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As Christmas drew near , Ursula was faced with just that problem.She had come to live in
an American home and learn English. In return she would mind the children and do anything she was asked. One of her task was to keep track of arriving Christmas presents.Ursula did this faithfully, but she became increasingly worried.What could she buy for her American family with the little money she had that would compare with the gifts she was recording daily? Besides,even without any of the gifts ,her employer seems to have everything. Ursula thought long and hard.On Chritmas Eve,she went to a store .She moved slowly through crowds of shoppers,selecting things in her mind.Finally she bought a baby dress.She immediately called a taxi .“Excuse me,please,can you help me find a poor family with a baby?” “A poor family?”
said the surprised driver.“Yes,a very poor family.” Ursula told the man of what she was trying to do.He. listened in silence,and then said,“I know a family who needs
just about everything.” When they reached a building ,the driver said,“They live on the third floor.” Ursula shook her head,“Would you take this dress to them and tell them it’s from someone … someone who has everything.”
Early the next day Ursula thanked
everyone for the presents she received.Then,she beganto explain why there seemed to be none from her. She told about what she did the night
before.When she finished,there was a long silence .“You see,” she added,“I try to do a kindness in your name.And this is my Christmas present to you.”
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非机译随着圣诞节的临近,乌苏拉面临着一个问题.她已经到了美国,生活在一个美国家庭在那学习英语。作为回报,她将照顾孩子儿童还有任何他们要求她做得事情。其中的一个任务就是记录收到得圣诞节礼物.乌拉苏做得非常认真,但她变得越来越烦恼.她只有一点点钱,那么她该为她所在得美国家庭买些什么礼物,才能与今天她所记录得这些礼物相称呢?看起来,就算是没有这些礼物,他们似乎也什么都不缺。乌苏拉绞尽脑汁得想了很久。圣诞节前夕,她去了商店。她随着众多得顾客一起慢慢得浏览商品,想着该买些什么。最后她选中了一件婴儿服。她马上叫了出租车准备回去。“不好意思,请问你可以帮我找一个有小孩得穷人家吗?”“穷人家?”司机惊奇的说。“是的,一个非常穷困得人家.”乌苏拉告诉了司机她想要做得事。司机认真得听着,说“我知道一家人,他们几乎缺少所有得东西。”当他们到达了一栋大楼,司机说到“他们住在三层。”乌苏拉摇了摇头说“可以帮我把这件衣服送给他们,告诉他们它来自于一个丰衣足食得家庭。”第二天一大早,乌苏拉感谢了所有送给她礼物的人,之后,她解释了为什么她没有送给他们任何礼物。她说明了昨天她所做得一切。说完以后,屋里一阵沉寂。“是的,”她补充道,“我想要以你们得名字做些善事,这就是我想送给你们得礼物。”
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随着圣诞的邻近,萼素拉烦恼着一件事。她来了一个美国家庭学英语,作为回报,她帮着照顾寄宿家庭的小孩子和做被吩咐的所有事。她其中一个任务是管理家庭收到的圣诞礼物,萼素拉忠诚小心的完成着。但是她开始担心 - 她只有一点点钱,比起她每天受到的礼物,她能够送什么给她的美国家庭呢?而且,就算没有人家送的这些礼物,她的主人家好像也什么都不缺。萼素拉认真的想了很久。圣诞前夜,她去了一间商店。她在买东西的人流中慢慢的走着,在头脑里选着不同的商品。终于她买了一件婴儿服装。她召了一辆出租车。“不好意思,请问你可以帮我找一个有婴儿的贫穷家庭吗?”“贫穷家庭?”出租司机意外的说。“对,非常贫穷的家庭。”萼素拉告诉了司机她想做的事情,司机安静的听了,说:“我知道一个什么都需要的家庭。”他们到了一栋楼下,司机说:“他们住在三楼。”萼素拉摇了摇头,说:“麻烦你把这件衣服带给他们,说是一个。。 一个什么都有的人给他们的。”第二天一早萼素拉谢了所有送她礼物的人,然后开始解释她没有礼物给他们的原因。她讲了她昨晚做的事情。在她讲完的时候,大家静了很久。“所以,”她说,“我试着以你们的名义去做了一件善事。这是我送给你们的圣诞礼物。”
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今天太晚了,要休息了,明天来哈
这篇文章很简单,去Google翻译一下就可以了。
只知道第一句 临近圣诞节的时候
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种族, (江,约有二十辆自行车参加赛车争夺奖品。2,民族[C][U]The British are a sea-going race, 疾走, 赛马大会[the P]3,种,with)]He ran a race with me,racen,月)的运行, (日,他同我赛跑。2,参加竞赛,全速行进She raced to the phone,between&#47, 人种,出租车司机驾车将我飞速送到机场。3,1, 和,他是个出身高贵的男士。,1,她飞快地跑向电话。3, (机器因负荷减少而)猛转vt,门第[U]He was a man of noble race,1,宗族,1,竞赛[C][(+against&#47,,海的)急流, 赛跑, (动植物的)属,(人生的)历程[C]vi, 比速度,比赛, 使急走,,竞赛2,水道[C]4, 血统,参加赛马Some twenty bikes will race for the prize,使全速行进,使(发动机)猛转[O]The taxi-driver raced me to the airport,英国人是个航海的民族。2, 使(马等)参加比赛racen,类[C]3,
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种族,接力赛,,
比赛。比率的意思。
race=种族、(比赛)竞争
RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
近年来随着生物技术的不断发展,出现了许多新基因的方法和手段,如图谱技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。
经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术,主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端,包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善,克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】,使引物定位在poly(A)尾的起始点,从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时,采用poly(C),而不是poly(A);改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h (60 度 -70度 )有效地逆转录mRNA,从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。
随着RACE技术日益完善,目前己有商业化RACE技术产品推出,如CLONTECH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种盒进行RACE反应,结果发现使用Marathon TM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE盒到所得到的片断短。其原因在于Marathon TM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。所以认为,进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE盒。以下就国内目前应用最广的SMART TM RACE盒为例,简要概述RACE技术的原理和操作过程。 SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物,用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物,以cDNA第一链为模板,进行PCR循环,把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。
RACE的优点
与筛库法相比较,有许多方面的优点
1)此方法是通过PCR技术实现的,无须建立cDNA文库,可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2)节约了实验所花费的经费和时间。
3)只要引物设计正确,在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介
􀂙RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
􀂙使用此方法的要求是必须知道至少23-28个核苷酸序列信息,以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物(GSPs)。
RACE引物的设计:
基因特异性引物(GSPs)应该是:
&#-70%GC
􀂙Tm值≥65度,Tm值≥70度可以获得好的结果
需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在,PCR的产物是特异性的。
反应中涉及到的一些事项
􀂙cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA,背景会很高。
􀂙RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
􀂙在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。
􀂙表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外,重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
􀂙引物GSP中的GC含量要在50-70%之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列,否则会产生回折和形成分子内氢键。另外,避免使用与AP1互补的引物,尤其是在3‘末端。
如果要用重叠片段来检测设计的引物,GSp1和GSp2之间至少是100-200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。
􀂙降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。在最开始的循环中,退火温度高于AP1引物的Tm值,可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度,可以进行随后的PCR循环。
􀂙验证基因特异性引物的对照:
􀁜单个引物的阴性对照:只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物,应该改变循环的参数,或重新设计原始引物。
􀁜利用两个GSPS进行阳性对照:(只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定RNA样品中目的基因确实表达,利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段,应该重复cDNA的合成,或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。
􀂙制备和抽提polyA+RNA
不要使用DEPC处理过的水。
纯化完mRNA之后,利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5-12kb的拖带,在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小
具体的实验步骤
cDNA第一条链的合成:
􀂃我们建议进行cDNA合成的对照反应,这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后,在气浴中42度保温一个小时。
注意:在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积,从而降低第一链的合成效率。
将管放于冰上,以终止第一链的合成反应。
直接进行第二链的合成。
􀂃cDNA第二链的合成:
第二链合成的酶混合物中,含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照,试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。
􀂃建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5-3kb之间。
􀂃通过电泳检测cDNA的产量,与对照进行对比,这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。
接头的连接及连接产物的稀释
􀂃按照程序进行连接反应。
􀂃如果没有对比样品和对照的产量,利用Tricine-EDTA buffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物,用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应,直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。
RACE RACE--PCRPCR扩增扩增
•进行5’和3’的RACE-PCR扩增。
•利用以下的程序进行降落PCR反应:
5个循环:94度5秒
5个循环:94度5秒
20-25个循环:94度5秒
我们建议使用降落PCR反应,这就要求GSP的Tm值≥70度。
当循环结束时,利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl,使用适当的分子量marker。
•可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带,在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2-5kb的时候,经常使用4min,0.2-2kb的时候将延伸时间减到2-3min,对于5-10kb的条带,延伸时间增加到10min。
RACE产物的验证:
􀁻应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员,验证是非常有用的。
􀁻有3种验证RACE产物的方法:
(1)比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
(2)Southern blot
(3)克隆并测序
􀁻我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。
比较由GSP和NGSP获得RACE产物。
􀁻对于5‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。
􀁻对于3‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。
􀁻如果条带是正确的,在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。
RACE产物的克隆和测序:
􀁻可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物,此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
􀁻电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。
􀁻将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点,将产物克隆到常规载体中
对于5‘端的RACE产物,我们建议挑取至少8-10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。(反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端,尤其是长模板。另外,T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0-20个碱基。)
􀁻一旦鉴定了含有插入片断的克隆,应该获得多的序列信息。理想的是,可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。
全长cDNA的获得
􀁻通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后,可以通过两种选择获得全长的cDNA。
通过PCR的方法。
通过克隆的方法。
通过PCR的方法获得全长cDNA:
􀂄扩增长的cDNA需要较长的延伸时间,但是如果延伸的时间过长,可以产生拖带,所以要慎重的设计引物。
􀂄根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端,应该是23-28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点,这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。
通过PCR的方法获得全长cDNA:
􀂄进行如下的热循环:
25个循环94度5秒
72度2-15分钟
􀂄延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如:预期得到6kb的条带,用6+2=8分钟的延伸时间。
􀂄注意:如果没有条带或者条带弱,增加5个循环;或者优化PCR的条件。
通过PCR的方法获得全长cDNA:
􀂄在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下,可以见到一条单一带,如果这样,利用胶来纯化全长的cDNA。
􀂄制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer,TBE的胶很难制备全长的cDNA。
􀂄将剩下的45μl反应物点样,选用适当的marker。
􀂄利用长波紫外观察cDNA(≥300nm)切下全长的cDNA。注意:应该尽量减少紫外对cDNA的照射。
通过PCR的方法获得全长cDNA:
􀂄利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
􀂄将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。
通过克隆产生全长的cDNA:
􀁺如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物,同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话,通过克隆技术可以获得全长的cDNA。
􀁺利用酶切获得的3‘和5’扩增产物,并且利用T4 DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。
􀁺在哺乳动物基因组中,NOT1和Srf1酶切非常稀少,大约106bp才出现一次,因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。
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程序设计中所指的的集成性的开发环境,比较典型的微软的Visual studio 2008
集成设备电路原意 ide,石斑鱼。[1][编辑本段]英文缩写IDE = Integrated Device Electronics,集成设备电路,一般叫做IDE总线,更准确地称为是ATA。一种IDE接口磁盘驱动器接口类型,硬盘和光驱通过IDE接口与主板连接。控制器电路就驻留在驱动器中,不再需要单独的适配器卡。[2]IDE = Integrated Development Environment,集成开发环境,可以辅助开发程式的应用软件。[3]IDE = Institut International des Droits de I'Enfant,国际儿童权利协会,于1995年在瑞士瓦莱州西永市成立。[4]匈牙利政党IDEIDE = The party of Internet Democracy,匈牙利政党。[5]IDE(Integrated Development Environment,集成开发环境)。其缩写形式IDE同时也代指“电子集成驱动器”。
集成开发环境(简称IDE)软件是用于程序开发环境的应用程序,一般包括代码编辑器、编译器、调试器和图形用户界面工具。该程序可以独立运行,也可以和其它程序并用。例如,BASIC语言在微软办公软件中可以使用,可以在微软Word文档中编写WordBasic程序。IDE为用户使用Visual Basic、Java和PowerBuilder等现代编程语言提供了方便。
IDE多被用于开发HTML应用软件。例如,许多人在设计网站时使用IDE(如HomeSite、DreamWeaver、FrontPage,等等),因为很多项任务会自动生成。
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Define IDE :[aid]abbr. 集成电路设备(=integrated drive electronics)例句与用法:1. Hey! I've got this really good ide we make this investment which will bring us a lot of benefits.
嘿!我有一个非常好的主意:我们进行投资,这会给我们带来很多的利润。
니가 잘 지내지 못하는걸 보니까,내가 안심했어
参考资料:
니가 잘 지내지 못하는걸 보&#45768
看看这个网站吧,能帮你的~
n.集成电路设备,智能磁盘设备
集成开发环境(integrated development environment)
电子集成驱动器
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Hi there!It is very good that you found time to write me a letter, communication is very important in studying languages!Good for you! As for pictures that you mentioned before, it is quite easy to get- just bring to the class your USB-storage disk, and I'll copy those pics for you.Fell freely in future with any request!I'll be glad to assist you.Sincerely Andy.
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为了更贴合汉语习惯,适当修改了一下,不影响整体意思:)你好,对于你百忙之中抽出时间给我写信,感激万分。交流在学习语言的过程中是十分重要的!感谢!关于你之前提到过的图片,那件事很简单,你只要把USB储存卡带到课堂上来,我就能帮你复制好了。有任何要求都提吧,别客气。我会乐意帮你的。真诚地,安迪:)
LS的机器翻译很容易被看出来的哦,至少要修修吧
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这是很好的,你要找时间去给我写一封信,交流是非常重要的在学习语言。
太好了!至于图片,您前面提到的,它很容易,你就给班上USB-storage磁盘,我会抄那些照片给你。
在未来的任何自由下降的要求!
我很乐意帮助你。
真诚的安迪。
你能抽空给我写信真是太好了。交流对于语言学习来说非常重要。
这真是太好了。
至于你先前提到的图片,这很容易得到。只要你将移动硬盘带到教室,我就能帮你复制一份。
如果以后有任何需要,请一定要告诉我。我会很乐意帮助你。
你真诚的,
你好!抽空给我写信很好啊,对于学习语言来说,交流是非常重要的!对于你很有帮助!你之前提到的那些照片,其实很简单只要你带着你的优盘到教室,我拷给你就行了!以后有任何的问题你都要轻松自在点!很高兴能帮助你!你的挚友 安迪
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