[doc] 几种丝状真菌原生质体的形成与再生
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黑曲霉原生质体转化效率影响因子研究
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3秒自动关闭窗口【求助/交流】丝状真菌原生质体制备 - 微生物 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
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【求助/交流】丝状真菌原生质体制备
我最近在做被孢霉原生质体，在显微镜下能观察到亮亮的绿色的椭圆或者球型的菌体，应该是原生质体，涂布于高渗再生培养基（高渗溶液用的是0.7M NaCl，培养基制备的时候也是配成了0.7M NaCl），没有任何结果，有没有前辈了解这方面的情况，求教？
之前有发过，不过大家建议我发专业版块，我改正，转到这边，希望有经验的能帮我分析下，不甚感激～
用NaCl做高渗的可能会导致你的菌长出来，试试糖类看看！ 0.7M NaCl很少用啊，一般我们都用1M山梨醇，效果挺好的。
做原生质体，关键是酶的配比及酶解时间。酶配好了以后，在原生质体形成的过程中要不断的取样在显微镜下观察，酶解时间短，原生质体形成率小，时间久了，再生困难。原生质体形成率和再生率都要搞定才算成功。
个人意见，望斟酌:D Originally posted by ls2046 at
0.7M NaCl很少用啊，一般我们都用1M山梨醇，效果挺好的。
做原生质体，关键是酶的配比及酶解时间。酶配好了以后，在原生质体形成的过程中要不断的取样在显微镜下观察，酶解时间短，原生质体形成率小，时间久了， ... 准备用蔗糖的做一批，酶解时间之前有做过八小时和十四小时的，均没有结果，怎么确定最适酶解时间呢？ 时间长短和酶的浓度关系较大，不过你的八小时时间太长了吧，我们做黑曲霉的一般两到三小时就够了。时间太久了再生很困难的。可以没隔半小时就取样，然后显微镜观察原生质体形成情况，看到大部分（80——90%）都变成了球形，而很少有丝状形态存在就应该差不多了，呵呵，，， Originally posted by ls2046 at
时间长短和酶的浓度关系较大，不过你的八小时时间太长了吧，我们做黑曲霉的一般两到三小时就够了。时间太久了再生很困难的。可以没隔半小时就取样，然后显微镜观察原生质体形成情况，看到大部分（80——90%）都变 ... 我有做过酶解十四个小时的，还是有很多菌丝～～～～～～～～你之前做过的，有图吗？ 山梨醇常用，还有，如果酶的浓度合适1-2h就够了，还有温度也要考虑。
另外，显微镜观察要明确是不是原生质体，还可能是孢子和水泡呢。原生质体只剩细胞膜，所以边缘不特别明显 有没有简单易行的方法证实那是不是原生质体，我在显微镜下能观察到绿色的小小的游离的单个物质，不知道是不是，我用的蜗牛酶它里面也有类似的物质，这就让我很疑惑我有没有得到原生质体，昨天一个小时以后镜鉴得出的结论，我根本无法区分是原生质体还是酶里面的东西。 Originally posted by juinia at
我有做过酶解十四个小时的，还是有很多菌丝～～～～～～～～你之前做过的，有图吗？ 不好意思啊，现在图都找不到了。
原生质体的形状都是球形的，和孢子的形状差不多，，，，
另外，你用了那么久的时间，可能是酶的用量偏少的原因，，，，
可以参考《黑曲霉原生质体的制备、再生及转化条件》，作者：姚婷婷，食品与生物技术学报，P116-120。 你用的这个菌不了解，不过我做过很多木霉的，还有毛壳菌、青霉的，链霉菌的，个人认为原生质体应该没什么颜色，除非你显微镜有绿色滤光片。原生质体很好认的，像孢子，大小与渗稳剂有关，边缘不像孢子那样清晰。有照片的话帮你看看 如果没长出菌来说明不是孢子，也不是菌丝，可能也不是原生质体（或者是原生质体，但是破了）。可加大酶的浓度，温度稍微提高，连续显微镜观察，能看到原生质体从菌丝上脱落下来。坚持观察几小时，应该能看到原生质体是什么样，当然要是酶不灵还是看不到 这个是我镜鉴的图，大家帮忙看看～
不太清晰，可以肯定红圈里的不是，有一个倒是很像，似乎可以肯定是的，不会传照片呀。 就是上边红圈的菌丝向上，陆续断裂，然后在前面有个清晰的圆圈，就是下面还有一片黑色模糊的影子的那个球。
目前状况像是刚刚开始有原生质体释放的时期 这是今天观察的结果～
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E-mail： & QQ：8835100大众医药网 - 文献资料 - 一种丝状真菌DNA提取方法的介绍
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- 皮肤病学
一种丝状真菌DNA提取方法的介绍
中华皮肤科杂志 2000年第3期第33卷 技术与方法
作者：陈官芝　刘维达
单位：210042南京，中国医学科学院　中国协和医科大学皮肤病研究所
　　由曲霉、毛霉、镰刀菌、青霉等丝状真菌引起的人类感染日益多见。研究丝状真菌致病的分子机制以及进行临床快速基因诊断已成为热点。而这些工作的前提就是获取足量高质稳定的供分析用的DNA分子。丝状真菌的生长周期、菌丝形态、孢壁成分等均与酵母样真菌有相当差别，其DNA的提取有一定难度。我们经过反复摸索、比较，找出一个较为简便、经济、可靠的方法，现介绍如下。
　　一、菌种
　　烟曲霉（A1）、黑曲霉（A3）、岛青霉（B2）、色斑青霉（B6）、本色镰刀菌（B16）、串珠镰刀菌（B36）、多变毛霉（B3）和马内菲青霉（B33c），均由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心（中国医学科学院皮肤病研究所）提供。常规保藏，定期传种。
　　二、DNA提取
　　方法1：将8种菌接种至马铃薯葡萄糖培养基（PDA）平皿上，置30℃温箱培养24h，然后移至室温继续培养至成熟（平均7～14d）。用含0.0125％吐温20的生理盐水10mL洗下孢子，4层无菌纱布过滤，菌孢子悬液离心，3500r/min,10min。孢子沉淀用SCE液（120mmol/L柠檬酸钠，1mol/L山梨醇，0.1mol/LEDTA）洗2次。用细胞计数板调整孢子浓度为1～5×107个/mL，取1mL移入1.5mLEp管中。离心后沉淀加裂解液Ⅰ（50mmol/LTris－HCl,pH7.5,10mmol/LEDTA,1％β－巯基乙醇，1％Novozym234）0.5mL，混匀，30℃孵育lh，离心，4000r/min。沉淀加裂解液Ⅱ（10％SDS,lmg/mL蛋白酶K）0.5mL混匀后置55℃水浴2h或过夜。将Ep管置冷冻离心机，4℃，12000r/min，离心10min，取上清液加等体积酚－氯仿－异戊醇（25∶24∶1），充分混匀。离心后取上清液置另管。重复抽提2～3次后加2倍体积无水乙醇，轻微晃动可见丝状或絮状物出现。若不满意则置－20℃2h至过夜。12000r/min，4℃离心沉淀DNA，70％乙醇漂洗，充分晾干后加20μLTE缓冲液溶解，放4℃冰箱备用。
　　方法2：取保藏菌种PDA传种24h后，接种至20mL沙堡液基，置30℃恒温摇床160次/min振荡培养。约3～5d后可见培养液中有丰富的菌丝球。称取湿重为10mg的菌丝球置Ep管中，加裂解液Ⅰ，其余步骤同方法1。
　　三、PCR扩增及凝胶电泳
　　引物选自vanBurik等[1]推荐的来自rRNA高度保守序列的两对引物，由上海生工生物工程公司合成。在50μL反应总体积中，含5μL模板DNA，2UTag酶，200μmol/LdNTP,2×30pmol引物，1.5mmolMgCl。除模板外均为Promega公司产品。反应在Perkin－Elmer2400PCR扩增仪上进行。94℃，5min初始变性后进入循环：94℃30s、55℃30s、72℃60s，共35个循环，最后72℃延伸5min。取15μL扩增产物加入2％琼脂糖凝胶孔中。电泳缓冲液为0.5×TBE，电压100V，电流50mA,电泳2h。电泳后凝胶用EB染色，双蒸水脱色，在透射紫外灯下观察、照像。
　　四、结果
　　方法1选用的真菌通用引物可将8种真菌的靶DNA扩增出一条580bp大小的条带（见图1），只是黑曲霉的带较弱。方法2所用引物的扩增产物较小，平均大小为245bp，且大小随种属的不同而略有差异，但8种菌的DNA条带亮度基本一致，如图2所示。另外，方法2示RNA较多，但未影响扩增效果。
图1 通用引物1扩增8丝状真菌DNA电泳图谱
图2 通用引物2扩增8丝状真菌DNA电泳图谱
　　参 考 文 献
　　1，van Burik J A, Myerson D, Schreckhise RW,et al. Panfungal PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens. J Clin Miorobiol, 9－ 1175.
　　(收 稿 日 期 ： 1999－ 02－ 04)