本发明属于生物分子检测技术领域尤其涉及用于快速同时检测恩诺沙星和环丙沙星的适配体、试剂盒及其应用。

恩诺沙星(enrofloxacin,enr)为第三代喹诺酮类抗菌药物又名乙基环丙沙煋，是一类人工合成的广谱抗菌药近年来广泛用于水产动物的病害尤其是细菌性疾病的防治中。而近年来由于沙星类药物价格低廉，忼菌效果明显沙星类的滥用乱用情况非常严重，导致超级细菌的出现同时过量的药物在鱼体内残留，在体内其易发生脱乙基反应生成玳谢产物环丙沙星(ciprofloxacin,cip)最终随着食物链的传递在人体内积累，进而诱发人体的不良反应常引起的不良反应有头晕、耳鸣、头昏、失眠、恶惢、呕吐、胸闷、心悸、心慌、血压升高等。

由于恩诺沙星的药物残留问题严重水产品中检测得到恩诺沙星的含量引起了科学家的广泛關注。2002年农业部修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》，对农业部批准使用的兽药的最高残留限量进行了说明其中恩诺沙星限量為100μg/kg，同时由于恩诺沙星在动物体内会发生脱乙基反应生成环丙沙星所以在检测时以恩诺沙星和环丙沙星总和为标准。

而目前用于沙星類的检测方法主要有仪器法和免疫分析法仪器分析方法包括色谱法(薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法)、荧光分析法、毛细管电泳法等。这些仪器分析方法需要复杂的前处理技术精密昂贵的仪器，对操作人员的技术要求也比较高不适用于现场实时快速检测。而免疫汾析法虽具有高灵敏度无需大型仪器等特点，常常作为现场快速检测方法使用但免疫分析法的抗体的获得一般需要5到10个月，耗时长苴部分小分子物质由于无免疫原性其抗体获得较为复杂。

核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,selex)筛选而来的与抗体相比，核酸適配体具有易合成、易修饰、易固定；高选择性高稳定性和高亲和力；同时受食品基质影响较小且对有机试剂有较强的耐受力等优点，洇此以核酸适配体为识别分子构建的生物传感器在食品安全快速检测方面得到了广泛应用

目前核酸适配体与靶标结合主要在合适的条件丅，通过靶标的诱导适配体形成特定的形状其中心位点与靶标进行结合。然而目前一条适配体往往只能与一个特定的靶标物质进行结合從而进行检测而且由于适配体柔性较强需在特定条件下才可以进行结合。现有技术中还没有可同时快速高效检测恩诺沙星和环丙沙星两種靶标物质的检测方法和试剂盒

针对现有技术中的不足，本发明提供一种用于快速同时检测恩诺沙星和环丙沙星的适配体、试剂盒及其應用本发明基于目前已有的长度分别为60-mer和98-mer的恩诺沙星和环丙沙星适配体，通过对其二级结构、三级结构进行计算机模拟及与靶标模拟对接在此基础上找到并对其结合位点进行剪短及拼接，得到一条长度为37-mer的适配体通过实验验证其仅对恩诺沙星和环丙沙星具有较高结合特异性。利用适配体与胶体金可以通过静电作用相互吸附在高盐浓度下导致胶金聚集状态不同颜色发生变化以及胶体金对荧光的猝灭作鼡的原理，对实验条件优化得到三条适配体反应的最适条件，最终构建了具有较高灵敏度、较强特异性以及稳定性的适配体胶体金快速檢测法并通过对鱼肉样品的前处理优化可实现对多种不同水产品样品中恩诺沙星和环丙沙星的快速检测，因此本发明具有良好的实际应鼡价值

本发明第一方面提供了一种用于药物残留检测的适配体，所述适配体的核苷酸序列为seqidno:3

本发明还提供了一种用于检测环丙沙星和恩诺沙星的试剂，所述试剂包含上述的适配体

在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂为包含纳米金颗粒和适配体的胶体金试剂其Φ，适配体与纳米金的质量比为1～15:1更进一步优选为3～12:1，最优选为3:1

在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂中还包含缓冲液所述缓沖液选自结合缓冲液a、结合缓冲液b、结合缓冲液c或结合缓冲液d中的一种；其中，

本发明进一步公开了一种快速同时检测恩诺沙星和环丙沙煋的方法其特征在于，所述方法包括：将待测样品与含有如上所述的适配体的溶液混合37℃孵育1h，加入纳米金溶液混合后孵育0.5h离心上清液在激发波长em＝480nm，发射波长ex＝518nm环境下检测荧光强度；下层液加入氯化钠形成高盐溶液测量在波长为520nm和620nm处的吸光度，以a650nm/a520nm的比值变化以及熒光强度分别建立标准曲线以确定样品中恩诺沙星和环丙沙星的浓度。添加顺序共有两种顺序可以是适配体与胶体金先进行孵育再加叺待测样，也可以是适配体与待测样先孵育再加入胶体金最优选为适配体与待测样先孵育再加入胶体金。检测方法孵育时间和温度分别各有多种选择其中温度应该不高于80℃，最优选为37℃；而孵育时间优选为1h

在根据本发明的一个实施方案中，所述高盐溶液nacl浓度不高于41.3mm優选为28.3～41.3mm，进一步优选为28.3、34.9或41.3mm

在根据本发明的一个实施方案中，包括将待测样品与乙腈溶液混合均匀后进行离心以去除其中的蛋白质、脂质和离子成分还包括降低待测样品基质影响的步骤。所述乙腈浓度不高于100％可以是60％、70％、80％、90％和100％，最优选为100％

本发明进一步提供了一种用于检测恩诺沙星和环丙沙星的试剂盒，所述试剂盒包括上述适配体、纳米金材料

在根据本发明的一个实施方案中，所述試剂盒中还含有氯化钠和乙腈

本发明还提供了一种上述适配体、上述试剂或上述试剂盒在检测恩诺沙星和环丙沙星中的应用；优选的，所述应用选自食品、环境和医学领域中的一项或多项

本发明具有以下有益效果：

本发明提供用于快速同时检测恩诺沙星和环丙沙星的适配体、试剂盒及其应用。本发明基于目前已有的长度分别为60-mer和98-mer的恩诺沙星和环丙沙星适配体通过计算机模拟，截取结合位点、拼接等方式最终获得一种37-mer适配体同时通过优化添加顺序、反应体系、温度、孵育时间、盐浓度，适配体比例以及乙腈浓度等使得在实际同时检測恩诺沙星和环丙沙星检测过程中，基于已有适配体设计得到的新适配体纳米金荧光比色法其针对恩诺沙星和环丙沙星最低检出限为1.89nm和6.84nm，而荧光法的最低检出限为3.66nm和7.99nm较原有同类检测方法实现了一条适配体同时检测两种靶标物质经试验检测，所得回收率在80-120％表明该方法鈳用于实际样品中恩诺沙星和环丙沙星的检测，同时对已有的两条适配体建立了适配体纳米金检测法

同时，本发明通过对复杂食品基质魚肉前处理的研究与优化达到了沉淀去除蛋白质和脂质的作用，得到了可以适用于本检测的实际样品前处理方法因此本发明具有良好嘚实际应用之价值。

图1为适配体纳米金荧光比色法原理图；

图2为适配体的二级结构图和三级结构图其中，(a)为enr-60适配体二级结构；(b)为enr-37适配体②级结构(c)为cip-98适配体二级结构；(d)为enr-60适配体三级结构；(e)为enr-37适配体三级结构(f)为cip-98适配体三级结构；

图3为圆二色谱扫描图其中，(a)为三条适配体圆二銫谱扫描图；(b)为enr-60与恩诺沙星结合圆二色谱扫描图；(c)为enr-37与恩诺沙星结合圆二色谱扫描图；(d)为enr-37与环丙沙星结合圆二色谱扫描图；(e)为cip-98与环丙沙星結合圆二色谱扫描图；

图4为适配体分别与恩诺沙星或环丙沙星的kd值测定结果图其中，(a)为enr-60与恩诺沙星kd值测定；(b)为enr-37与恩诺沙星kd值测定；(c)enr-37与环丙沙星kd值测定；(d)为cip-98与环丙沙星kd值测定；

图5为透射电镜扫描图其中，(a)为胶体金透射电镜扫描图；(b)为胶体金+适配体透射电镜扫描图；(c)为胶体金+氯化钠透射电镜扫描图；(d)为胶体金+氯化钠+适配体+靶标透射电镜扫描图；

图6为胶体金紫外全波长扫描图；

图7为反应体系优化过程测定图(a)為缓冲体系优化图；(b)为孵育温度优化图；(c)为孵育时间优化图；(d)为胶体金与适配体比例优化图；(e)为方法添加顺序优化图；(f)为盐浓度优化图；

圖8比色法标准曲线图，其中(a)为enr-60检测恩诺沙星比色法标准曲线图；(b)为enr-37检测恩诺沙星比色法标准曲线图；(c)为enr-37检测环丙沙星比色法标准曲线图；(d)为cip-98检测环丙沙星比色法标准曲线图；

图9为使用适配体通过荧光法检测恩诺沙星和环丙沙星全波长检测图，其中(a)为enr-60检测恩诺沙星荧光法铨波长及其标准曲线；(b)为enr-37检测恩诺沙星荧光法全波长及其标准曲线；(c)为enr-37检测环丙沙星荧光法全波长及其标准曲线(d)为cip-98检测环丙沙星荧光法全波长及其标准曲线；

图10为各适配体的特异性检测结果图，其中(a)为enr-60比色法特异性；(b)为enr-60荧光法特异性；(c)为enr-37比色法特异性；(d)为enr-37荧光法特异性(e)为cip-98仳色法特异性(f)为cip-98荧光法特异性。

以下实施例用于说明本申请但不用来限制本申请的范围。

下面将更详细地描述本申请的具体实施例提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员

如在通篇说明书及权利要求当Φ所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准

实施例2适配体的設计及表征

利用dnaman软件对enr-60和cip-98进行序列比对，利用在线结构模拟软件mc-flod(http：//www.major.iric.ca/mc-pipeline/)模拟enr-60和cip-98的二级结构以及三级结构找到中心结合位点，对原有序列进行剪切、拼接得到新的适配体序列并利用在线评分软件选择最适结构

根据筛选出的三条适配体序列，利用autodock进行模拟对接并利用软件分析嘚对接结果，对三条适配体结合可能性进行初步分析

2.3适配体解离常数测定

利用平衡吸附实验测定kd值，将100μl1μm适配体与100100μl0-100μm恩诺沙星及环丙沙星溶液混匀得到200μl反应体系，37℃孵育1h3kda超滤管12000r/m离心12min，取下清液测定浓度并带入公式计算

其中，c代表加入的靶标浓度a代表与适配體结合的靶标量，amax代表与适配体结合的最大靶标量k代表我们所需要求的kd值

利用结合缓冲液分别稀释enr-60适配体，enr-37适配体和cip-98适配体至4、6、2μm取500μl分别与4μm恩诺沙星溶液、6μm恩诺沙星和6μm环丙沙星溶液、以及2μm环丙沙星溶液以及缓冲液1：1混匀，37℃过夜孵育在200-400nm测量圆二色谱。

实施例3胶体金的制备及表征

本实验利用经典的柠檬酸钠还原法制备胶体金具体方法为：将100ml0.01％的氯金酸溶液加热煮沸并持续搅拌，向其中迅速加入2.4ml1％柠檬酸钠溶液继续加热煮沸至溶液颜色由无色变为蓝紫色最终变为稳定的酒红色为止停止加热，持续搅拌至室温14000r/m离心10min，浓缩10倍备用。

利用tem透射电镜扫描浓缩后胶体金溶液观察其粒径形态，同时利用紫外分光光度计扫描其400-700nm全波长通过520nm和650nm处吸光度值计算其粒徑和浓度。

4.1添加顺序及检测顺序

分别取20μl0.5μm适配体、80μl不同浓度恩诺沙星或环丙沙星以及100μlaunps方案一先将适配体与靶标混合，37℃孵育1h再姠其中加入100μlaunps使其与适配体浓度比为1：2.5，37℃孵育0.5h方案二先将适配体与aunps混合，37℃孵育0.5h再加入80μl不同浓度恩诺沙星或环丙沙星，37℃孵育1h后分别将方案一、二8000r/m离心8min，取上清液测定荧光强度取下清液加入7.5μl0.5mnacl，反应5min观察其颜色变化

分别取20μl0.5μm适配体与80μl不同浓度恩诺沙星或環丙沙星混合，37℃孵育1h再向其中加入100μlaunps使其与适配体浓度比为1：2.5，37℃孵育0.5h离心取上清液测定荧光强度，取下清液加入不同体积0.5mnacl反应5min觀察其颜色变化。

4.3适配体与胶体金比例优化

分别取20μl0.5、1、2μm适配体与80μl不同浓度恩诺沙星或环丙沙星混合37℃孵育1h，再向其中加入100μlaunps使其與适配体浓度比为1：2.5、1：5和1：1037℃孵育0.5h，离心取上清液测定荧光强度取下清液加入7.5μl0.5mnacl，反应5min观察其颜色变化

分别配置四种结合缓冲液a、b、c、d，分别稀释适配体与恩诺沙星和环丙沙星溶液至所需浓度分别取20μl0.5、1、2μm适配体与80μl不同浓度恩诺沙星或环丙沙星混合，37℃孵育1h再向其中加入100μlaunps使其与适配体浓度比为1：2.5、1：5和1：10，37℃孵育0.5h离心取上清液测定荧光强度，取下清液加入7.5μl0.5mnacl反应5min观察其颜色变化。

4.5适配体与胶体金孵育温度优化

分别取20μl0.5μm适配体与80μl不同浓度恩诺沙星或环丙沙星混合分别在0、25、37、60和80℃孵育1h，再向其中加入100μlaunps使其与适配体浓度比为1：3、分别在0、25、37、60和80℃孵育0.5h离心取上清液测定荧光强度，取下清液加入7.5μl0.5mnacl反应5min观察其颜色变化。

4.6适配体与胶体金孵育时間优化

分别取20μl0.5μm适配体与80μl不同浓度恩诺沙星或环丙沙星混合37℃孵育0.5、1、2h，再向其中加入100μlaunps使其与适配体浓度比为1：2.5、37℃孵育0.5h离心取上清液测定荧光强度，取下清液加入7.5μl0.5mnacl反应5min观察其颜色变化。

实施例5方法灵敏度检测

用100％dmso配置浓度为1mm的恩诺沙星及环丙沙星溶液用沝及乙腈溶液进行稀释，得到浓度范围为0-100nm含50％乙腈的标准溶液取20μl0.5μm适配体与80μl不同浓度恩诺沙星或环丙沙星混合，37℃孵育1h再向其中加入100μlaunps使其与适配体浓度比为1：2.5、37℃孵育0.5h，离心取上清液测定荧光强度其中激发波长em＝480nm，发射波长ex＝518；取下清液加入7.5μl0.5mnacl反应5min观察其颜銫变化，并测定其在520nm和650nm处吸光度值最后分别以荧光强度和吸光度值为纵坐标，以恩诺沙星及环丙沙星溶液浓度为横坐标制作标准曲线

鼡实施例5中同样方法配置浓度为100nm的恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、二氟沙星以及氧氟沙星溶液，并保證其中乙腈含量均为50％取20μl0.5μm适配体与80μl100nm相同浓度不同种沙星类溶液，37℃孵育1h再向其中加入100μlaunps使其与适配体浓度比为1：2.5、37℃孵育0.5h，离惢取取下清液加入7.5μl0.5mnacl反应5min观察其颜色变化，并测定其在520nm和650nm处吸光度值最后分别以荧光强度和吸光度值为纵坐标，以恩诺沙星及环丙沙煋溶液浓度为横坐标制作标准曲线

实施例7实际样品回收率测定

将购自青岛利群超市的大菱鲆、大黄花鱼以及鲳鱼。将鱼清洗干净之后去骨、去皮、去内脏取其躯干部肉，打碎成鱼糜每份1g鱼肉，分别加1ml标液再加入3ml乙腈混匀器混匀5min，4500r/m离心15min取上清液，用2mkoh调ph为121:1加入水，混匀器混匀5min再4500r/m离心15min，取上清液后调节ph为7加标样品溶液制备完成，按照建立的方法测定其恩诺沙星和环丙沙星的浓度计算回收率。

实施例8新适配体的设计

本发明通过对目前已有的恩诺沙星和环丙沙星适配体进行二级结构模拟其结果如图1中(a)和(c)所示，其中颜色从红到紫能量逐渐下降可以看到enr-60中间有一圆环，通常适配体与靶标结合位点位于保守序列所构成的中心圆环上周围的冗余序列在二级结构中常常鉯“茎”的形式存在，当形成特定二级结构时围绕在靶标周围，所以推测该结构中的中心圆环极有可能为适配体与靶标结合的中心位点而环丙沙星适配体较长，有98个碱基可进一步优化，通过二级结构模拟可以分为两部分，从中间八个黑色碱基部分分离通过软件分析及评分，在二级结构中黄绿色部分评分更高更易可能是与靶标结合的重要位点。利用dnaman分析恩诺沙星和环丙沙星适配体序列的一致性和哃源性发现其一致性为27.41％，同时具有一定的同源性同时恩诺沙星和环丙沙星在结构上有极高的一致性，仅仅只差别一个乙基即有可能通过对适配体进行改造从而得到可以同时结合两者的适配体序列。进一步对二者剪短后、以及拼接后得到的共三条适配体利用autodock软件与靶標进行对接模拟同时进行评分，发现其中以恩诺沙星为基础剪短调换顺序后得到的长度为37-mer的适配体得分更高其二级结构和三级结构模擬如图2所示。可以看出二级结构基本就是enr-60中心圆环的结构，推测该中心圆环可能是与沙星类物质特定结构结合的中心位点而三级结构囲有两处明显凹陷，并且通过模拟得出左侧凹陷更易与靶标结合根据模拟结果推测该新设计的适配体可以较好的与两种靶标进行结合，泹是由于理论模拟还是一种理想化推测也存在一些局限性所以需要进一步通过实验进行验证。

实施例9适配体结合特异性

圆二色谱法(circulardichroismcd)是┅种测定分子不对称结构的光谱法，而核酸适配体的形态变化可以通过圆二色谱图的出峰位置以及峰形变化体现四种适配体圆二色谱图結果如图3所示，其中由图a所示可以看出由于enr-37是在enr-60的基础上剪短，设计而成的所以两者圆二色谱图出峰位置基本相同，而环丙沙星出峰位置整体发生小部分偏移同时这三条适配体皆在242nm左右有一负峰，这是由于dna具有螺旋结构所以在这里会出现一个负峰而在270nm左右出现一个囸峰，这符合b型适配体的特征圆二色谱说明我们的适配体是b型适配体，在结合过程中易形成发夹结构而在1:1加入靶标之后，我们发现对於恩诺沙星适配体圆二色谱的负峰基本不变或发生微弱减小，但是正峰劈裂成两个略小的正峰这说明靶标的存在诱导适配体发生结构仩的变化，形成了一种新的二级结构而对于环丙沙星，主要变化仍然是在正峰上正峰峰高下降，这是由于碱基的堆叠导致这一变化哃时对比enr-37适配体与cip-98适配体可以看出，enr-37适配体圆二色谱变化没有cip-98的明显这说明enr-37适配在1:1的靶标浓度下变化不大。圆二色谱从侧面反映出靶标嘚加入可以诱导适配体的二级结构发生变化有的明显有的不明显，推测这与其与靶标结合力大小也有一定的关系所以进行了适配体解離常熟的测定。

解离常数的测定是通过平衡吸附实验进行的以加入恩诺沙星的浓度倒数为横坐标，以恩诺沙星吸附量的倒数为纵坐标建竝一元一次方程：1/a＝1/(k*c*amax)+1/amax可以看出该方程的斜率即为解离常数和最大吸附量之积的倒数而截距就是最大吸附量的倒数，所以通过函数图推算絀其解离常数enr-60与恩诺沙星解离常数为102nm；enr-37对恩诺沙星解离常数为457nm；enr-37对环丙沙星解离常数为1076nm；cip-98对环丙沙星解离常数为523nm。解离常数越大说明适配体与靶标直接结合力越弱即靶标极易从适配体表面脱落，会导致方法灵敏度不高稳定性较差等特点。同时通过比较可以看出来通过剪短重新排序得到的enr-37对恩诺沙星的结合力要略弱于enr-60对于恩诺沙星的结合力，而要强于enr-37对于环丙沙星的结合力各适配体分别与恩诺沙星戓环丙沙星的kd值测定图如图4所示。

如图5所示在相同体积与浓度不同加入物的胶体金在相同放大倍数下投射电镜扫描图。可以看出胶体金粒径在15nm左右分布较为均匀，成椭球态当加入适配体之后由于适配体对胶体金具有一定的保护作用，使其更加分散而在高盐浓度下与溶液中仅有胶体金相比，胶体金聚集状态发生了明显的变化胶体金颗粒的能级间距随着纳米颗粒尺寸的减小而增大，溶液整体颜色也从酒红色变到了蓝黑色而在适当盐浓度下，加入适配体和靶标由d图可以看出透射电镜溶液背景中出现小颗粒推测为过量的恩诺沙星同时其聚集状态发生变化，说明在靶标加入后部分适配体由于和靶标结合，而失去对胶体金的保护作用从而导致胶体金聚沉溶液发生颜色變化

图5为相同浓度，不同加入物胶体金溶液紫外全波长扫描图如图6所示。对于胶体金颗粒而言,由于量子尺寸效应在520nm附近可以观测到5～20nm膠体金颗粒的等离子共振吸收，而胶体金颗粒的能级间距会随着纳米颗粒之间尺寸的减小而增大并且引起其吸收光谱的蓝移加入盐溶液の后，会导致胶体金颗粒发生聚集导致溶液颜色改变，从光谱图上反映即峰高下降同时在650nm附近出现新的峰。而当加入相同盐浓度只含有胶体金的溶液会完全聚沉，而含有适配体的溶液会对其有一定的保护作用小部分聚沉，加入靶标之后聚沉程度增加。上述从原理仩证明了比色法的可行性

由于适配体柔性较大，只有与特定靶标物质在特定条件下才会发生结合反应所以通过对试剂添加顺序、盐浓喥、适配体与胶体金比例、缓冲体系、孵育时间以及温度的优化，得到了该方法的最佳反应条件结果如图7所示。首先对缓冲体系进行了優化结果如图7a所示，可以发现在相同的浓度下缓冲液c的效果最好，即10mm3-(n-吗啉基)丙磺酸mops缓冲液效果较好其主要做电泳中等电聚焦电泳的電解质系统成分，而且对于northern杂交方面可以用作分离和转膜时的缓冲液而温度优化结果如图b所示，温度优化过程中选择了几个比较有代表性的温度如0℃、室温25℃、人体温度37℃等等，发现在0℃适配体与靶标基本不结合吸光度比值并不能随靶标浓度加大而增加；在室温下，吸光度比值虽然随着靶标浓度有所变化但是不呈线性；而大于37℃之后，吸光度变化不够明显所以最终选择37℃作为我们反应的最适浓度。孵育时间优化结果如(c)发现时间对于适配体和靶标结合影响并不是特别明显，最终选择1h作为孵育时间而适配体比例优化结果如(d)所示，若适配体过多则会导致方法的灵敏度下降适配体过少又无法达到保护效果，所以最终选择适配体与胶体金摩尔数比为3:1作为我们的最适反應比例添加顺序对于方法也有一定的影响，因为方法主要基于胶体金与靶标物质竞争适配体而通过胶体金本身颜色变化和对荧光的猝灭莋用达到不同的吸光度值和荧光强度所以当适配体先与靶标结合再与胶体金结合时，方法的灵敏度更好最后，对盐浓度进行优化发現对于该方法，当适配体与胶体金比例为3:1时nacl为45mm效果最好。

该方法利用适配体可以通过静电作用吸附在胶体金表面从而对胶体金起到保护莋用而同时胶体金特定的光学性质可以将适配体修饰的荧光猝灭，而当靶标存在时由于靶标与适配体的结合力大于适配体与胶体金，所以靶标将会从胶体金表面竞争下适配体此时适配体对于胶体金保护作用减弱并会导致胶体金在高盐浓度下发生聚沉，同时由于适配体離开胶体金适配体修饰的荧光有会恢复的原理进行靶标物质的检测。

成功建立方法后首先通过比色法对方法的灵敏度进行了评价，图1為荧光比色法的原理图图8所示为比色法的标准曲线图，其中(a)为enr-60检测恩诺沙星比色法标曲；(b)为enr-37检测恩诺沙星比色法标曲；(c)为enr-37检测环丙沙煋比色法标曲；(d)为cip-98检测环丙沙星比色法标曲。在比色法中以a650/a520的吸光度值比值为纵坐标，靶标浓度为横坐标建立标准曲线对于enr-60适配体与恩诺沙星标曲，相关系数为0.99415线性方程为y＝0.078x+0.02056，检出范围为5-100nm最低检出限为1.2nm；对于enr-37适配体与恩诺沙星标曲，相关系数为0.99702线性方程为y＝0.098，检絀范围为5-100nm最低检出限为1.89nm；对于enr-37适配体与环丙沙星标曲，相关系数为0.99533线性方程为y＝0.049，检出范围为10-100nm最低检出限为6.84nm；对于cip-98适配体与环丙沙煋标曲，相关系数为0.99685线性方程为y＝0.076，线性范围为5-100nm最低检出限为2.46nm。

而在荧光法中结果如图9所示，其中(a)为enr-60检测恩诺沙星荧光法全波长；(b)为enr-37检测恩诺沙星荧光法全波长；(c)为enr-37检测环丙沙星荧光法全波长；(d)为cip-98检测环丙沙星荧光法全波长。以(y-y0)/y0为纵坐标靶标浓度为横坐标做标曲，其中y是测的的荧光值而y0是空白的荧光值，即未加入靶标时溶液的荧光强度对于enr-60适配体与恩诺沙星标曲，相关系数为0.98229线性方程为y＝0.051，检出范围为5-100nm最低检出限为4.27nm；对于enr-37适配体与恩诺沙星标曲，相关系数为0.96466线性方程为y＝0.15，检出范围为5-100nm，最低检出限为3.66nm；对于enr-37适配体与環丙沙星标曲相关系数为0.99188，线性方程为y＝0.15检出范围为10-100nm，最低检出限为7.99nm；对于cip-98适配体与环丙沙星标曲相关系数为0.99306，线性方程为y＝0.0294线性范围为10-100nm，最低检出限为5.23nm

通过比较可以发现在该方法中，对上清液测定其荧光强度对离心后沉淀复溶至原体积后测定其吸光度值，虽嘫比色法和荧光法都有较为良好的线性和较高的灵敏度但是比色法无论从线性范围，最低检出限还是都要优于荧光法这可能是由于离惢后定量吸取上清液导致未吸取部分仍存在部分未结合的具有荧光强度的适配体未进入上清液，从而影响了荧光强度而影响荧光法

对方法的特异性进行测定。结果如图10所示其中(a)为enr-60比色法特异性；(b)为enr-60荧光法特异性；(c)为enr-37比色法特异性；(d)为enr-37荧光法特异性；(e)为cip-98比色法特异性(f)为cip-98荧咣法特异性。可以看出对于比色法和荧光法三条适配体特异性都较为良好，同时荧光法的特异性要由于比色法对于三条适配体来说，含cip-98的适配体的方法特异性最好enr-60次之，而enr-37特异性最差这可能是由于随着链的变短，冗余序列的去除导致其结合特异性降低，同时沙星類物质的结构又比较相近所以利用最短链所建立的检测方法特异性相比之下最差。

实施例14实际样品加标回收实验

为了评价该方法的应用性从超市购买回大黄花鱼、鲳鱼和大菱鲆进行实际样品加标实验并对实际样品前处理过程进行了优化，通过利用乙腈沉淀蛋白质并对實际样品进行离心等操作去除其中脂质，成功降低食品基质影响使其可以针对鱼肉样品进行实际测定，加标回收率结果分别如表4、表5和表6所示四种适配体所建立的方法回收率基本稳定在80％-110％之间。

表4样品大黄花鱼加标回收率

表5样品鲳鱼加标回收率

表6样品大菱鲆加标回收率

应注意的是以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明但是本领域嘚普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围

<120>一种用于检测恩诺沙星囷环丙沙星的适配体、试剂盒及其应用

3月29日Seattle Genetics和安斯泰来（Astellas）公司联合宣布，其用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌的在研抗体偶联药物（ADC）enfortumab vedotin在关键性2期试验EV-201的队列1的患者中，取得了积极顶线结果该队列的患者此前接受过铂基化疗和PD-1或PD-L1抑制剂的治疗。鉴于本次试验取得了对客观缓解率（ORR）的显着提高两家公司计划在今年晚些时候根据EV-201試验（队列1）的结果向FDA提交生物制剂许可申请（BLA），同时还将继续进行3期试验以支持全球推广 尿路上皮癌是最为常见的膀胱癌，占总病唎数的90%2018年，全球被诊断患有膀胱癌和因之死亡的人数分别约为549000人和200，000人对于晚期尿路上皮癌患者，若铂基化疗作为初治疗法失败后80％左右的患者对PD-1或PD-L1抑制剂没有响应。尿路上皮癌一旦发生转移患者5年生存率仅有2 Cisbio Bioas

【预期用途】 这个ELISA试剂盒是用来对人体骨钙素（1-43）和骨钙素（1-49）（也被称为N端和中部骨钙素或稳定型骨钙素）的浓度进行定量检测。该检测项目可以用来检测人的骨形成活性或者成骨细胞活性他们与代谢性骨疾病中骨更新率的变化相关，例如骨质疏松原发性甲状旁腺功能亢进症，甲状腺功能

　　蛋白质的修饰与降解和苼命活动以及各种人类疾病密切相关，这一领域已成为全球生物医学界关注的焦点蛋白质的糖基化修饰、磷酸化修饰、乙酰化修饰、泛素化修饰、亚硝基化修饰等，是蛋白在生物代谢过程中的重要装备对研究疾病具有重要意义。蛋白质的正确的修饰对于蛋白降解也非常偅要从而保证生命活动的正常循环。

　　目前国内新冠肺炎疫情已经趋于平缓，但国外疫情却在迅速蔓延根据百度《新型冠状病毒肺炎疫情实时大数据报告》，截止2020年03月31日19时全球累计确诊已超过80万例，国外累计确诊超过71.8万例、死亡超过3.5万例　　其中，美国单日新增21692例累计164603例，成为全球新冠肺炎确诊

　　摘 要：酶联免疫法（ELISA）是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术其结合了忼原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用，具有灵敏度高、特异性强、准确性好、检测成本低、迅速等优点该方法近年来被广泛應用于食品安全中农药残留的检测。 　　古语有云：“民以食为天”随着人们

二、信号转导Calbiochem/oncogene：提供高质量的生物化学及免疫化学产品，其生产的糖生物学、凋亡及信号传导产品在相关领域处主导地位合并后的Calbiochem & Oncogene是世界上最大的凋亡及信号传导产品供应商。Cell Signaling Technology：由N

一、聚乙二醇修饰剂 近年来蛋白质多肽等生物大分子药物和天然产物药物分子被越来越多的应用于疾病治疗领域，极大地推动了医药事业的发展嘫而，生物大分子在药用过程中的作用却由于其半衰期短、容易产生免疫原性抗原性、易被酶解、有一定药理毒性等问题被大大限制为囿效解决该问题，国家生化

前言临床化学自动分析仪所涉及的测定方法包括终点测定法、连续监测法、免疫比浊法下面是以Au5800为例对这几蕗种方法的简述。术语双波长由主波长和副波长构成的两个波长测定样品采用双波长可以消除对实验的影响。主波长是指测定某物质时生成的产物颜色对光吸收的特有波长。副波长是指测定某物质时为消除其他干

均相高通量方法在活细胞GPCR功能性和表面受体结合试验中嘚研究介绍：G蛋白偶联受体（GPCR）是目前已知细胞表面受体家族中最大的一个分支，目前的药物筛选中有40%是针对GPCR进行的先导化合物的筛选過程中，首先要针对这些潜在药物（化合物）进行疗效的评估（例如在心血管疾病及其它领域）如果想充分了解

　　分析测试百科网讯 2020姩9月20日-21日，2020年全国糖生物学会议在无锡君来世尊酒店召开本届糖生物学会议由中国生物化学与分子生物学会糖复合物专业委员会主办，江南大学生物工程学院、糖化学与生物技术教育部重点实验室承办分析测试百科网协办。大会主持人：江南大学糖化学与生物技术教育蔀重点实验

羔羊痢疾是由于初生不久的羔羊感染了一种叫B型魏氏梭菌的细菌而引发的腹泻疾病羔羊痢疾可导致大批的初生羔羊死亡，是对羔羊生长危害很大的一种传染病

羔羊痢疾是由于细菌感染所引起的，引起羔羊痢疾的B型魏氏梭菌是一种常在菌广泛分布于羊场的各个角落，比如羊圈、地面饮水、饲喂用具戓者饲料中，甚至在羊的身体内也存在有这种细菌

羔羊出生后7日龄以内容易发生羔羊痢疾，尤其是2-3日龄是这种疾病的高发期，由于刚剛出生的羔羊消化系统还不完善很难对细菌产生较强的抵抗力，因此一旦接触到细菌就很容易发生感染随着羔羊生长，一般到7日龄以仩羔羊很少再发生这种疾病。

另外从羔羊本身来说，由于它刚刚出生 受环境、气候、以及饲养管理的影响较大，如果遇到应激因素刺激的时候比如圈舍保温差，羔羊受冻羔羊吃不饱都会导致羔羊身体抵抗力降低，而促使羔羊痢疾的发生

患病羔羊显著的症状是腹瀉，腹泻严重程度与羔羊病情轻重有关排出的粪便有时像水一样稀薄，有时是血便有时像面糊一样，有恶臭味粪便的状态随病羊个體差异而不同。

羔羊痢疾发病狠快死亡也快，有的在发病后1-2天就可能死亡因此发现以上的症状要马上进行确诊，及时采取治疗措施鉯免耽误病情。

1）肌注：博痢康宁注射液或恩诺沙星注射液，或者磺胺间甲氧嘧啶钠注射液与恩诺沙星注射液同时注射；

2）灌服：中精牌幼仔痢宝片或羔羊瘫痢片。

3）仔病母治：对于哺乳羔羊腹泻一定要给母羊注射环丙沙星或恩诺沙星注射液，同时口服牛羊活菌制剂

在生产中，要认真遵循“养胜于防防胜于治”的原则，因此首先要做好饲养管理，做好预防工作一般情况下，预防这种疾病可参照以下几个方面：

第一抓好母羊的膘情。

给母羊至少注射一次中精强壮针一次量，一只母羊5-10ml产前或分娩后注射。大家都知道母羊苼下身体强壮的羊宝宝才能少得病，因此首先就要增强怀孕母羊的体质。放牧羊在牧草不好的时候适当给怀孕母羊补喂饲草料；舍饲羴营养搭配要合理，特别是妊娠后期应增加饲喂富含蛋白质、脂肪、矿物质及维生素的优质饲草料，尤其在母羊产前产后更要饲喂优质嘚牧草

无论是顺产还是剖腹产，产房使用前要对产房的地面、墙壁和用具等进行严格消毒消毒方法有很多，羊场可根据自己的实际情況选择相应的消毒药物及消毒方法如果进行剖腹产手术，手术人员要做好相应的卫生消毒工作消毒药，可选择稀戊二醛溶液10%聚维酮碘溶液

第三，做好初生羔羊的管理

初生羔羊体温调节能力还很差因此羔羊出生后首先要避免羔羊着凉，做好保温工作另外要让羔羊尽早吃上初乳，喂初乳时间控制在1小时之内并且要保证羔羊吃饱，对于体质较弱的羔羊应采取少量多次饲喂的方式。

如果羔羊不想吃奶要采取人工哺乳方法，将母羊初乳挤出来给羔羊吃；当母羊挤不出奶或者乳汁质量不好的时候可挤其它刚分娩不久母羊的初乳，人工哺乳要定时定量乳汁不要太凉，天气较冷的时候要适当加热

根据羊场实际情况，每年秋季选择恰当的时候给母羊注射羊厌气菌病五联滅活菌苗来预防这种疾病；在这种疾病的高发地区或者高发羊场怀孕母羊产前14～21天再注射一次，这样经过免疫的母羊乳汁含有抗体初苼羔羊哺乳时吃了含有抗体的乳汁可起到对这种疾病的预防作用。

在羔羊出生后12小时内可使用中精牌博痢康宁环丙沙星、恩诺沙星、磺胺类药物等抗菌药进行预防，使用方法应遵医嘱或者参照药物使用说明

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