系统）（fibrinloytic system）。在生理止血中，血凝、抗凝与纤维蛋白溶解相互配合，既有效地防止了失血，又保持了血管内血流畅通。血小板的止血功能因血管创伤而失血时，血小板在生理止血过程中的功能活动大致可以分为两段，第一段主要是创伤发生后，血小板迅速粘附于创伤处，并聚集成团，形成较松软的止血栓子；第二段主要是促进血凝并形成坚实的止血栓子。（一）血小板粘附与聚集止血中较松软的血小板止血栓子的形成，　要经过血小板粘附与聚集两个过程。血管损伤后，流经此血管的血小板被血管内皮下组织表面激活，立即粘附于损伤处暴露的胶原纤维上。参与血小板粘附过程的主要因素包括：血小板膜糖蛋白Ｉ（ＧＰＩ）、ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷ因子）和内皮下组织中的胶原。当血小板缺乏ＧＰＩ或胶原纤维变性时，血小板粘附（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ　ａｄｈｅｓｉｏｎ）功能便受损。发生血小板粘附过程的可能机制是ｖＷ因子再与血小板膜上的特异受体结合。此外，血小板膜上的糖苷移换酶活性和胶原蛋白分子的构型与粘附也有着密切关系。粘附主要是一种表面现象，粘附一旦发生了，血小板的聚集过程（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）也随即发生。聚集是指一些血小板相互粘连在一起的过程。聚集开始时，血小板由圆盘形变成球形，并伸出一些貌似小刺的伪足；同时血小板脱粒，即原来贮存于致密颗粒内的ＡＤＰ、５－羟色胺等活性物质被释放。ＡＤＰ释放和某些前列腺素的生成，对聚集的引起十分重要。１．ＡＤＰ的作用　在体外实验中看到，ＡＤＰ是使血小板聚集最重要的物质，特别是从血小板释放出来的这种内源性ＡＤＰ尤其重要。在血小板悬液中加入小量ＡＤＰ（浓度在０．９μｍｏｌ／Ｌ以下），能迅速引起血小板聚集，但很快又解聚；若加入中等剂量的ＡＤＰ（１．０μｍｏｌ／Ｌ左右），则在第一聚集时相结束和解聚后不久，又出现第二个不可逆的聚集时相，这是由于血小板释放的内源性ＡＤＰ所引起的；若是加入大量ＡＤＰ，则迅速引起不可逆的聚集，即直接进入聚集的第二时相．以不同剂量的凝血酶加入血小板悬液，也可使血小板发生聚集；而且与ＡＤＰ相似，随着加入剂量的逐渐增加，可看到从只有第一时相可逆性聚集，到出现两个时相的聚集，再到直接进入第二时相的聚集．因为，用腺苷阻断内源性ＡＤＰ的释放或用腺苷三磷酸双磷酸酶（ａｐｙｒａｓｅ）以破坏ＡＤＰ，均可抑制凝血酶引起的聚集，说明凝血酶的作用可能是由于凝血酶与血小板细胞膜上的凝血酶受体结合后，引起内源性ＡＤＰ释放所引起的。加入胶原也可引进悬液中的血小板聚集，然而只有第二时相的不可逆聚集，一般认为这也是由于胶原引起内源性的ＡＤＰ释放所致。一般能引起血小板聚集的物质均可使血小板内ｃＡＭＰ减少，而抑制血小板聚集的则使ｃＡＭＰ增多。因而目前认为，可能是ｃＡＭＰ减少引起血小板内Ｃａ２＋增加，促使内源性ＡＤＰ释放。　ＡＤＰ引起血小板聚集，还必须有Ｃａ２＋　和纤维蛋白原存在，而且要消耗能量。将血小板悬浮于缺乏葡萄糖的溶液中数小时，或用药物阻断或减弱血小板产生ＡＴＰ的代谢过程，均将抑制血小板的聚集。ＡＤＰ也不能使洗净了的血小板聚集，除非加入纤维蛋白原；但凝血酶和胶原可使洗净了的血小板聚集。因为在这种情况下，可使血小板α颗粒内的纤维蛋白原释放。ＡＤＰ是通过血小板膜上的ＡＤＰ受体引起聚集的。目前认为，血小板膜上有表面ＡＴＰ酶，这是防止血小板相互粘聚所必需的，而ＡＤＰ可抑制表面ＡＴＰ酶的活性；ＡＤＰ还可使血小板暴露出磷脂表面，因而可以通过Ｃａ２＋“搭桥”而互相粘聚。２．血小板前列腺素类物质的作用　血小板质膜的磷脂中含有花生四烯酸，血小板细胞内有磷脂酸Ａ２。在血小板被表面激活时，磷脂酶Ａ２也被激活。在磷脂酶Ａ２的催化作用下，花生四烯酸从质膜的磷脂中分离出来。花生四烯酸在血小板的环氧化酶作用下，产生前列腺素Ｇ２　和Ｈ２　（ＰＧＧ２、ＰＧＨ２）。ＰＧＧ２和ＰＧＨ２都是环内过氧化物，有很强的引起血小板聚集的作用。但是ＰＧＧ２和ＰＧＨ２都很不稳定，可以直接生成小量ＰＧＥ２和ＰＧＦ２。ＰＧＨ２　可以在血栓素合成酶的催化作用下，形成大量血栓素Ａ２（ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ　Ａ２，ＴＸＡ２）。ＴＸＡ２　使血小板内ｃＡＭＰ减少，因而有很强的聚集血小板的作用，也有很强的收缩血管的作用。ＴＸＡ２也不稳定迅速转变成无活性的血栓素Ｂ２（ＴＸＢ２）。咪唑（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）可抑制血栓素合成酶，所以有防止血小板聚集的作用。此外，正常血管壁内皮细胞中有前列腺环素合成酶，可以催化血小板生成的ＰＧＨ２　生成前列腺环素（ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ，ＰＧＩ２）。ＰＧＩ２可使血小板内ｃＡＭＰ增多，因而有很强抑制血小板聚集的作用，也有很强的抑制血管收缩的作用。ＰＧＩ２也很不稳定，迅速变成无活性的６－酮－ＰＧＦ１ａ。关于由花生四烯酸衍变成ＴＸＡ２与ＰＧＩ２的过程可参看下图。图　　血小板前列腺素与血栓素的合成在发现ＴＸＡ２和ＰＧＩ２之后，曾设想在正常情况下可能是血管壁的ＰＧＩ２与血小板的ＴＸＡ２之间保持了平衡，因而使血小板不致聚集。可以设想，血管损伤暴露内皮下组织时，一方面激活血小板和激活内源性凝血途径，损坏的血管组织释放凝血因子Ⅲ又激活外源性凝血途径，于是在此局部迅速形成凝血酶；另一方面血管损伤使局部血管壁ＰＧＩ２减少。这样，由此血管通过的血小板即粘附于损伤处的胶原纤维上，随即血小板也发生变形、聚集，并激活磷脂酶Ａ２，导致合成ＴＸＡ２，ＴＸＡ２可使血小板内ｃＡＭＰ减少而游离Ｃａ２＋增多，以致血小板脱粒释放内源性ＡＤＰ，又使更多的血小板聚集，迅速形成松软的止血栓子。（二）血小板与凝血血小板对于血液凝固有重要的促进作用，如将血液置于管壁涂一薄层硅胶的玻璃管中，使血小板不易解体，虽然未加入任何抗凝剂，血液可保持液态达７２小时以上；若加入血小板匀浆则立即发生凝血。这说明血小板破裂后的产物对于凝血过程有很强的促进作用。　血小板表面的质膜结合有多种凝血因子，如纤维蛋白原、因子Ⅴ、因子Ⅺ、因子ⅩⅢ等。α颗粒中也含有纤维蛋白原、因子ⅩⅢ和一些血小板因子（ＰＥ），其中ＰＦ２和ＰＦ３都是促进血凝的。ＰＦ４可中和肝素，ＰＦ６则抑制纤溶。当血小板经表面激活后，它能加速凝血因子Ⅻ和Ⅺ的表面激活过程。血小板所提供的磷脂表面（ＰＦ３），据估计可使凝血酶原的激活加快两万倍。因子Ⅹａ和因子Ⅴ连接于此磷脂表面后，还可以免受抗凝血酶Ⅲ和肝素对它们的抑制作用。当血小板聚集形成止血栓时，凝血过程已在此局部进行，血小板已暴露大量磷脂表面，为因子Ⅹ和凝血酶原的激活提供了极为有利的条件。血小板聚集后，其α颗粒中的各种血小板因子释放出来，促进血纤维的形成和增多，并网罗其它血细胞形成凝块。因而血小板虽逐渐解体，止血栓子仍可增大。血凝块中留下的血小板有伪足伸入血纤维网中，这些血小板中的收缩蛋白收缩，使血凝块回缩，挤压出其中的血清而成为坚实的止血栓，牢牢地封住血管缺口。在表面激活血小板和血凝系统时，同时也激活了纤溶系统。血小板内所含的纤溶酶及其激活物将释放出来。血纤维和血小板释放的５－羟色胺等，也能使内皮细胞释放激活物。但是由于血小板解体，同时释放出ＰＦ６和另一些抑制蛋白酶的物质，所以在形成血栓时，不致受到纤溶活动的干扰。流式细胞术计数网织血小板1969年Ingram 和Coopersmith 在对失血性犬的外周血经新亚甲蓝染色后的镜检中，观察到部分血小板中有网状的染色物，被命名为网织血小板（reticulated platelet，RP ）。被认为是反映骨髓血小板产生状态的有用指标，引起了广泛关注。近年来体内外实验证实，RPs 是新释放入血循环中的新生血小板，是最为年轻的血小板，对凝血酶原受体激动肽（TRAP ）刺激有更强的反应性，膜表面表达更多的CD62P ，具有较高的止血活性，半衰期约24h 。因此，外周血RPs 水平被认为是反映体内血小板生成能力的指标，在临床上可作为判断血小板生成能力极有价值的指标。由于RP 的目视显微镜计数费时、费力，尤其在血小板减少症时更难，从而影响了RP 计数的开展和应用。1990年以来，用流式细胞仪和网织细胞自动检测仪，实现了RP 的半自动和自动计数，简便、准确，使其在临床得到较为广泛应用，已成为血小板减少症的病因诊断和治疗效果评价不可缺少的指标。网织血小板检测的临床意义1．用RP 的相对百分率反映外周血中血小板的更新状态以往多用平均血小板体积（MPV ）来反映外周血中血小板的更新状态，一般情况下，板龄越小，其体积越大。但血小板体积受内外条件影响较大，因此MPV 不是很理想的指标。因为网织血小板是含有较多RNA 的新近生成并释放入外周血的血小板，因而近些年的研究都用测定RP 来反映外周血中血小板的更新状态。1997年Himmelfarb 等在观察了透析治疗病人（包括腹膜透析和血液透析）的血小板总数和RP 后指出，透析病人的RP 明显增加，而血小板总数变化不大，表明外周血的血小板更新加速，以提供透析时血小板的损耗。很多临床研究已观察到TO+血小板与血小板的生成相关，从而提供了一个简便的方法以区分血小板减少症的生成或破坏机制。2．血小板减少症时的RP一些常见血小板减少症时（特发性血小板减少性紫癜ITP 、急性再生障碍性贫血AA 、骨髓增生异常综合征MDS 、多发性骨髓瘤 MM ）RP 百分率均明显增加，尤以ITP 为甚。表　血小板减少症的网织血小板（RP ）比率 对象正常对照ITPAAMDSAML 例数 418 73 24 28 10 血小板数（×109/L） 216±50 50±25 34±19 42±29 43±2065±1643±26 RP （%） 0.79±0.42 3.37±2.10** 2.64±2.90 2.68±2.36* 1.40±1.80 1.50±0.60 2.30±1.80* ALL 14 MM 9*P<0.05，**P<0.012．1　特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP ）Kienast 和Schmitz 于1990年首先应用流式细胞和荧光染料噻唑橙检查，发现正常对照组网织血小板的百分率为（8.6±2.8）%，而在巨核细胞增加或数目正常的ITP 患者，网织血小板的百分率明显升高，达（25.9±10.9）%。有学者研究了一组病例，其中15例ITP ，20例急性淋巴细胞白血病（ALL ），10例再生障碍性贫血（AA ），27例健康正常儿童。正常组网织血小板为（7.9±2.9）%，ITP 患者为（32.9±10.2）%，ALL 患者为（6.6±3.1）%，AA 组为（3.4±2.0）%，ITP 患者网织血小板计数与其他组比较差异明显，而其他组之间差异不明显。网织血小板增加，反映骨髓血小板的生成能力较好。循环中的网织血小板的百分率与周围血的血小板计数成反比，血小板逐渐升高时，网织血小板逐渐降至正常。对于临床表现典型的ITP 患者，可以不进行骨髓检查，采用周围血网织血小板计数辅助诊断。有学者分析了经过固定的富含血小板的血浆，而不是全血，他们发现正常人群网织血小板百分率为（2.9±2.2）%，ITP 患者为（38.6±27.4）%，应用富含血小板的血浆结果更稳定，可以避免网织红细胞内RNA 错误地提高网织血小板的百分率。另有学者观察了不同情况下新生儿网织血小板的变化，>36周的新生儿，其百分率为（4.0±2.4）%，30～36周的新生儿为（4.6±1.7）%，<30周的为（8.8±5.1）%，ITP 的足月新生儿为（36.3±26.1）%，ITP 患儿循环中的网织血小板的百分率较正常增加3～5倍。2．2　肝脏疾病Koike 等研究认为：肝硬化患者血小板生成素生成减少和脾血小板破坏增加是血小板下降的主要原因，肝硬化患者与AA 患者类似，网织血小板的绝对值下降。但AA 时血小板生成素增加。脾功能亢进和异常血小板积聚时，血小板生成不增加，网织血小板对照组为（1.92±1.87）%，肝硬化患者为（1.86±1.85）%。肝硬化患者肝移植后血小板下降，是由于血小板消耗增加及血栓形成所致，移植后网织血小板含量增加，之后出现周围血血小板数量恢复。3．健康新生儿的RP 与孕龄有关孕龄36周新生儿RP （4.0%±2.4%）和30～36周的新生儿RP （4.6%±1.7%）。患免疫性血小板减少症的足月新生儿则明显高于健康足月新生儿。前者RP 达38.3%±23.1%，而在一名血小板生成减低的新生儿血中其RP 百分率（1.5%）和绝对数均明显降低。因而有学者认为测定血中RP 值有助于评价新生儿血小板减少症的原因。4．作为骨髓抑制后血小板的恢复和造血促进因子使用后血小板造血的监控指标川合阳子在对AML 化疗后恢复期血小板和RP 的连续观察中，发现多数病例RP 早于血小板总数4～5天出现增加。1997年Begley 在观察服用巨核细胞生成促进因子后外周血血小板的数量质量中发现，外周血中RP 是最早出现增加的指标。网织血小板可以作为临床应用血小板生成素效果的评价，造血生长因子MPL 配体称之为促血小板生成素或巨核细胞生长因子，临床效果与剂量相关，最大效应在12天。应用该药早期有效的指标是网织血小板计数，用药后3～4天网织血小板即开始上升。化疗后骨髓抑制的患者，该药剂可以促进血小板的早日恢复。5．用于造血干细胞移植和化疗后造血功能恢复的估计Richard 等测定外周血造血干细胞移植和自体骨髓移植情况下网织血小板计数，可作为骨髓造血重建和使用血小板生成素的指征。采用外周血造血干细胞移植的患者，周围血中性粒细胞和血小板恢复的时间比自体骨髓移植明显短，网织血小板是测定骨髓血小板生成的指标。测定10例外周血干细胞移植，6例自体骨髓移植，4例异体骨髓移植的网织血小板计数，在血小板最低时，网织血小板也最低。在血小板恢复之前，网织血小板先恢复。周围血干细胞移植患者，网织血小板值较高，并且峰值出现较早。网织血小板计数与血小板计数有较好的一致性。网织血小板检测原理噻唑橙（thiazol orange，TO ）是一种亲脂性的荧光染料，能迅速通过活细胞膜，与RNA 结合后，荧光强度提高3000倍，利用TO 这一性质很多学者建立了流式细胞仪检测RP%的方法，但尚无统一的标准方法。也有作者提出RPs 内TO 荧光部分来源于血小板内丰富的颗粒内容物。由于使用的TO 浓度不同、孵育时间不同及设定Mark （区分阴性和阳性的界线）的方式不同，报告的参考范围差异非常大。例如，不同作者使用的检测方法中，ＴＯ浓度选择20～1000ng/ml、孵育时间15min ～25h 、参照实验用PBS 对照、自体红细胞对照或健康人血小板对照等，这些关键因素的不确定，影响了不同实验室结果的可比性。在确定Mark 的方法上，多数作者是在网织血小板直方图中，按对照实验中1%血小板的位置确定Mark 。Matic 等最近提出了另一种确定Mark 的方法，即在RP SSC点图上按血小板实际分布状况，沿血小板点图上缘设定Mark ，这种设定Marck 方法比直方图法有更多的优点。实验中我们注意到：在TO 溶液中孵育的血小板随TO 浓度增加和孵育时间延长，其整体荧光强度呈非饱和地增高，5ｈ内未达到平衡，用成熟红细胞（不含细胞器）实验也得到类似的结果。提示TO 染料与血小板存在浓度和时间依赖的非特异性结合，这可能与TO 的亲脂性有关，血小板可能有非特异性浓集TO 的能力，从而导致了血小板在Retic Count直方图上整体位移。因此，我们选择实验条件的依据是：用正常人血小板作参照，在较低浓度TO 和较短的孵育时间内能区分网织化血小板（点图上缘粗糙），同时要求实验结果稳定，保证良好的精密度。虽然提高TO 浓度可缩短孵育时间，但会导致实验条件难以准确掌握，造成实验精密度下降。网织血小板检测方法1990年Kienast 和Schmitz 用TO 作为RNA 的荧光染料，测定含有RNA 的网织血小板获得成功。因作者是使用全血标本，网织红细胞的荧光干扰较大。1992年Ault 等改用富含血小板血浆标本，使RP 测定的准确性大大提高。1995年Richards 和Baglin 对该技术作了较仔细地探讨。用流式细胞仪做RP 计数方法大致如下：（1）制备富含血小板血浆：将EDTA 抗凝全血100×g 离心8min ，取出上层含血小板血浆，1500×g 离心10min ，弃上清液，底层血小板用柠檬酸钠葡萄糖EDTA 缓冲液（pH7.4）再悬浮，并洗一次，再用Tyrode's 缓冲液（含牛血清白蛋白和EDTA ）洗两次，再悬浮在Tyrode's 缓冲液中，调整血小板浓度为100×109/L作为样品。（2）醛化固定:向标本加入1%甲醛，在4℃放置2h 以上，以固定血小板。检测前用Tyrode's 缓冲液洗一次。（3）染色计数：向50μl 经过醛化固定的血小板悬液加450μl 噻唑橙染液，放室温暗处1～2h ，用流式细胞仪测定525nm 波长处的荧光强度，代表RP 数量。同时计数血小板总数，计算得知RP 的比值。这即RP 的半自动计数法。因为该法采用噻唑橙染色，被染色的血小板又称为噻唑橙阳性血小板（TO+血小板）。流式细胞术检测血小板抗体一、基本概念1. 原发性血小板减少性紫癜与血小板相关抗体原发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，简称ITP ），现已经证实本病与免疫有关，因而又称为免疫性或自身免疫性血小板减速少性紫癜（autoimmune thrombicytopenic purpura ，简称AITP ），是较为常见的出血性疾病。临床特点是外周血小板减少，血小板寿命缩短，骨髓巨核细胞正常或增多，脾脏无明显肿大。临床上分急性和慢性两种，前者为自限性，多见儿童，后者成年为主，女性多见。1951年Harrington 等发现ITP 是由一种能够通过胎盘的体液因子引起的。1975年Dixon 首次用定量方法测到ITP 患者血小板表面免疫球蛋白，称为血小板相关抗体（PAIg ），现已证实大多数病人的PAIg 水平升高，并与血小板计数间呈负相关。90％以上病人都有PAIgG 或（和）PAIgM 的增高，以PAIgG 增多为多见。30％~70％的ITP 病人有血小板相关补体PAC 3的增高相关。还有循环免疫复合物（CIC ）与细胞免疫因素及血小板减少也有一定关系。PAIg 包括三种成分：（1）真正的抗血小板抗体。（2）循环免疫复合物。（3）非特异性吸附于血小板表面的血浆免疫球蛋白。同时，PAIg 可分为以下两类：（1）血小板糖蛋白成分（膜分子），为自身抗原；（2）与血小板紧密粘附PAIg 的循环分子（外来抗原），如急性ITP 多发生在病毒感染的恢复期，可能由于血小板表面吸附的病毒抗原产生自身抗体或病毒感染引起的抗原-抗体复合物与血小板结合而产生自身抗体。ITP 病人血浆中有抗血小板抗体，该抗体中95%为IgG ，属7S 的gamma 球蛋白，少量是IgA 和IgM 。抗血小板抗体在56摄氏度仍保持活性。可从病人血小板上洗脱，被正常血小板吸附；它具有种族特异性，对同种血小板具有破坏作用；抗体可透过胎盘引起新生儿血小板减少；由于血小板与巨核细胞具有共同抗原，故该抗体可引起巨核细胞生长，并影响其功能，使血小板生成不良。与抗血小板抗体相关的抗原，为血小板膜上糖蛋白（GP ）。在糖蛋白上有许多抗原决定族对ITP 发病有重要意义，如GPIIb 、GPIIb/IIIa等。ITP 病人B 细胞对正常T 细胞抑制作用敏感。ITP 病人T 细胞抑制功能显著减弱，可能是产生抗体的原因。抗体首先在脾脏产生，以后在骨髓中也可产生。最近发现ITP 病人血清中白介素6升高，认为可能与抗体生成有关。长期以来PAIg 一直是ITP 诊断的一项实验室指标。但大量资料表明，该指标缺乏特异性，升高亦可见于非免疫性血小板减少（如再障、急性白血病、脾亢）。PAIgG 检测的敏感性78%，但特异性只有19%。此外，ITP 病人PAIg 阳性或其升高的程度对治疗方案的确定也无很大的价值。因此，近年来，随着一些检测血小板特异性抗体的检测方法的不断发展，许多人提出同时做PAIg 测定和血小板特异性抗体测定，以提高ITP 实验室诊断的阳性率和可靠性（第十七届国际血栓与止血大会）。各种血小板膜糖蛋白成分均可成为血小板自身抗原。通过蛋白特异性检测可区别免疫性与非免疫性血小板减少，减少骨髓穿刺的次数，对脾切除和免疫抑制治疗有一定指导作用，使治疗更加有的放矢。大多数人认为GP Ⅱb/Ⅲa 为主要的自身抗原，其次为GP Ⅰb/Ⅸ，GP Ⅰa/GPⅡa 、GP Ⅳ均为少数。尽管GP Ⅰb 检出率不高，但它可导致严重型ITP 。有人用活化血小板的单抗sz51检验发现18.5%的ITP 病人体内有抗Ｐ选择素自身抗体，这提示炎症反应和/或血小板活化也可能参与了ITP 的发生发展过程。近年来，又发现抗磷脂抗体也在自身免疫性疾病及其他疾病中占了一席之地，以抗心磷脂抗体（ACA ）研究较多。其它还有抗磷脂酰肌醇抗体、抗磷脂酰丝氨酸抗体、狼疮抗凝物质（LA ）。2．血小板破坏的机制慢性ITP 的血小板破坏是由于血小板抗体与其相关抗原结合后引起的。当血小板抗体以其Fab 片断与血小板相关抗原结合后，抗体分子的Fc 断暴露，并与巨噬细胞的Fc 受体结合，导致血小板被吞噬破坏。通过激活补体系统如C 3裂解产物C 3b 附着血小板表面，与巨噬细胞的C 3b 受体结合也导致血小板吞噬。另外，血小板破坏还可与巨噬细胞的活性水平有关，所以病毒感染时血小板更易破坏。IgM 与补体有更高结合价，1分子IgM 即可激活补体，故IgM 在发病机制中有重要意义。抗体还可引起血小板的功能如黏附功能异常，并损伤毛细血管内皮，均可加重出血。急性ITP 多见于儿童，与病毒感染有关。病毒感染时，巨噬细胞上Fc 受体、C3b 受体增多，亲合性亦增高。故病毒感染时，血小板破坏加剧，ITP 病情更严重。许多ITP 病人还有免疫复合物存在，并与血小板计数成负相关。此免疫复合物，可能是抗体与可溶性血小板抗原或非血小板抗原结合，再通过Fc 受体作用，使血小板破坏。血小板抗体的检测方法与实例[试剂]洗涤缓冲液（PBS/EDTA/BSA）：PBS 缓冲液，含10mM EDTA和0.5% BSA。\抗体：Goat F（ab ）2Anti -Human IgG（Fc Sp.）—R-PE （H10104，Caltag. 为多克隆抗体）阴性对照: Goat F（ab \）2IgG —ＰＥ（１１３０４，Ｃａｌｔａｇ）[仪器与设备]含EDTA 抗凝剂的血液收集管12×75mm 流式标准管（聚丙烯材质）离心机（最大离心力＞７００ｇ）血球计数仪［样本］①正常人血样：１个，血小板数值在正常范围，具体数目不详。②病人血样：２个，为一月龄的双胞胎（婴儿黄和婴儿骆），均为贫血小板，　具体数目不详。［步骤］1. 用含ＥＤＴＡ抗凝剂的血液收集管采血，三个血样均取２ｍｌ分别加到三只流式标准管中。2. 离心１００ｇ×１５ｍｉｎ，将上清（富血小板血浆）转到另外三只流式标准管中。3. 离心７００ｇ×３ｍｉｎ。吸去血浆，用与血浆等体积的洗涤缓冲液重悬血小板。如果必要，可用旋涡混合器混匀。4. 洗涤缓冲液洗涤血小板三次，每次离心７００ｇ×３ｍｉｎ。５．　适量洗涤缓冲液重悬血小板，用血球计数仪测定血小板的浓度，其中正常血样血小板数为２０００／μｌ，婴儿黄的血小板数为６０００／μｌ，婴儿骆的血小板数为７０００／μｌ（稀释后的浓度）。　 ６．每个含重悬血小板的流式标准管分成两管，Ａ管为检测管，Ｂ管为阴性对照管，共六只管。①正常人血样分别取２５０μｌ于两只流式标准管（Ａ管和Ｂ管）中，每管血小板总数为５×１０５。②婴儿黄血样分别取８０μｌ于两只流式标准管（Ａ管和Ｂ管）中，每管血小板总数为４．８×１０５。 ③婴儿骆血样分别取７０μｌ于两只流式标准管（Ａ管和Ｂ管）中，每管血小板总数为４．９×１０５。　７．将上述六只流式标准管，于Ａ管均加５μｌ　Ｇｏａｔ　Ｆ（ａｂ＼）２Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ　Ｓｐ．），Ｂ＼管均加５μｌ　Ｇｏａｔ　Ｆ（ａｂ）２ＩｇＧ。8. 室温，避光孵育15min 。9. 用洗涤缓冲液再洗一次，方法同步骤4。10. 去上清，加0.5ml 洗涤缓冲液重悬，上机分析。[结果]阴性对照正常人婴儿罗血小板功能检测婴儿黄一、基础理论部分当血小板数量增加（血小板增多症）或活力发生改变，便可引起出血或血栓形成。因此，血小板数量与质量的异常是导致出血性和血栓性疾病发生的重要原因，包括一些目前公认的常见疾病，如血小板无力症、巨大血小板综合症（BBS ）、血管性血友病（vWD ）、骨髓增生异常综合征（MDS ）、原发性血小板减少性紫癜（ITP ）、血栓前状态（PTS ）、动脉粥样硬化、缺血性心脏病、急性心肌梗死（AMI ）、脑血管疾病、周围血管病变和静脉血栓形成等。所以，检测血小板功能可为临床疾病的诊断与预防提供更好的途径，对抗血栓治疗的研究尤为重要，同时可对先天性或获得性血小板功能缺陷所致疾病进行病因学研究。目前，分析血小板功能检测的实验与方法很多，现将其研究进展及临床应用简述如下。表　一般性血小板功能测定方法小结实验名称　血小板计数所用仪器　血细胞分析仪分析原理　单个血小板计数应用范围　血小板减少或增多症优缺点　１．快速、简便　２．只能提供血小板体积的平均值　１．快速、简便出血时间测定（ＢＴ）　标准化切口器测定出血时间血小板减少症ｖＷＤ２．反映血小板质与量的异常　３．灵敏度不高　１．操作简便血块收缩试验（ＣＲＴ）无需特殊仪器测定血清析出的体积血小板无力症２．制备富含血小板血浆（ＰＲＰ）复杂、费时活化凝血时间测定全血凝固分析法（ＷＢＣＡ）全血凝固分析仪纤维蛋白原定量　肝素监控实验　血小板功能测定活化凝血时间测定法（ＡＣＴ）　血小板计数比值（ＰＣＲ）快速血小板功能分析法（ＲＰＦＡ）加入白陶土部分凝血凝血分析仪活酶，激活接触活化系统的凝血因子血小板计数仪　快速血小板功能分析仪测定诱导聚集前后血小板数　全自动比浊法内源凝血系统检测监测体外循环肝素用量血小板聚集功能测定血小板粘附功能测定ＧＰⅡｂ／Ⅲａ拮抗剂活性测定　心血管外科　肝素治疗监测１．快速、简便　２．可检测多项指标　３．费用较高１．快速、简便　２．敏感性高　１．无需特殊仪器　２．灵敏度不高　１．快速、简便　２．可用于床旁测定血小板功能检测可分为一般性血小板功能测定（见上表），血小板聚集功能测定和流式细胞术（FCM ）分析。１．血小板聚集功能测定对疑有血小板功能异常的患者可进行血小板聚集与分泌功能的检测。可利用诱聚剂诱导血小板聚集，以检测某些先天性疾病；复杂的可运用免疫学技术检测血小板的分泌功能，其灵敏度和特异性较高，但费用较贵。同时，每个实验室须建立自己的参考值以区分正常及各种异常情况。比浊法：在富含血小板血浆（PRP ）中加入诱聚剂使血小板聚集，血浆浊度降低，透光率增加。记录此变化，形成血小板聚集的动态曲线。将乏血小板血浆（PPP ）所测得的聚集率和透光率视为100%，PRP 的聚集率和透光率视为0%。加入诱聚剂，血小板聚集仪进行动态测量和记录。不同诱聚剂可产生不同类型的血小板聚集曲线。ADP 诱导血小板聚集在低浓度时（3μＭ）是不可逆性聚集，即可引起第二相聚集，其是血小板颗粒内ADP 释放所致。适当浓度的肾上腺素亦可引起双相聚集曲线。胶原引起的聚集曲线与ADP 、肾上腺素不同，加入胶原后，有一段长达1分钟左右是平坦曲线的延缓期，此后，因胶原引起血小板内ADP 的释放及TXA2形成，使血小板快速聚集，而呈现急剧的透光率增加。另外，瑞斯托霉素与ｖWF 相互作用引起血小板GPIIb/Ⅲa 受体激活而导致血小板聚集。因此，瑞斯托霉素作为一种诱聚剂可用于诊断vWD 。比浊法用于评价血小板功能有以下不足：①去除红细胞不能完全反映体内血细胞之间的相互作用；②测定时间过长可致血小板功能降低；③比浊法对小血小板聚集物的形成不敏感，因而只能测量大血小板聚集团；④离心过程会导致血小板激活和红细胞碎片中血小板的丢失；⑤高脂血症的PRP 会影响透光率，减少PRP 与PPP 的差异；⑥需要较多的血液量；⑦血小板数目的调整难以标准化。基于这些原因，利用全血测定血小板聚集功能的方法相继出现。全血法：①全血聚集仪 使用全血电阻抗法，通过记录浸泡于血液电极间的微小电流或电阻变化而形成的聚集曲线，以观察体外血小板聚集变化。这种方法的优点是血液无需离心，但比光学聚集仪耗时，对小聚集物的形成仍不敏感，而且每次测定后，电极需清洗干净，同时连接电极的电线需小心安放，不能弯曲，使其很难满足临床工作的需要。②血小板功能分析仪（Platelet Function Analyzer，PFA ） PFA100系统应用于筛选血小板功能障碍性疾病。此系统使用一次性反应杯，内有一层膜，膜上有一微孔，孔上覆盖着胶原、肾上腺素或ADP 。当抗凝血从膜的小孔中抽吸出来时，血小板在诱聚剂作用下发生聚集并将小孔阻塞，所需的时间称“封闭时间”。PFA 100在诊断止血障碍性疾病优于BT 。③血小板计数法 使用全血进行单个血小板计数法是测定血小板聚集时血小板数目的减少。即将枸橼酸钠抗凝全血保存于37℃，加入含有旋转离心磁棒的聚苯乙烯试管中。用甲醛固定单个血小板，测定血小板基础值。加入诱聚剂后的不同时间，测定聚集后血小板的数目，进行前后比较，得出血小板数目减少的百分率，根据此百分率可得到血小板的聚集率。该方法对小聚集物的形成敏感、迅速，所需样本量少。由于小聚集物的形成十分迅速，因此在那些只能检测大血小板聚集物的方法无法满足的情况下可对每个时间点进行动态计数仪分析，通常从加入诱聚剂30秒后开始到6分钟结束。同时，在进行血小板聚集功能测定时，抗凝剂的选择十分重要。采用一些直接作用于抗凝血酶的抑制物来抗凝，如水蛭素或PPACK 较理想。２．ＦＣＭ测定血小板功能FCM 现已广泛应用于临床测定血小板功能，最近欧洲临床细胞分析委员会保留制定并规范了FCM 测定血小板功能的方法学。FCM 能灵敏、特异的检测血液中活化血小板，并评价其功能。全血法ＦＣＭ传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用样本是经洗涤的血小板或PRP 。由于血小板极易活化，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为导致体外血小板激活，影响实验结果。为此，Shatti 等引入了全血法FCM 。该技术使用全血测定血循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的应答反应。其通过荧光和光散射特性鉴别出血小板后，检测个血小板表面的特异性荧光信号。检测结果可用两种方法表示，一种是平均颗粒荧光强度，另一种是特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率。阳性血小板百分率法与荧光信号的放大倍数无关，且可以检测损伤部位血小板亚群的变化。如果检测的是血小板表面某种抗原的总量，则荧光强度法更为适合。例如，在活化状态下，血小板表面GPIb Ⅸ Ⅴ复合物含量比静息时低，但降低的幅度小，通常还不足以报告阴性结果，这时用荧光强度法比阳性血小板百分率法更合适。与常规血小板功能测定法相比，全血法流式细胞术有许多优点。首先，标本处理的简化能避免血小板体外医源性激活，并防止血小板亚群丢失；循环中的红细胞、白细胞对血小板的活化有影响，因此能在最接近受检者体内环境的条件下测定血小板功能。同时，由于使用血小板特异性单抗检测血小板，而不会受其他种类细胞或碎片的干扰，保证了检测的特异性。其次，在血栓性疾病中，通常只有小部分的血小板被活化；凝血酶体外活化血小板，也常表现为亚群激活；活化血小板表达CD62等膜糖蛋白也有明显的异质性。本法能灵敏地检测出少到1%的活化血小板亚群，尤其是能分析单个或亚群血小板膜上活化标志物的变化，使结果更真实。若同时使用FITC 、PE 、PE CY5 三种荧光染料，本法通过三色标记一次能同时检测两个抗原标记物的变化。做一次FCM 检测仅需2μl 血液，这一点，尤其适合于新生儿和血小板减少性疾病患者。此外，本法不使用同位素，没有放射性污染。全血法ＦＣＭ也存在不足之处。如流式细胞仪价格昂贵，检测费用高，操作复杂。为了避免体外活化，血样需在45分钟内处理。另外，FCM 仅检测循环中的血小板功能，而βTG 、PF4和TXA2的检测可反映血管壁上血小板的活化和近期被清除的血小板。全血中活化血小板检测① 血小板特异性膜糖蛋白检测 先对全血中的血小板膜糖蛋白进行免疫荧光标记，将血小板与血中其他细胞分开。根据血小板特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地识别血小板。② 活化血小板的标志物检测　活化血小板与静息血小板相比，其膜糖蛋白常发生显著变化，其便成为活化血小板的检测标志物。针对血小板表面特异性膜糖蛋白制备的单抗，使血小板特异性标记成为可能。血小板膜糖蛋白已被深入研究，下表显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在这些膜糖蛋白中，仅在血小板膜表面表达主要有GPIb ，GPIIb ，GPIIIa 等有限的几种。根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地识别血小板，仅给血小板做上荧光标记。表　血小板膜上主要的糖蛋白及其功能膜糖蛋白 GPIa/IIa GPIc/IIa GPIc/IIa GPIIb/IIIa Vn 受体 GPIb/IX GPV GPIV GP53 GMP140基因家族 整合素（B 1） 整合素（B 1） 整合素（B 1） 整合素（B 3） 整合素（B 3） LRG LRG选择素配基 胶原FnLamininFb ，vWF ，Vn ，Fn Vn ，?vWF ，?Fn vWF ，凝血酶 ?Thrombospodin功能 粘附 粘附 粘附 聚集 粘附 粘附凝血酶底物 粘附血小板-粒细胞 相互作用注：vWF 血管性假血友病因子；Fb 纤维蛋白原； Fn 纤维粘连蛋白；Vn 体外粘连蛋；LRG 富含亮氨酸家族活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物。活化血小板表面能通过免疫方法检测的标志物可分为三类：第一类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白，如CD62、CD63，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如GPIIb/IIIa（CD41/61）的PAC1表位，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。因此，使用这个表位的荧光单抗，我们能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。另外，GPIV （CD36）虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高；GPIb-IX-V 复合物（CD42）则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低。它们都是活化血小板的分子标志。第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原，包括纤维蛋白原，Xa 因子和thrombospondin 等。这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。与血小板有关的CD 单抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b ，CD42a-d ，CD61，CD62，CD63 ，CD107a-b 等。活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD 单抗。下表列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。表　活化血小板CD 单抗简介CD 单抗 CD36 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62 CD63血小板功能研究还有一些其它方法，有兴趣的朋友可以来电联系或查询其它相关资料。代表性单抗5F1，CIMeg1，ESIVC7 PAC1，7E3，PBM6.4 FMC25，BL-H6，GR-P PHN89，AN51，GN287 Y215，CLB-thromb/1CLB-thromb/6，RUU-SP1.18.1 RUU-SP2.28，CLB-gran/12识别的膜糖蛋白 GPIVGPIIb/IIIa和GPIIb GPI GPIGPIIIaP-selectin 或GMP140 GP53血小板功能研究与临床? 血栓性疾病动脉粥样硬化前期血小板沉积，导致心肌梗塞和中风。抗血小板药能降低心肌缺血的发生率，证明心肌缺血与血小板活化有关。全血法流式细胞术检测表明心绞痛和心肌梗塞患者循环中有活化的血小板，血小板活力也增强。冠状窦血液的检测表明，冠状血管成形术会导致血小板活化。如果血流恢复后有高水平的活化血小板，血管可能因为内皮细胞严重损伤或血小板栓塞而发生再狭窄。因此，活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性。另外，非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和（或）循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷（ADP ）、TXA 2的体外激活能力降低。? 血小板缺陷性疾病全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，如巨大血小板综合征，血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX 复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。巨大血小板从全血中分离很困难。本法能特异性地识别血小板，省去了分离巨大血小板的步骤，使检测更简便、精确。后者由于GPIIb/IIIa复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍。用全血法流式细胞术分析这些分子标志物有助于血小板缺陷性疾病，尤其是不典型病例的诊断。血小板无力症由于GPIIb/IIIa复合物先天缺陷造成血小板聚集功能障碍。以荧光标记抗体CD41（GPIIb ）和CD61（GPIIIa ）进行全血法FCM 分析，其GPIIb/IIIa含量显著减低，可以诊断此病。巨大血小板综合征，是由于GPIb-IX 复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。具有诊断价值的实验室指标有：BT 延长，血小板轻度或中度减少，外周血涂片有巨大血小板，ADP 、肾上腺素、胶原诱导的血小板聚集反应正常，瑞斯托酶素不能引起患者血小板聚集，这种缺陷不被正常血浆所纠正，血小板GPI 缺陷。? 贮存池疾病原发性贮存池疾病（d-SPD ）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法，主观性大，操作繁琐，而且一次检测的血小板数目有限。全血法流式细胞术为d-SPD 的诊断提供了一个简单、迅速的方法，一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比，d-SPD 患者阿的平染色显著下降（从49%降至15%）。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病，也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。? 血小板储存与输注 用P-选择素（CD62）、CD63、GPIIb/IIIa作分子标志物，发现血库中储存血小板有时间依赖性的活化现象。储存5天以上，40%～60%血小板表达活化标志CD62。虽然其形态改变、乳酸脱氢酶泄漏以及ss-TG 的释放也能反映其活化，但用CD62作为储存血小板的质量控制指标最理想。活化的血小板在循环中的存活时间很短。若血小板在储存时活化了，即使输注也不能很好地提高患者止血能力。? 抗血栓药物的监测尽管使用了一些抗血小板药物，如阿斯匹林、潘生丁等，但抗血栓疗效不高，也不能明显降低病人的病死率。近年来文献报道了一些新的抗血栓药，如c7E3 Fab（嵌合单抗7E3的Fab 片断）、合成多肽、Kistrin （一种蛇毒成分）等，能阻断GPIIb/IIIa的功能，在抗血栓方面显示了良好的疗效。临床上已将c7E3 Fab用于冠状血管成形术中，避免术后再狭窄的发生。但是，这些新药价格昂贵，并有不同程度的毒副作用。活化血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗，也可以监测这些抗血栓药物的作用，避免毒副反应的发生。? 血小板减少性紫癜等ITP 患者GP 明显低于正常对照人群，血小板功能受到影响。全血法流式细胞术还可用于检测血小板聚集，研究其免疫表型HPA-Ia ，测定严重血小板减少患者的血小板数目。在尿毒症，心肺分流术（体外循环）中，全血中活化血小板的检测也有临床诊断价值。血小板膜糖蛋白检测本实验用流式细胞术检测了正常人和血液病病人血小板膜糖蛋白，具体介绍如下。【主要试剂】EDTA-Na 2 多聚甲醛TEN 缓冲液（0.05mol/L Tris ，0.15mol/L NaCl ，6mmol/L EDTA-Na2 ，PH7.4） 荧光素标记单克隆抗体（Caltag Lab.）【实验方法】1．静脉采血2ml ，2％EDTA-Na 2抗凝；2．离心100g ，8分钟，分离富含血小板血浆（PRP ）； 3．1％多聚甲醛（终浓度）固定20分钟； 4．离心1500g ，10分钟，吸去血浆；5．以TEN 洗涤血小板，1500g 离心10分钟，共2次； 6．以TEN 调整血小板浓度为300×109/L。7．以下按抗体说明书进行染色操作，上机检测。【流式分析】图1为阴性对照；图2、3为正常人血小板上膜糖蛋白的表达情况；图4为病人血小板膜蛋白表达情况。血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异、灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和反应性，血小板活化实验并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、血小板疾病患者的筛选、预测并发症等方面有良好的应用前景。使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是：　o 检测血小板的反应性。o 了解血小板活化进程：血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到血小板外。　o 同时检测多种血小板表面标志。　o 高度灵敏。o 直接检测血小板的多种标志。　o 使用全血，标本量少。o 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。血小板活化试剂组成o ＰＡＣ－１　ＦＩＴＣ：血小板活化早期的标志物，即活化的 ＧＰＩＩ　ｂ／Ⅲａ复合物，抗体与活化后血小板膜表面的ＧＰＩＩ　ｂ／Ⅲａα复合物纤维蛋白原结合位点相结合。ＢＤＩＳ抗体为ΙｇΜ型，建议使用ＰΑＣ－１结合阻断剂ＲＧＤＳ做阴性对照。o　ＣＤ６２Ｐ　ＰＥ：血小板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内α颗粒含有ＣＤ６２Ｐ，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板表面表达ＣＤ６２Ｐ。o ＣＤ４１　ＴＣ：特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与静止的血小板结合。ＣＤ６１与ＣＤ４１联合，即为血小板表面ＧＰＩＩｂ／Ⅲａ复合物。在本试验中，用ＦＬ３设阈值。试验用品o 采血管：枸橼酸钠抗凝的真空采血管。　o 一次性１２×７５　mm Falcon试管。　o 微量加样器和加样头。o CALTAG 抗体：２－８℃保存。荧光抗体　　FITC 　PE TC对照管　　试验管PAC －１+RGDS　PAC －１IgG １　CD ６２PCD ４１　CD ４１o RGDS （PAC －１阻断剂）：用PBS 配制，１０ｍｇ／ｍｌ。o 血小板激活剂：ADP ，浓度２×１０－４Ｍ，２－８℃保存。也可选用其他激活剂，如PMA 、纤维蛋白、TRAP 。o PBS 缓冲液：含０．１％NaN ３，过滤后２－８℃保存。o 固定液：含１％多聚甲醛的PBS 缓冲液，２－８℃可保存一周。　o 振荡混匀器。o FACS ：进行数据获取。o CaliBRITE Beads/FACSComp软件：FACS 仪器校正，预设获取条件。　o CellQuest 软件：试验数据获取和分析软件。操作步骤1. 标本采集：（１）采血管顺序编号。（２）抽取静脉血，采血管中注入２ｍl 。（３）于１０分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。 2. 血小板激活：（１）试管内加入５０μl ＡＤＰ，４５０μl 全血，轻轻摇匀。 （２）室温孵育５分钟。 （３）立即染色。 3. 荧光抗体染色： （１）Falcon 管编号。（２）在对照管中加入PE 同型对照、CD41 TC、PAC-１各２０μl ，RGDS 加１０μl 。 （３）在试验管中加入三种抗体各２０μl 。（４）在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本５μl 。 （５）轻轻混匀，室温暗处孵育１５－２０分钟。 （６）各管中加入１ml 冷的固定液　（２－８℃），充分混匀，　２－８℃阴暗处放置３０分钟。 （７）２４小时内上机分析。 4. 上机获取数据： （１）开机：o 检查鞘液筒装满，废液筒倒空。　o 先打开流式细胞仪，再打开计算机。　o 仪器气路加压，排空气泡。　o 做FACSComp 。（２）打开CellQuest ，顺序放置对照管和试验管，获取数据：　o 调出获取条件，FSC 和SSC 选择Log 方式。　o 获取条件为CD41 TC阳性。o 使用对照管调整FL １和FL ２的PMT ，使阴性群体位于FL １ vs FＬ２点图左下角。　o 分别使用PAC －１ FITC　／　IgG １ PE / CD41 TC和PAC-１ FITC+ RGDS / CD　６２P PE / CD41 TC调整FL ２-FL １和FL １-FL ２补偿。 o 获取各管的试验数据。　5. 结果分析：在CD ４１ vs SSC点图中设门找血小板群。 CD４１ vs SSC　点图显示有三群，CD ４１阳性／低SSC 一群主要由单个血小板组成，CD ４１阳性／高SSC 一群主要由黏附血小板的血细胞组成，　CD ４１阳性／散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉，因此，不建议使用FSC-SSC 图设门。 在CD ４１　vs SSC点图中找出CD41 TC阳性的血小板群　（单个血小板和黏附在WBC 上的血小板），设门。门内做PAC －１ FITC　vs CD６２P PE点图的双参数分析，统计结果。Unstimulated fresh whoe bloodUnstimulated fresh whole blood（gated on R1）Unstimulated fresh whole blood（gated on R1）注意事项ADP-stimulatedfreshwholeblood（gated on R1）１．采血时请用大号针管，弃用抽出的前２ｍｌ血。　２．尽量避免标本受到物理振动。　３．取血后１０分钟内完成染色操作。４．在Ｆａｌｃｏｎ管中加血标本５ｍｌ，管壁上不能有残留血，未染色的部分会影响试验结果。　５．为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。辅助试剂RGDS ADP 多聚甲醛 PBS 或生理盐水 枸橼酸钠浓度10mg/ml in PBS 0.2mM 1% in PBS用途PAC-1阻断剂，用于PAC-1的阴性质控 活化血小板 固定液 鞘液 抗凝剂全血中活化血小板检测心肌梗塞、脑血管血栓形成、深静脉血栓形成、脑栓塞和肺栓塞等血栓性疾病在中国有很高的发病率，也是致死的重要原因。血小板活化是血栓形成的重要环节，检测血小板的活化状态可辅助诊断和监控血栓性疾病，对判断血栓前状态意义也非常重大。临床现有的用来检测和研究血小板活化或血小板功能的方法都有其局限性。血小板聚集试验可能运会反应出因血小板活化而导致的临床病理症状，但不能直接反映出活化血小板的状态。相对而言，检测血清中的B 凝血因子，血小板因子4和可溶性P 选择素或血清和尿液中凝血代谢物A2可直接反映出疾病引起的血小板活化，但不能检测其中血小板的活化状态。但在这几个检测中没有哪一项可检测血小板的活化程度也不能区分血小板的亚群体。血小板粘附研究则需作半定量检测由此而引发标准化问题。检测B 凝血因子，血小板因子4需要分离血浆，由此极易会引起血小板的体外活化。此外血清中可溶性P 选择素可能来自于内皮细胞。流式细胞仪全血法检测活化血小板就不存在如此诸多的限制。检测时，血小板仍处于其原来的全血生理环境中，（包含红细胞和白细胞，两者对血小板都有活化影响）。极少标本处理过程可有效地减少血小板的体外活化和血小板群体的丢失。可同时检测循环血中血小板的活化状态和血小板之间的相互作用。通过荧光标记抗体，流式细胞仪可检测血小板表面因活化而发生的改变。此外当有新的能与血小板的功能相关的单抗出现可随时运用流式细胞仪。使用流式细胞仪可检测到全血中的1%的活化血小板。检测时只需要5 uL 的全血，适宜新生儿病人。深度的血小板减少症病人也适合用流式细胞进行检测。检测原理血小板活化依赖α颗粒膜蛋白－１４０（ＧＭＰ－１４０）又称ＰＡＤＧＥＭ蛋白，Ｐ－选择素，ＣＤ６３。在静息血小板中ＣＤ６３　分布于α颗粒膜上。血小板经凝血酶刺激后，α颗粒膜迅速与质膜融合而在表面表达ＧＭＰ－１４０，并维持至少１小时，这一特征已被用来鉴定血小板是否被活化，对血栓性疾病临床研究具有一定价值，ＧＭＰ－１４０属于选择素（ＳＬＥＣＴＩＮ）家族，参与细胞粘附过程。活化血小板依赖Ｃａ２＋结合于单核细胞和中性粒细胞，这种作用能够被抗ＧＭＰ－１４０单抗，多抗和纯化ＣＤ６３所抑制提示活化血小板通过表面ＧＭＰ－１４０与中性粒细胞，单核细胞相互作用。ＧＭＰ－１４０ｃＤＮＡ转染的ＣＯＳ细胞能与中性粒细胞和ＨＬ－６０细胞作用，这种作用也能被抗ＧＭＰ－１４０　单抗，多抗和纯化的ＧＭＰ－１４０　所抑制。实验结果表明，ＧＭＰ－１４０识别一种唾液酸化的氨基多糖结构ｌｅｗｉｅｓＸ，抗ｌｅｗｉｅｓＸ的单克隆抗体以及用神经胺酸酶处理细胞都能抑制ＧＭＰ－１４０的结合。ＧＭＰ－１４０介导的活化血小板与中性粒细胞，单核细胞的结合可能参与炎症与血栓的形成，同时浆膜表面的ＧＭＰ－１４０能够促进循环中性粒细胞，单核细胞对活化血小板的清除，此外，在血小板活化时溶酶体膜蛋白也可随脱颗粒反应而表达在血小板膜表面因此，溶酶体膜蛋白（尤其分子量为５３０００）可以作为活化血小板的另一个分子参照指标。活化后的ＣＤ６２Ｐ从血小板ａｌｐｈａ颗粒向细胞膜面移动。这一发现是一过性的，迅速向细胞内移动并在溶酶体被子分解。ＣＤ４１　抗原是整合素αⅡｂ　链，亦称为血小板　ＧＰⅡｂ　与整合素β３链，ＣＤ４１与ＣＤ６１（ＧＰⅢａ）形成复合物ＧＰⅡｂ－Ⅲａ是血小板上含量最多的膜糖蛋白，两个不同的糖蛋白ＧＰＩＩｂ与ＧＰＩＩＩａ在Ｃａ２＋的参与下以１：１　的比例构成复合物，ＥＤＴＡ等Ｃａ２＋络合剂可使复合物解离，ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ复合物是一完整的功能单位，此复合物的解离导致ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ　受体功能的完全伤失。这一复合物被看作纤维蛋白原，纤维结合素Ｖｗｆ，ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　及凝血酶酶感蛋白受体，它表达于血小板及巨核细胞，参与血小板凝集反应。ＣＤ６２－Ｐ　即Ｐ－选择素，分布于凝血酶和组胺活化的血小板和内皮细胞，它介导中性粒细胞和单核细胞对活化血小板和内皮细胞的粘附。它在血小板α－颗粒内和内皮细胞Ｗｅｉｂｅｌ－Ｐａｌａｄｅ　小体内表达。经激活或凝血酶刺激后，此抗原转移到内皮细胞或血小板膜上，可用于检测活化血小板。ＣＤ６３　活化血小板ＧＰ５３　其抗原为５３ＫＤＡ　的溶酶体膜糖蛋白，在血小板激活后跨位于胞膜。它见于单核细胞和巨噬细胞，在粒细胞，Ｔ细胞和Ｂ细胞有微弱表达。ＣＤ６３抗体抑制中性粒细胞对活化内皮的粘附，血小板活化后从溶酶体膜向细胞膜移动，故可检测活化血小板。ＣＤ４２（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）主要分布于血小板和巨核细胞，扁桃体内皮细胞也有报道。属富含Ｌｅｕ　重复体家族，为ＶＷｆ和凝血酶的受体，介导在高度切力下血管损伤部位的血小板粘附和聚集。抽血对于检测活化血小板的实验，抽血是很值得注意的实验步骤。抽血过程中要避免由于血管损伤而释放活化信号激活血小板。对于用来收集血液的真空采血管使用也存在争议，因为血液由静脉被动地注入试管内并停留在试管底部会引起血小板的活化。有数据表明由注射器起的体外活化与用真空采血管相似。抗凝有多种抗凝剂在血小板活化检测中被使用，它们有EDTA ，柠檬酸钠，ACD 和肝素。尽管EDTA 抗凝剂使用最为广泛，但抗凝血在37度中孵育5分钟便会引起血小板的某些蛋白与抗体的结合率下降，如GPIIb/GPIIIa复合体CD41。而在25度环境下，这种变化会变小。EDTA 引起的这种变化可能是由于抗凝剂对GPIIb/GPIIIa复合物形成有形响，从而使血小板表面不能形成复合物或聚集成为更大复合体。此外EDTA 抗凝血随时间会增加血小板的体积。一些使用具有钙离了螯合作用的抗凝剂的血液标本不能用来研究ANNEXIN V与血小板的结合。因为ANNEXIN V是钙离子依赖性染料。尽量避免使用肝素抗凝，因为肝素会引起某些敏感人群的血小板活化。我们的研究发现，能最低限度降低血小板体外活化的抗凝剂是水蛭素，其最终使用浓度是10ug/ml。减少血小板聚集聚集血小板在流式细胞仪可被检测出来。但是，如果血小板发生了聚集，流式细胞仪便不能检测聚集血小板中每个血小板所表达的抗原数量了。这是因为流式只检测每个颗粒的表达荧光而无法区分这个颗粒单个血小板还是由一定数量血小板聚积而成。在准备全血标本时，可依据以下标本处理方法使血小板聚集现象减到最低。对于每个样本都要监测血小板的聚集情况（聚集血小板往往会出现在FS 和SS 坐标中右上象限内）。减少全血标本中血小板聚集的标本处理方法：o 在抽血前准备好所有在标本处理过程中所需试剂，以避免延误时间o 抽血时，针管不要细于21号o 平稳、放松地抽取血液o 弃用前2ml 血液o 使用聚乙稀试管或针筒o 立即与抗凝剂混匀o 不要进行洗涤、离心、过滤、晃动等巨烈的处理步骤o 加入缓冲液稀释血小板浓度o 如果要使用凝血酶作为激活剂，则在其中要加入肽GPRPoo在加入试剂后轻轻混匀，并静置孵育 固定固定检测血小板活化都需要限制血小板自身的或被激活的体外活化。通过抗激活药物（肌苷，潘生丁）或固定方法（通常使用多聚甲醛）都可限制血小板自发或被动活化。固定或许会破化某抗原与单抗结合的位点。如用福尔马林固定标体还会引起血小板的自发荧光，所以在检测中选用恰当的阴性对照。此外，固定的标本中不应存在未结合的抗体，这会引起非特异性结合。建议先将标本与抗体孵育，洗去未结合抗体后固定。然而这会在处理过程引起额外的血小板活化并且这很难控制。对血小板进行固定，对于临床不能立即上流检测的标本来说是极为有利的方法。固定可以减少血小板在体外的人为活化。对于绝大多数抗体来说，使用染色后再固定的方法进行处理的标本立即上机检测与在24小时内分析在荧光强度上没有明显差异。并且固定前染色方法并立即上机检测与固定后24小时内染色分析在荧光强度上也没有明显差异。然而，要注意因固定方法而对标本引起的变化，特别是使用固定前染色的单抗时，因为对于检测血小板活化依赖性单抗，与固定后的血小板结合率会有下降。此外，有些单抗与固定后的血小板结合率会表现出时间相关性减少。所以每个实验室在使用种新抗体时必须选择最恰当的固定方法。使用立即固定法处理血小板方法中存在一不稳定因素：血小板活化的时间依赖性。比如，血小板膜糖蛋白GPIb-IX-V 复合物在血小板活化后30秒表达下降，大约在5分钟时达到最低点，但在45分钟后其表达又恢复至正常水平。血小板活化后而表达增加的GPIIb-IIIa 复合物和CD154也有类似的随时间变化现象。相对而言，尽管体内循环血中血小板在去颗粒化后很快失去其表面P 选择素的表达，但因血小板活化而表达的P 选择素却不会随时间发生改变。检测方法1．先固定后染色1) 将100ul 全血加入1ml 1% 冷(2o C-8o C) 多聚甲醛中(100ul 全血至少可做20tests)2) 2o C-8o C 固定30分钟. (固定的血小板可保存5天)3) 抗体染色前, 1200g室温离心5分钟4) 去上清, PBS洗1次, 1ml PBS重悬5) 取50ul 重悬液, 加适当抗体, 避光孵育15-20分钟6) 加1ml 1% 冷(2o C-8o C) 多聚甲醛, 2o C-8o C 避光30分钟, 但不可超过24小时2．先染色后固定1）5ul 全血加入适当抗体, 避光孵育15-20分钟2）加1ml 1% 冷(2o C-8o C) 多聚甲醛, 2o C-8o C 避光30分钟, 但不可超过24小时3．抗体方案阴性管：加入适量的CD42b-FITC 和阴性对照抗体(对应于CD62-PE 或CD63-PE) 检测管：加入适量的CD42b-FITC 和CD62-PE 或CD63-PE 抗体5．分析1) 用CD42b 表达量和侧向散射光设门来选定血小板选定血小板过去常用的方法是FS （C ）/SS（C ）设门，根据细胞的大小与颗粒度来确定血小板。然而血小板的大小不一，有些血小板较大，容易与红细胞相混淆，尤其当活化时，血小板与白细胞发生粘附，在FS （C ）/SS（C ）图上进入白细胞群，使得一部分血小板丢失，因此应用该法对血小板进行选定不够准确。目前公认的方法是用血小板特异性标志来选定血小板，因无论血小板大小，无论其是否活化，均稳定表达CD41/CD61（GPIIb/IIIa）和CD42a 等，因此可以非常精确地区分血小板。2) 做阴性对照管，调节阳性区的假阳性率为1-2%。3) 做测试管，得出CD62p 的表达率，及血小板活化的百分率。6．注意事项1）. 采血时请用大号针管，抽出的前2ml 血应弃去不用。2）. 尽量避免标本受到物理振动。3）. 取血后10分钟内完成染色操作。4）. 在Falcon 管中加血标本5ul ，管壁上不能有残留血，未染色的部分会影响试验结果。5）. 为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制.6）. 抗凝剂可选用EDTA 或柠檬酸钠, 但不能用肝素, 因肝素对血小板有刺激活化的作用7）. 先固定后染色可降低血小板的自发活化, 避免标本处理过程中的人为活化, 然而有些血小板活化抗原, 如PAC-1, CD62p等在固定剂的作用下会失活, 造成表达率的降低, 因此需要先染色再固定8）. 1987年 Shattil SJ等的经典方法：（1）采血时掌心朝上，轻扎或不扎止血带，肘前静脉采血。先弃除最初的2mL血, 然后再采4.5mL 血入含0.5mL 3.8%柠檬酸钠的抗凝塑料注射器内（2）采血后1分钟内, 将5ul 血加入含50ulPBS 和适量抗体的标本管中, 孵育15分钟（3）500ul PBS稀释, 上机检测。百度搜索“就爱阅读”,专业资料,生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆
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