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出门在外也不愁FLUOROCYCLOBUTANYLIMIDAZOLE COMPOUNDS
WIPO Patent Application WO/
Provided are fluorocyclobutanylimidazole compounds of formula (I) and N-oxides, pharmaceutically acceptable salt or prodrugs thereof. Also provided are the preparation method thereof and intermediates useful in the preparation of the compounds. Also provided are a pharmaceutical composition containing the compounds and optionally at least one pharmaceutically acceptable excipient and the use thereof in the preparation of drugs for treating diseases relating to tyrosine kinase pathway disorders, especially cancers, wherein R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, m and n are as defined in the description.
Inventors:
LI, Xiaoqiang (Suite 522, Kobo Times Stage 2 Block C5 Lanyuan Road, Huayuan Hi-Tech Industrial Park, Tianjin 4, 300384, CN)
LI, Yong (Suite 522, Kobo Times Stage 2 Block C5 Lanyuan Road, Huayuan Hi-Tech Industrial Park, Tianjin 4, 300384, CN)
CHEN, Yongsheng (Suite 522, Kobo Times Stage 2 Block C5 Lanyuan Road, Huayuan Hi-Tech Industrial Park, Tianjin 4, 300384, CN)
Application Number:
Publication Date:
07/17/2014
Filing Date:
12/18/2013
Export Citation:
TERRABAY PHARMACEUTICALS, INC. (Suite 522, Kobo Times Stage 2 Block C5 Lanyuan Road, Huayuan Hi-Tech Industrial Park, Tianjin 4, 300384, CN)
International Classes:
C07D401/14; A61K31/506; A61P35/00; A61P35/02; C07D233/64
View Patent Images:
&&&&&&PDF help
Foreign References:
CNACN1938282A
Attorney, Agent or Firm:
PEKSUNG INTELLECTUAL PROPERTY LTD. (908 Shining Tower, 35 Xueyuan Road Haidian District, Beijing 1, 100191, CN)
权利要求书
1. 式（I ) 的氟代环丁烷基咪唑类化合物及其 N-氧化物、 其可药用盐或其前 药，
、 R2、 R4、 R6或 R7各自独立地代表 H、 卤素、 d-C8烷基、 d-C8烷氧基、 C2-C8烯基或 C2-C8炔基，其中所述 d-C8烷基、 d-C8烷氧基、 C2-C8烯基和 C2-C8 炔基任选独立地被选自卤素、 -CN、 -ORa、 -C(0)Ra、 -C(0)ORa、 -OC(0)Ra和 -PhRa 的取代基取代一次或多次；
R3和 R5各自独立地代表 H、 d-C8烷基、 C2-C8烯基或 C2-C8炔基， 其中所 述 d-C8垸基、 C2-C8婦基和 C2-C8炔基任选独立地被选自 素、 -CN、 -ORa、 -C(0)Ra、 -C(0)ORa、 -OC(0)Ra和 -PhRa的取代基取代一次或多次； 且
Ra独立地代表 H或 d-C8烷基；
m代表 0、 1或 2;
n代表 0、 1、 2、 3或 4;
优选地， 、 R2、 R4、 R6或 R7各自独立地代表 H、 卤素、 d-C6烷基、 d-C6 烷 L&，其中所述 CrC6烷基和 d-C6烷！ 任选独立地被选自卤素、 -CN、 -ORa、 -C(0)Ra、 -C(0)ORa、 -OC(0)Ra和 -phRa的取代基取代一次或多次；
R3和 R5各自独立地代表 H或 d-C6烷基，其中所述 d-C6烷基任选独立地被 选自卤素、 -CN、 -ORa、 -C(0)Ra、 -C(0)ORa、 -OC(0)Ra和 -phRa的取代基取代 一次或多次； 并且
Ra独立地代表 H或 d-C6烷基；
m代表 0或 1 ；
n代表 0、 1、 2或 3;
更优选地， 、 R2、 R4、 R6或 R7各自独立地代表 H、 氟、 氯、 溴以及选自 下述的 d-C4烷基和（^-(^烷氧基， 所述 d-C4烷基和 d-C4烷氧基任选被一个或 多个选自氟和氯的卤素取代： 曱基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁基、 仲丁基、 曱 L&、 乙 L&、 正丙 L&、 异丙氧基、 正丁 L&、 叔丁氧基、 异丁 L&、 CF3、 CHF2、 CH2F、 CF3CF2、 CH2FCHC1、 CC13、 CHC12、 CH2CH2C1、 OCF3、 OCHF2、 OCH2F、 CF3CF20、 OCH2CF3或 OCH2CH2Cl;
R3和 R5各自独立地代表 H以及选自下述的 d-C4烷基和 d-C4烷氧基，所述 d-C4烷基和 d-C4烷 任选被一个或多个选自氟和氯的卤素取代：曱基、乙基、 正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、 CF3、 CHF2、 CH2F、 CF3CF2、 CH2FCHC1、 CC13、 CHC12、 CH2CH2C1; 并且
m代表 0 ；
n代表 0或 1;
最优选地， 为 11、 为 H、 为 CF3、 R4为 H、 R5为曱基、
3/4 为 H、 R7 为 H、 m为 O JL n为 0或 1， 所述式（I ) 的化合物为 4-曱基 -3-{[4-(3-吡啶基 )-2- 嘧啶基】
1/2 }-N-[5-[4-(3，3-二氟代环丁基) -1H-咪唑 -1-基】 -3- [(三氟曱基)苯基】 -苯曱 酰胺， 结构如式（I-a )所示：
2. 制备权利要求 1的式（I ) 的化合物的方法， 包括：
(A) 在稀释剂的存在下且任选在催化剂和碱的存在下，使式（II )的化合物与 式（III ) 的化合物发生偶联反应，
、 R2、 R3、 、 m和 n如权利要求 1中定义， 并且
X表示选自卤素和三氟曱磺酸酯的离去基团， 优选碘;
R5、 R6、 R7、 m和 n如权利要求 1中定义；
( B )在稀释剂的存在下且任选在碱的存在下， 使式（IV ) 的化合物与尼罗 乙酯
、 R2、 R3、 m和 n如权利要求 1中定义，
R = Me, Et (尼罗乙酯或曱酯）。
3. 根据权利要求 2的制备方法， 其中， 式（II ) 的化合物和式（III ) 的化合 物反应的摩尔比通常为 1:1至 1:3， 优选 1:1至 1:2， 更优选 1:1.5;
催化剂为能够催化芳族卤化物或三氟曱磺酸化物与胺发生金属偶联反应的金 属催化剂，优选金属钯催化剂，如 Pd(dppf)Cl2、 Pd(PPh3)2Cl2、 Pd(PPh3)4、 Pd(dba)2 或 Pd(OAc)2; 碱为碱（土）金属碳酸盐、 碱（土）金属氢氧化物或碱 (土）金属 醇盐， 优选碱金属碳酸盐， 更优选 K2C03、 Cs2C03; 式（IV )的化合物与尼罗曱 酯或尼罗乙酯反应的摩尔比为 1:1至 1:3， 优选 1:1至 1:2， 更优选 1:1.1; 碱为碱 (土）金属醇盐， 优选碱金属醇盐， 更优选叔丁醇钾或叔丁醇钠。
4. 式（II ) 的化合物：
、 R2、 R3、 、 m和 n如权利要求 1中定义， 并且
X表示离去基团， 优选卤素和三氟曱磺酸酯， 更优选碘，
最优选地， 式（II) 的化合物为如式（Π-a) 结构的化合物:
( II-a )。
5. 制备权利要求 4的式（II) 的化合物的方法， 包括：
在稀释剂的存在下且任选在碱的存在下， 使式（IV) 的化合物与式（V) 的 化合
、 R2、 R3、 m和 n如权利要求 1中定义;
R4、 n如权利要求 1中定义， 并且 X表示离去基团， 优选卤素和三氟曱磺酸 酯， 更优选碘，
Rb代表 素或羟基；
在所述方法中， 式（IV)化合物和式（V)化合物反应的摩尔比为 1:1至 1:3， 优选 1:1至 1:2， 更优选 1:1; 合适的碱为叔胺， 优选 N，N-二异丙基乙胺与 4-二曱 氨基吡啶的混合物。
、 R2、 R3、 m和 n如权利要求 1中定义；
最优选地， 式（I 的化合物为如式（IV-a) 的结构的化合物:
( IV-a )。
7. 制备权利要求 6的式（IV) 的化合物的方法， 包括：
在稀释剂的存在下且任选地在催化剂和碱的存在下， 使式（VI)化合物与式 ( VII )化合物发生偶联反应，
HN I /^K1)m
和 m如权利要求 1中定义；
R2、 R3、 n如权利要求 1中定义且 X表示离去基团， 优选卤素和三氟曱磺酸 酯， 更优选碘；
在所述方法中，式（VI)化合物和式（VII)化合物反应的摩尔比为 1:1至 1:3， 优选 1:1至 1:2， 更优选 1:1.5; 合适的催化剂为 Cu(I)或 Cu(II)盐， 如 Cul， Cu20 或 Cu(OAc)2; 合适的碱为无机碱或有；
3/4 ， 其中无 优选碱金属碳酸盐， 更优 选 K2C03、 Cs2C03， 有机碱为三乙胺或吡啶。
8. 根据权利要求 7的制备方法中的式（VI) 的化合物：
和 m如权利要求 1中定义；
最优选地， 式（VI ) 的化合物为如式（VI -a ) 的结构的化合物：
9. 权利要求 1的式（I ) 的化合物及其 N-氧化物或其可药用盐用于制备抑制 受体型酪氨酸激酶或非受体型酪氨酸激酶的活性， 优选抑制受体型络氨酸激酶活 性， 更优选抑制 ABL激酶活性的药物的用途。
10. 权利要求 1的式（I )的化合物及其 N-氧化物或其可药用盐用于制备抑制 肿瘤细胞增殖的药物的用途， 所述肿瘤细胞包括 L1210、 Jurkat E6-l、 HL-60、 A549、 K562、 RPMI8226. THP-1和 /或 Ba F3,,
11. 包含权利要求 1的式（I )的化合物及其 N-氧化物或其可药用盐以及任选 至少一种可药用赋形剂的药物组合物， 所述药物组合物优选采用皮下给药的药剂 形式。
12. 权利要求 11的药物组合物用于制备治疗与酪氨酸激酶途径失调相关的疾 病， 特别与 ABL激酶途径失调相关的疾病的药物的用途。
13. 权利要求 11的药物组合物用于制备治疗与肿瘤细胞增殖相关的疾病， 特 别是癌症的药物的用途， 所述癌症包括白血病、 骨髓瘤、 肠胃瘤和肺癌。
Description:
氟代环丁烷基咪唑类化合物 技术领域
本发明涉及式（I ) 的氟代环丁烷基咪唑类化合物及其 N-氧化物、 其可药用 盐或其前药、 涉及其制备方法以及在制备所述化合物中有用的中间体， 本发明还 涉及包含本发明的化合物以及任选至少一种可药用赋形剂的药物组合物以及其用 于制备治疗与酪氨酸激酶途径失调相关的疾病一特别是癌症的药物的用途。 背景技术
蛋白激酶是一类调节多种重要的生物过程的酶， 其可以分为受体型和非受体 型。 其参与控制多种重要的细胞功能例如信号转导、 分化和增殖。 除参与正常的 组织 /器官的功能以外， 许多蛋白激酶还对患有疾病例如癌症的人体产生重要影 响。 在失调的情况下， 致癌蛋白激酶可以引起肿瘤形成和生长， 并进一步助长肿 瘤的维持和发展。
蛋白激酶抑制剂作为分子靶向性药物中一类常见的治疗药物， 在恶性肿瘤的 治疗中有很好的应用前景。 早期上市的蛋白激酶抑制剂主要是针对单一靶点的特 异性抑制剂， 但是因其靶点单一而很容易在靶点激酶突变后产生耐药性。 广谱性 激酶抑制剂则由于其可同时靶向多个激酶分子和多条信号通路， 因此不但可以避 免单一靶点突变造成的耐药性， 而且可以显著扩大其抗瘤谱。 通过大范围肿瘤类 型的突变， 将突变标记的激酶作为药物靶点促进了针对激酶组的广谱性激酶抑制 剂的研究 ( Futreal, P.A. et al. A census of human cancer genes. Nature Rev. Cancer. 4,177-183 ( 2004 ) )。
许多酪氨酸激酶（包括受体型和非受体型）与癌症相关（参见 Jianming Zhang, Priscilla L Yang and Nathanael S Gray. Targeting cancer with small molecular kinase inhibitors. Nature Review Cancer, 2009， 9(l):28-39 ),, 受体酪氨酸激酶 ( RTK )具有细胞外部分、 跨膜域和细胞内部分， 而非受体酪氨酸激酶的整体位 于细胞内。 c-Kit酪氨酸激酶的突变与在胃肠间质的肿瘤中的存活率下降有关。 在 急性骨髓性粒细胞性白血病中， Flt-3突变预示着无瘤生存率下降。 对血管发生起 重要作用的 VEGFR的表达与肺癌的较低的存活率有关。 Bcr-Abl表达是慢性骨 髓性粒细胞性白血病应答的重要的预测器， 并且 Src酪氨酸激酶在结肠直肠癌的 所有阶段是预后不良的指示器。 因此， 针对酪氨酸激酶组的广谱性激酶抑制剂在 抗肿瘤研究中具有很好的应用前景。
酪氨酸激酶抑制剂可作为三磷酸腺苷（ATP ) 与酪氨酸激酶结合的竟争性抑 制剂； 也可作为酪氨酸的类似物， 阻断酪氨酸激酶的活性， 抑制细胞增殖。 目前 临床上最常用的针对 BCR-ABL酪氨酸激酶的小分子抑制剂包括第一代药物伊马 替尼， 第二代药物达沙替尼和尼罗替尼， 其主要通过抑制 BCR-ABL融合蛋白， 从而发挥抗白血病作用。
2012年 1月， 美国 FDA批准了辉瑞公司的小分子酪氨酸激酶抑制剂阿西替 尼上市， 2012年 12月美国 FDA批准了亚瑞亚德公司的小分子酪氨酸激酶抑制剂 帕奈替尼上市， 这预示着又一轮抗肿瘤靶向药物研究的新高潮， 以酪氨酸激酶为 靶点进行药物研发已成为国际上抗肿瘤药物研究的热点。 发明内容
通过对酪氨酸激酶抑制剂的进一步开发和研究， 发明人发现式（I )的新的氟 代环丁烷基咪唑类化合物可用于治疗与酪氨酸激酶途径失调相关的疾病一特别是 癌症。 与常见的三种酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼、 尼罗替尼和达沙替尼相比， 本 发明化合物具有显著更优的药理和药性指标， 且具有靶向明确、 毒性低、 药效高 的优点。
因此， 在一个方面， 本发明提供一种式（I )的氟代环丁烷基咪唑类化合物及 其 N-氧化物、 其可药用盐或其前药，
、 R2、 R4、 R6或 R7各自独立地代表 H、 卤素、 d-C8烷基、 d-C8烷氧基、 C2-C8烯基或 C2-C8炔基，其中所述 d-C8烷基、 d-C8烷氧基、 C2-C8烯基和 C2-C8 炔基任选独立地被选自卤素、 -CN、 -ORa、 -C(0)Ra、 -C(0)ORa、 -OC(0)Ra和 -PhRa 的取代基取代一次或多次；
R3和 R5各自独立地代表 H、 d-C8烷基、 C2-C8烯基或 C2-C8炔基， 其中所 述 d-C8垸基、 C2-C8婦基和 C2-C8炔基任选独立地被选自 素、 -CN、 -ORa、 -C(0)Ra、 -C(0)ORa、 -OC(0)Ra和 -PhRa的取代基取代一次或多次； 且
Ra独立地代表 H或 d-C8烷基；
m代表 0、 1或 2;
π代表 0、 1、 2、 3或 4。 在另一个方面， 本发明还提供制备式（I) 的化合物的方法， 包括：
(A)在稀释剂的存在下且任选在催化剂和碱的存在下， 使式（II)的化合物 与式（III) 的化合物发生偶联反应，
、 R2、 R3、 、 m和 n如上定义， 并且
X表示离去基团；
R5、 R6、 R7、 m和 n如上定义。
(B)在稀释剂的存在下且任选在碱的存在下， 使式（IV) 的化合物与尼罗 乙酯或尼罗曱酯发生缩合反应，
Rj. R2、 R3、 m和 n如上定义;
R = Me, Et (尼罗乙酯或曱酯） 在又一个方面， 本发明还包括在制备本发明的式（I )的化合物中有用的中间 体一式（II )和式（IV ) 的化合物及其制备方法以及在制备式（IV ) 的化合物中 有用的中间体一式（VI ) 的化合物及其制备方法。
在又一个方面， 本发明还提供式（I ) 的化合物及其 N-氧化物、 其可药用盐 或其前药用于抑制受体型或非受体型酪氨酸激酶的用途。
在又一个方面， 本发明还提供使用式（I ) 的化合物及其 N-氧化物、 其可药 用盐或其前药用于制备抑制酪氨酸激酶途径的药物的用途。
在又一个方面， 本发明还提供使用式（I ) 的化合物及其 N-氧化物、 其可药 用盐或其前药用于制备抑制肿瘤细胞增殖的药物的用途。
在又一个方面， 本发明还提供包含式（I ) 的化合物及其 N-氧化物、 其可药 用盐或其前药以及至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
在又一个方面， 本发明还提供使用式（I ) 的化合物及其 N-氧化物、 其可药 用盐或其前药以及任选至少一种可药用赋形剂结合用于制备治疗与酪氨酸激酶途 径失调相关的疾病的药物的用途。
在又一个方面， 本发明还提供使用式（I ) 的化合物及其 N-氧化物、 其可药 用盐或其前药以及任选至少一种可药用赋形剂结合用于制备治疗与肿瘤细胞增殖 相关的疾病的药物的用途。
在又一个方面， 本发明还提供式（I ) 的化合物及其 N-氧化物、 其可药用盐 或其前药以及任选至少一种可药用赋形剂结合用于制备治疗癌症的药物的用途。 附图说明
图 1示出了 TEB-415和十字孢碱对 FLT3的 IC50测定。
图 2示出了 TEB-415和十字孢碱对 PDGFR oc的 IC50测定。
图 3示出了 TEB-415和十字孢碱对 PDGFR β的 IC50测定。
图 4示出了 TEB-415和十字孢碱对 AKT1的 IC50测定。 图 5示出了 TEB-415和十字孢碱对 EGFR的 IC50测定。
图 6示出了 TEB-415和十字孢碱对 C-KIT的 IC50测定。
图 7示出了 TEB-415和十字孢碱对 JAK2的 IC50测定。
图 8示出了 TEB-415和十字孢碱对 ABL的 IC50测定。
图 9示出了 TEB-415在 L1210细胞中的的 IC50测定。
图 10示出了 TEB-415在 Jurkat E6-1细胞中的的 IC50测定。
图 11示出了 TEB-415在 HL-60细胞中的的 IC50测定。
图 12示出了 TEB-415在 A549细胞中的的 IC50测定。
图 13示出了 TEB-415在 K562细胞中的的 IC50测定。
图 14示出了 TEB-415在 RPMI8226细胞中的的 IC50测定。
图 15示出了 TEB-415在 THP-1细胞中的的 IC50测定。
图 16示出了 TEB-415在 Ba F3细胞中的的 IC50测定。
图 17示出了模型动物在接受 TEB-415及对照药物治疗后的体重变化（针对 分组 1 )。
图 18示出了实验动物在给药 14天（接种 22天）相对给药第 1天的体重变化 百分率（针对分组 1 )。
图 19示出了经治疗后的 K562人源慢性白血病移植模型肿瘤的生长曲线（针 对分组 1 )。
图 20示出了模型动物在接受 TEB-415及对照药物治疗后的体重变化（针对 分组 2 )。
图 21示出了模型动物在接受 TEB-415及对照药物治疗后的体重变化率（针 对分组 2 )。
图 22示出了经治疗后的 K562人源慢性白血病移植模型肿瘤的生长曲线（针 对分组 2 )。 具体实施方式
本文所使用的术语 "烷基" 以及在结合定义（例如烷氧基） 中的烷基基团可 为直链或支链， 其优选具有低级碳骨架， 例如含有 1-8个碳原子、优选 1-6个碳原 子， 更优选 1-4个碳原子。 所述烷基可以为， 例如曱基、 乙基、 丙基（如正丙基 或异丙基）、 丁基（如正丁基、 异丁基或叔丁基）、 戊基（如正戊基、 异戊基或新 戊基）、 己基（如正己基、异己基，3-曱基戊基、 2,2-二曱基丁基或 2,3-二曱基丁基） 和庚基（如正庚基、 1-曱基己基或 1,4-二曱基戊基）。
本文所使用的术语 "烷氧基" 是指烷基与氧原子连接得到的基团。 其优选具 有低级碳骨架，例如含有 1-8个碳原子、优选 1-6个碳原子，更优选 1-4个碳原子。 所述烷基可以为， 例如曱氧基、 乙氧基、 丙氧基或异丙氧基
本文所使用的术语 "卤素" 为氟、 氯、 溴或碘。 被卤素取代的基团表示被卤 素、 优选被氟、 氯和 /或溴、 更优选被氟和 /或氯部分取代或取代（例如单取代、 二 取代或三取代）的基团， 例如 CF3、 CHF2、 CH2F、 CF3CF2、 CH2FCHC1、 CC13、 CHC12、 CH2CH2C1、 OCF3、 OCHF2、 OCH2F、 CF3CF20、 OCH2CF3和 OCH2CH2Cl 等。
本发明所述的基团优选未被取代或被单取代至三取代， 更优选被单取代至二 取代。
在本发明中， 非固定位置的键表示该键位于所标区域内的任意可能连接的位 置上。
在本发明中， 式（I )的定义涵盖由其具体空间形式限定的所有可能的立体异 构体， 如对映异构体、 非对映异构体或顺 -反异构体及上述立体异构体的混合物， 即如果合适， 本发明既包括纯的立体异构体， 又包括其异构体的混合物。
对于式（I ) 的各种取代基的可能的结合， 必须遵循化合物结构的一般原则， 即式（I ) 不包括本领域技术人员已知的违背自然法则的化合物。 主题， 包括其制备方法、 中间体、 中间体的中间体、 前体、 可药用盐以及药物组 合物。 本发明所述式（I ) 的化合物及其 N-氧化物、 其可药用盐或其前药，
、 R2、 R4、 R6或 R7各自独立地代表 H、 卤素、 d-C8烷基、 d-C8烷 L&、 C2-C8烯基或 C2-C8炔基，其中所述 d-C8烷基、 d-C8烷氧基、 C2-C8烯基和 C2-C8 炔基任选独立地被选自卤素、 -CN、 -ORa、 -C(0)Ra、 -C(0)ORa、 -OC(0)Ra和 -PhRa 的取代基取代一次或多次；
R3和 R5各自独立地代表 H、 d-C8烷基、 C2-C8烯基或 C2-C8炔基， 其中所 述 d-C8垸基、 C2-C8婦基和 C2-C8炔基任选独立地被选自 素、 -CN、 -ORa、 -C(0)Ra、 -C(0)ORa、 -OC(0)Ra和 -PhRa的取代基取代一次或多次； 且
Ra独立地代表 H或 d-C8烷基；
m代表 0、 1或 2;
π代表 0、 1、 2、 3或 4。
上文的式（I )提供了对本发明化合物的宽泛定义， 关于优选、 更优选的、 最 优选的定义或范围说明如下：
本发明所述式（I ) 的化合物及其 N-氧化物、 其可药用盐或其前药， 其中 、 R2、 R4、 或 R7优选各自独立地代表 H、 卤素、 d-C6烷基、 CrC6烷 氧基， 其中所述！^-！^烷基和 d-C6烷！ 任选独立地被选自卤素、 -CN、 -ORa、 -C(0)Ra、 -C(0)ORa、 -OC(0)Ra和 -PhRa的取代基取代一次或多次；
R3和 R5优选各自独立地代表 H或 d-C6烷基， 其中所述 d-C6烷基任选独 立地被选自卤素、 -CN、 -ORa、 -C(0)Ra、 -C(0)ORa、 -OC(0)Ra和 -PhRa的取代 基取代一次或多次； 并且
1^优选独立地代表 H或 d-C6烷基；
m优选代表 0或 1 ；
π优选代表 0、 1、 2或 3。
本发明所述式（I ) 的化合物及其 N-氧化物、 其可药用盐或其前药， 其中 、 R2、 R4、 R6或 R7更优选各自独立地代表 H、 氟、 氯、 溴以及选自下述 的 d-C4烷基和 d-C4烷氧基， 所述 d-C4烷基和 d-C4烷氧基任选被一个或多个 选自氟和氯的卤素取代： 曱基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁 基、 仲丁基、 曱氧基、 乙氧基、 正丙氧基、 异丙 L&、 正丁氧基、 叔丁氧基、 异 丁 L&、 CF3、 CHF2、 CH2F、 CF3CF2、 CH2FCHC1、 CC13、 CHC12、 CH2CH2C1、 OCF3、 OCHF2、 OCH2F、 CF3CF20、 OCH2CF3或 OCH2CH2Cl;
R3和 R5更优选各自独立地代表 H以及选自下述的 d-C4烷基， 所述 d-C4 烷基任选被一个或多个选自氟和氯的卤素取代： 曱基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 叔丁基、 仲丁基、 CF3、 CHF2、 CH2F、 CF3CF2、 CH2FCHC1、 CC13、 CHC12、 CH2CH2C1; 并且
m代表 0; n更优选代表 0、 1或 2。
在一个最优选的实施方案中， 为 11、 为 H、 R3为 CF3、 为 H、 R5为 曱基、 R6为 H、 R7为 H、 m为 0且 n为 0或 1， 所述式（I )的化合物为： 4-曱基 -3-{[4-(3-吡啶基）-2-嘧啶基】氨基 }-N-[5-[4-(3,3-二氟代环丁基 )-1Η-咪唑 -1- 基】 -3- [(三氟曱基)苯基】 -苯曱酰胺（后文还称作 TEB-415 ), 其结构如式（I-a )所
在本发明的上下文中， 各个取代基宽泛的、 优选的、 更优选的、 最优选的定 义可按需要彼此结合。 这表示本发明包括所述式（I )的化合物， 其中， 例如， 取 代基 具有优选的定义并且取代基 和 具有一般的定义， 或者， 例如， 取代 基 具有优选的定义， 取代基 具有更优选的定义， 其余取代基具有宽泛的定 义。 为了简明， 这些各种结合没有具体表述出来， 但应认为包括在本发明的范围 内。此外， 本发明对于式（I )化合物的定义也相应地适用于制备其的各种中间体， 还包括制备其中间体的中间体。
在本发明的上下文中， 术语 "本发明的化合物"表示式（I )涵盖的化合物本 身， 以及其可药用盐、 其 N-氧化物或其前药。 本发明的式（I )化合物可通过以下的方法制备， 包括：
( A )在稀释剂的存在下且任选在催化剂和碱的存在下， 使式（II )的化合物 与式
、 R2、 R3、 、 m和 n如上定义， 并且
X表示离去基团， 优选卤素和三氟曱磺酸酯
R5、 R6、 R7、 m和 n如上定义。
在上述方法中， 式（II ) 的化合物和式（III ) 的化合物反应的摩尔比通常为 1:1至 1:3， 优选 1:1至 1:2， 更优选 1:1.5。
在上述方法中， 优选的催化剂为能够催化芳族 化物或三氟曱磺酸化物与胺 发生偶联反应形成 C-N键的金属催化剂， 优选金属钯催化剂， 如 Pd(dppf)Cl2、 Pd(PPh3)2Cl2、 Pd(PPh3)4、 Pd(dba)2或 Pd(OAc)2。
在上述方法中， 合适的碱为碱（土）金属碳酸盐、 碱（土）金属氢氧化物或 碱（土）金属醇盐， 优选碱金属碳酸盐， 更优选 K2C03、 Cs2C03。
在上述方法中，合适的稀释剂为所有对参与该反应的物质呈惰性的有机溶剂。 优选使用烃类， 例如石油醚、 正己烷、 正戊烷、 苯、 曱苯和二曱苯； 代烃， 例 如二氯曱烷、 三氯曱烷、 四氯化碳、 氯苯和邻二氯苯； 酮类， 例如丙酮和曱基异 丙基酮； 醚类， 例如乙醚、 四氢呋喃、 1,4二氧六环、 乙二醇二曱醚和二甘醇二曱 醚； 酯类， 例如乙酸乙酯； 腈类， 例如乙腈； 醇类， 例如曱醇、 乙醇、 丙醇、 异 丙醇、 丁醇、 异丁醇和叔丁醇； 酰胺类， 例如二曱基曱酰胺； 以及砜类， 例如环 丁砜； 还有亚砜类， 例如二曱基亚砜以及上述溶剂的混合物。 更优选使用 1,4二 氧六环和叔丁醇的混合溶剂。
( B )在稀释剂的存在下且任选在碱的存在下， 使式（IV ) 的化合物与尼罗 乙酯或尼罗曱酯发生缩合反应，
Rj. R2、 R3、 m和 n如上定义;
R = Me, Et (尼罗乙酯或曱酯） 在上述方法中， 式（IV )化合物与尼罗乙酯或尼罗曱酯反应的摩尔比通常为 1:1至 1:3， 优选 1:1至 1:2， 更优选 1:1.1;
所述尼罗乙酯或尼罗曱酯为市售可用， 例如尼罗乙酯购自南京奇可医药化工 有限公司， 批号为 111223， 商品名为尼罗乙酯。
在上述方法中， 合适的碱为碱（土）金属醇盐， 优选碱金属醇盐， 如异丙醇 钾、 异丙醇钠、 正丁醇钾、 正丁醇钠、 仲丁醇钾、 仲丁醇钠、 叔丁醇钠、 叔丁醇 钾， 优选叔丁醇钾或叔丁醇钠。
在上述方法中， 合适的稀释剂可以是所有对参与该反应的物质呈惰性的有机 溶剂。 优选使用烃类， 例如、 正己烷、 正戊烷、 苯、 曱苯和二曱苯； 代烃， 例 如二氯曱烷、 三氯曱烷、 四氯化碳、 氯苯和邻二氯苯； 酮类， 例如丙酮和曱基异 丙基酮； 醚类， 例如乙醚、 四氢呋喃、 1,4二氧六环、 乙二醇二曱醚和二甘醇二曱 醚； 酯类， 例如乙酸乙酯； 腈类， 例如乙腈； 酰胺类， 例如二曱基曱酰胺； 以及 砜类， 例如环丁砜； 还有亚砜类， 例如二曱基亚砜以及上述溶剂的混合物。 更优 选使用二氯曱烷或四氢呋喃。
此外， 在制备式（I )的化合物中用到的中间体一式（II )和式（IV )的化合 物以及其制备方法也在本发明的保护范围中，
式（II ) 的化合
、 R2、 R3、 、 m和 n如上定义， 并且
X表示离去基团， 优选卤素和三氟曱磺酸酯 （OTf)， 更优选碘。
在一个最优选的实施方案中， 式（II ) 的结构为如下的式（Π-a )所示:
、 R2、 R3、 m和 n如上定义；
在一个最优选的实施方案中， 式（IV) 的结构为如下的式（IV-a)所示:
所述式（II) 的化合物可通过以下方法制备：
在稀释剂的存在下且任选在碱的存在下， 使式（IV) 的化合物与式（V) 的 化合物发生缩合反应，
、 R2、 R3、 m和 n如上定义;
R4、 n和 X如上定义， 并且
Rb代表面素或羟基。 在上述方法中， 式（IV )化合物和式（V )化合物反应的摩尔比通常为 1:1 至 1:3， 优选 1:1至 1:2， 更优选 1:1;
在上述方法中， 合适的碱为所有常规的质子受体。 优选叔胺， 例如三曱胺、 三乙胺、 三丁胺、 N，N-二曱基苯胺、 N，N-二曱基苄胺、 吡啶、 N，N-二异丙基乙胺、 4-二曱 ^吡啶（DMAP )、 N-曱基哌啶、 N-曱基吗啉、 ^^二曱基 ^吡啶、 二 氮杂双环辛烷 (DABCO)、 二氮杂双环壬烯 (DBN)或二氮杂双环十一碳烯 (DBU), 优选， N，N-二异丙基乙胺与 4-二曱氨基吡啶混合物；
在上述方法中， 当 Rb为羟基时， 该反应优选在缩合剂的存在下进行， 所述缩 合剂选自： DCC、 EDCI、 CDI、 DIC、 HATU、 HBTU;
在上述方法中， 合适的稀释剂可以是所有对参与该反应的物质呈惰性的有机 溶剂。 优选使用烃类， 例如、 正己烷、 正戊烷、 苯、 曱苯和二曱苯； 代烃， 例 如二氯曱烷、 三氯曱烷、 四氯化碳、 氯苯和邻二氯苯； 酮类， 例如丙酮和曱基异 丙基酮； 醚类， 例如乙醚、 四氢呋喃、 1,4二氧六环、 乙二醇二曱醚和二甘醇二曱 醚； 酯类， 例如乙酸乙酯； 腈类， 例如乙腈； 酰胺类， 例如二曱基曱酰胺； 以及 砜类， 例如环丁砜； 还有亚砜类， 例如二曱基亚砜以及上述溶剂的混合物。 更优 选使用二氯曱烷、 四氢呋喃、 1,4二氧六环或二曱基曱酰胺。
所述式（IV )化合物可通过以下方法制备：
在稀释剂的存在下且任选地在催化剂和碱的存在下， 使式（VI )化合物与式 ( VII )化合物发生偶联反应，
HN I A(K1)n
( VI ) 其中
R2、 R3、 n和 X如上定义；
在上述方法中， 式（VI )化合物和式（VII )化合物反应的摩尔比通常为 1:1 至 1:3， 优选 1:1至 1:2， 更优选 1:1.5。
在上述方法中， 合适的催化剂可以为能够催化芳基族卤化物或三氟曱磺酸化 物与胺基化物之间的偶联反应的过渡金属催化剂，例如 Cu(I)或 Cu(II)盐，如 Cul， Cu20或 Cu(OAc)2。。
在上述方法中， 合适的碱可以是无机碱或有机碱， 其中无机碱选自碱（土） 金属碳酸盐、 碱（土）金属氢氧化物或碱（土）金属醇盐， 优选碱金属碳酸盐， 更优选 K2C03、 Cs2C03。有机碱选自三曱胺、三乙胺、三丁胺、 N，N-二曱基苯胺、 N，N-二曱基苄胺、 吡啶、 N，N-二异丙基乙胺、 4-二曱 J ^吡啶（DMAP )、 N-曱基 哌啶、 N-曱基吗啉、 N，N-二曱基氨基吡啶、 二氮杂双环辛烷 (DABCO)、 二氮杂双 环壬烯 (DBN)或二氮杂双环十一碳烯 (DBU), 优选， 三乙胺、 吡啶；
在上述方法中， 合适的稀释剂可以是所有对参与该反应的物质呈惰性的有机 溶剂。 优选使用烃类， 例如石油醚、 正己烷、 正戊烷、 苯、 曱苯、 二曱苯或硝基 苯； 代烃， 例如二氯曱烷、 三氯曱烷、 四氯化碳、 氯苯和邻二氯苯； 酮类， 例 如丙酮和曱基异丙基酮； 醚类， 例如乙醚、 四氢呋喃、 1,4二氧六环、 乙二醇二曱 醚和二甘醇二曱醚； 酯类， 例如乙酸乙酯； 腈类， 例如乙腈； 醇类， 例如曱醇、 乙醇、 丙醇、 异丙醇、 丁醇、 异丁醇、 叔丁醇和乙二醇； 酰胺类， 例如二曱基曱 酰胺； 以及砜类， 例如环丁砜； 亚砜类， 例如二曱基亚砜以及上述溶剂的混合物。 更优选使用二曱基亚砜、 二曱基曱酰胺或 1,4二氧六环。
此外， 在制备式（IV )的化合物中用到的中间体一式（VI )的化合物以及制 备式（VI ) 的化合物的方法也在本发明的保护范围中， 其中
和 m如上定义；
在一个最优选的实施方案中， 式（VI ) 的结构为如下的式（VI-a )所示：
所述式（VI )化合物
II )化合物与曱脒或其盐反应，
和111如上定义， Υ为选自氯、 溴或碘的 素， 优选氯或溴; 在上述方法中， 曱脒的盐选自曱脒盐酸盐、 曱脒醋酸盐、 曱脒曱酸盐、 曱脒 硫酸盐；
在上述方法中， 式（VII )的化合物与曱脒或其盐反应的摩尔比通常为 1:1至 1:10， 优选 1:3至 1:6， 更优选 1:5。
在上述方法中， 合适的稀释剂可以是所有对参与该反应的物质呈惰性的有机 溶剂。 优选使用烃类， 例如石油醚、 正己烷、 正戊烷、 苯、 曱苯、 二曱苯或硝基 苯； 代烃， 例如二氯曱烷、 三氯曱烷、 四氯化碳、 氯苯和邻二氯苯； 酮类， 例 如丙酮和曱基异丙基酮； 醚类， 例如乙醚、 四氢呋喃、 1,4二氧六环、 乙二醇二曱 醚和二甘醇二曱醚； 酯类， 例如乙酸乙酯； 腈类， 例如乙腈； 醇类， 例如曱醇、 乙醇、 丙醇、 异丙醇、 丁醇、 异丁醇、 叔丁醇和乙二醇； 酰胺类， 例如二曱基曱 酰胺； 以及砜类， 例如环丁砜； 亚砜类， 例如二曱基亚砜以及上述溶剂的混合物。 更优选使用乙二醇、 二曱基亚砜或 1,4二氧六环。
所述式（VII ) 的化合物可通过以下方法制备：
( A )在稀释剂的存在下且在一种碱的存在下， 使式（VIII )的化合物与卤代 乙酸
和 111如上定义， 且 Rc代表 d-C6烷基， 优选 d-C3烷基， 更优选曱基、 乙基、 正丙基、 异丙基；
在上述方法中， 式（VIII ) 的化合物和卤代乙酸反应的摩尔比通常为 1:1 至 1:6， 优选 1:2至 1:4， 更优选 1:3;
在上述方法中，合适的碱可以为 C1-6烷基锂或二 (C1-6烷基)胺基锂，优选正丁 基锂、 叔丁基锂或二异丙基胺基锂， 更优选二异丙基胺基锂；
在上述方法中， 合适的稀释剂可以是所有对参与该反应的物质呈惰性的有机 溶剂。 优选使用烃类， 例如石油醚、 正己烷、 正戊烷、 苯、 曱苯、 二曱苯或硝基 苯； 代烃， 例如二氯曱烷、 三氯曱烷、 四氯化碳、 氯苯和邻二氯苯； 醚类， 例 如乙醚、 四氢呋喃、 1,4二氧六环、 乙二醇二曱醚和二甘醇二曱醚； 酯类， 例如乙 酸乙酯； 腈类， 例如乙腈； 酰胺类， 例如二曱基曱酰胺； 以及砜类， 例如环丁砜； 还有亚砜类， 例如二曱基亚砜。 更优选使用乙醚、 四氢呋喃； 或者
( B )在稀释剂的存在下且在一种碱的存在下， 使式（IX ) 的化合物与重氮 曱烷反应，
和 Υ如上定义；
在上述方法中，式（IX )的化合物和重氮曱烷反应的摩尔比通常为 1:3至 1:10， 优选 1:3至 1:8， 更优选 1:5;
在上述方法中， 合适的稀释剂可以是所有对参与该反应的物质呈惰性的有机 溶剂。 优选使用烃类， 例如石油醚、 正己烷、 正戊烷、 苯、 曱苯、 二曱苯或硝基 苯； 代烃， 例如二氯曱烷、 三氯曱烷、 四氯化碳、 氯苯和邻二氯苯； 酮类， 例 如丙酮和曱基异丙基酮； 醚类， 例如乙醚、 四氢呋喃、 1,4二氧六环、 乙二醇二曱 醚和二甘醇二曱醚； 酯类， 例如乙酸乙酯； 腈类， 例如乙腈； 醇类， 例如曱醇、 乙醇、 丙醇、 异丙醇、 丁醇、 异丁醇、 叔丁醇和乙二醇； 酰胺类， 例如二曱基曱 酰胺； 以及砜类， 例如环丁砜； 还有亚砜类， 例如二曱基亚砜以及上述溶剂的混 合物。 更优选使用乙醚、 二氯曱烷。
在上述方法中， 式（IX ) 的化合物是市售的， 或可通过本领域的常规方法由 其相应的酸进行卤化反应而制得。
本发明还提供了式（I ) 的化合物及其 Ν-氧化物或其可药用盐用于抑制受体 型酪氨酸激酶或非受体型酪氨酸激酶的活性的用途， 优选用于抑制受体型络氨酸 激酶活性， 更优选用于抑制 ABL激酶活性。
本发明还提供了式（I ) 的化合物及其 Ν-氧化物或其可药用盐用于制备抑制 受体型酪氨酸激酶或非受体型酪氨酸激酶的活性， 优选抑制受体型络氨酸激酶活 性， 更优选抑制 ABL激酶活性的药物的用途。
在一个实施方案中， 所述的式（I ) 的化合物， 包括其 Ν-氧化物或其可药用 盐对受体型酪氨酸激酶的活性抑制的测定是通过测定其对激酶活性抑制的 IC50 而进行的。
在一个实施方案中， 所述的用于抑制所述的酪氨酸激酶活性的所述的式（I ) 的化合物的浓度从 ΙΟμΜ到 80μΜ， 例如 20μΜ、 30μΜ、 40μΜ、 50μΜ或 60μΜ， 并且使用 DMSO作为共溶剂， 所述 DMSO浓度为 1%到 10%。 在一个优选的实 施方案中， 所述的 DMSO浓度为 2.5%。
在一个实施方案中， 将一定浓度的式 （I ) 的化合物与所述的激酶以及 TK/STK3--生物素底物和 ATP 接触是在含有 50 mM Hepes/NaOH pH 7.0、 0.02%NaN3. 0.01% BSA、 0.1 mM原钒酸盐（ orthovanadate )、 5 mM MgCl2、 1 mM MnCl2和 1 mM DTT的溶液中进行的， 并且所述的反应是在室温进行的。
在一个实施方案中， 所述的检测液是含有链霉亲和素 --XL665 和 TK/STK3 抗体铕穴状化合物的混合检测液;在一些实施方案中，所述的检测液是含有 50 mM Hepes/NaOH pH 7.0、 0.1% BSA、 0.8 M KF和 20 mM EDTA的溶液稀释的链霉 亲和素 --XL665和 TK/STK3抗体铕穴状化合物（1:100/1:50 ) 的混合检测液， 并 且所述反应是在室温反应 lh。
在一个实施方案中， 所述反应的检测是用 ENVISIO ( Perkinelmer )仪器检 测荧光信号 （320 nm激发； 665 nm、 615 nm发射） 实现的。 通过全活性孔和背 景信号孔计算出每个孔的抑制率， 复孔取平均值， 同时用专业的画图分析软件 PRISM 5.0对每个待测化合物进行半数抑制活性（IC50 ) 的拟合。
本发明还提供了式（I ) 的化合物及其 N-氧化物或其可药用盐用于抑制肿瘤 细胞增殖的用途。
在一个实施方案中， 所述式（I ) 的化合物是 TEB-415并且所述的肿瘤细胞 株是 L1210、 Jurkat E6-1. HL-60、 A549、 K562、 RPMI8226. THP-1和 /或 Ba F3,, 在一个实施方案中，所述的化合物的终浓度为 0 μΜ到 100 μΜ,例如 10 μΜ、 20 μΜ、 30 μΜ、 40 μΜ、 50 μΜ、 60 μΜ或 80 μΜ。 在一个实施方案中， 所述肿 瘤细胞的培养条件是在 37°C、 100 %相对湿度、 5 % C02培养箱中孵育 72小时。
在一个实施方案中， 所述的检测是使用 SpectraMax M5 Microplate Reader 测定 450 nm波长处的吸光度， 并以 650 nm处吸光度作为参比， 计算抑制率， 然 后采用作图分析软件 GraphPad Prism 5.0拟合 IC50曲线并计算 IC50值来进行 的。
本发明还提供了式（I ) 的化合物及其 N-氧化物或其可药用盐用于制备治疗 与抑制肿瘤细胞增殖相关的疾病一特别是癌症的药物的用途， 所述癌症包括白血 病、 骨髓瘤、 肠胃瘤和肺癌。
在一个实施方案中， 所述的检测方法所用的化合物是 TEB-415、 所用的试验 材料是小鼠（种属： Mus M 品系： NODSCID )移植模型。 在一个实施 方案中， 所述的小鼠移植模型是 K562人源慢性粒细胞白血病异种移植的小鼠。
在一些实施方案中， 所用的 TEB-415的浓度是 lmg/ml到 20mg/ml， 例如 3 mg/mK 5 mg/mK 7.5 mg/mK 10 mg/ml或 15 mg/ml,, 在一些实施方案中， 以伊马替尼作为阳性对照， 以 10% NMP/ 90% PEG200 作为溶剂对照。
在一个实施方案中， 将肿瘤细胞接种到小鼠， 待肿瘤生长至 400-1000mm3例 如 800 mm3将所述小鼠处死； 选择生长良好的肿瘤组织， 在无菌条件下接种至小 鼠； 待肿瘤长至 100-200mm3例如 160 mm3分组给药。 使用游标卡尺对肿瘤体积 进行测量， 测量肿瘤的长径和短径， 根据肿瘤体积计算肿瘤生长， 并计算给药后 的抑制率。 应用 SPSS17.0统计学软件进行 One-Way ANOVA检验， 对肿瘤体积 进行组间统计学分析。 P & 0.05认为有显著性差异。
本发明还提供了式（I ) 的化合物及其 N-氧化物或其可药用盐以及任选至少 一种可药用赋形剂用于制备治疗与酪氨酸激酶途径失调的疾病，特别与 ABL激酶 途径失调的疾病的药物的用途。
本发明还提供了式（I ) 的化合物及其 N-氧化物或其可药用盐以及任选至少 一种可药用赋形剂用于制备治疗与肿瘤细胞增殖相关的疾病， 特别是癌症的药物 的用途， 所述癌症包括白血病、 骨髓瘤、 肠胃瘤和肺癌。
本发明还提供了包含式（I ) 的化合物及其 N-氧化物或其可药用盐以及任选 至少一种可药用赋形剂的药物组合物。
其中所述可药用赋形剂任选采用本领域中已知的与药物剂型相适应的可药用 赋形剂， 例如记载于 Remington 's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. See also Wang, Y. J. and Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10， Supp. 42:2S, 1988中。 本发明的药物组合物可以采用如下文所述的药物制剂的形式：
本发明的药物制剂包括适合口服给药、 肠胃外给药 （包括皮下、 皮内、 肌内、 静脉） 以及直肠给药， 但最合适的途径可以取决于例如受试者的病症和障碍。
所述制剂可以被以单位剂型的形式方便地呈现， 也可以通过药学领域技术人 员公知的任一方法制备。 所有方法都包括将活性成分与组成一种或多种辅助成分 的载体结合的步骤。 一般说来， 所述制剂通过如下方式制备： 使所述活性成分与 液体载体或细分的固体载体或前述两者均匀且密切地结合， 然后根据需要将产品 塑形成希望的制剂。
适合口服给药的本发明的制剂可以呈现为分离的单位例如每个都包含预定量 所述活性成分的胶嚢剂、 扁胶嚢剂或片剂； 为粉剂或颗粒剂； 为水性液体或非水 性液体中的溶液剂或混悬剂； 为水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。 所述活 性成分还可以呈现为大丸剂、 药糖剂或糊剂。
片剂可以通过压缩或塑形制得， 任选与一种或多种辅助成分一块。 压缩的片 剂可以通过在适合的机器中压缩可自由流动形式例如粉剂或颗粒剂形式的活性成 分而制备， 任选与粘合剂、 润滑剂、 惰性稀释剂、 润滑剂、 表面活性剂或分散剂 混合。 塑形的片剂可以通过在适合的机器中塑形以惰性液体稀释剂湿润的粉末化 合物混合物而制备。 所述片剂任选可以被包衣或被刻痕， 或者可以被配制以緩慢 释放或受控释放其中的所述活性成分。 本发明的化合物可以例如以适合于直接释 放或延緩释放的形式给药。 直接释放或延緩释放可以通过使用含有本发明化合物 的适合药物组合物实现， 或者， 特别是在延緩释放的情况下， 通过使用例如皮下 植入物或渗透泵的装置实现。 本发明的化合物还可以通过脂质体给药。
优选地， 本发明的组合物适合用于皮下给药， 例如通过注射皮下给药。
肠胃外给药的制剂包括水性的和非水性的无菌注射溶液， 其可以包含抗氧化 剂、 緩冲剂、 抑菌剂以及可使所述制剂与目标受者的血液等渗的溶质； 以及水性 的和非水性的无菌混悬液， 其可以包含悬浮剂和增稠剂。 所述制剂可以在单剂量 或多剂量的容器例如密封的安瓿瓶和小玻璃瓶中， 并且可以以冻干 （冷冻脱水） 状态保存， 只需要在用之使前加入无菌的液体载体例如盐水或注射用水。 可以从 上述种类的无菌粉末、 颗粒剂和片剂制备当场配制的注射溶液和混悬液。 如果需 要， 所述药物组合物还可以包含少量无毒的辅助物质例如润湿剂或乳化剂、 防腐 剂、 pH緩冲液等例如乙酸钠或山梨醇肝月桂酸酯。
用于直肠给药的制剂可以呈现为含常用载体例如可可脂、 合成甘油酯或聚乙 二醇的保留灌肠剂或栓剂。 这种载体一般在常温下是固体， 但在直肠腔内液化和 / 或溶解以释放所述药物。
优选的单位剂量制剂是含有如上文所述的有效量或其合适部分的所述活性成 分的制剂。
应该理解， 除了上文具体提到的成分之外， 本发明的制剂还可以包含与正论 及的制剂类型有关的本领域中常规的其他试剂， 例如适合用于口服给药的制剂可 以包^^味剂。 提供以下实施例， 以方便本领域技术人员更好地理解本发明， 所述实施例仅 出于示例性目的， 并非意在限制本公开的范围。 制备方法
实施例 1: 2-氯代 -1-(3，3-二氟代环丁基）乙酮的制备
在 -20。C下，将 N，N-二异丙基氨基锂 (1.2 M, 6.0 eq.)緩慢滴加至氯乙酸 (3.0 eq.) 在四氢呋喃的溶液中并搅拌半小时。 然后緩慢滴加 3,3-二氟代环丁基曱酸曱酯 (1.0 eq.), 滴加完毕后緩慢升温至室温， 然后滴加稀盐酸淬灭反应， 水相用二氯曱 烷萃取， 无水硫酸钠干燥， 过滤得到粗品， 其未经进一步地纯化可直接用于下一 步反应。 NMR (CDC13, 300 MHz): δ 4.12 (s, 2Η)， 3.46-3.34 (m, 1Η)， 2.90-2.71 (m. 4Η)。
实施例 2: 2-溴代 -1-(3，3-二氟代环丁基）乙酮的制备
将 3,3-二氟代环丁基曱酸 (13.6 g, 10 mmol)和二氯亚9 3/4 (50 mL)混合物加热回 流搅拌 2小时，结束后除去过量的二氯亚砜得到 3,3-二氟代环丁基曱酰氯。将 3,3- 二氟代环丁基曱酰氯 (2.1 g， 13.6 mmol)溶于二氯曱烷中， 冷却到 -20。C， 然后滴加 重氮曱烷(136
]\1，10.0 69.)溶液， 反应约半小时后， 在 -30°C下滴加饱和氢 溴酸溶液 (20 mL, 10.0 eq)。 将反应混合物緩慢升温至室温搅拌 1小时， 然后依次 用饱和碳酸氢钠和食盐水洗涤， 有机相用硫酸钠干燥， 除去溶剂后得到 2-溴代 -1-(3，3-二氟代环丁基）乙酮粗品 2.5 g， 可直接用作下一步反应。 ^ NMI^CDCls, 300 MHz): δ 3.92 (s, 2H), 3.50-3.38 (m, IH), 2.93-2.71 (m, 4H).
实施例 3: 4-(3，3-二氟代环丁基 )-1Η-咪唑的制备
将 2-溴代 -1-(3，3-二氟代环丁基)乙酮或 2-氯代 -1-(3，3-二氟代环丁基)乙酮和曱 脒醋酸盐 (5.0 eq.)的乙二醇溶液在 80-135。C搅拌过夜。 反应结束后， 将反应液冷 却， 然后加入到饱和食盐水中。 用乙醚萃取， 有机相依次用水， 饱和食盐水洗涤， 然后加入无水硫酸钠干燥。 过滤， 旋干溶剂得到粗品， 经硅胶柱层析可得到纯的 4-(3，3-二氟代环丁基) -1H-咪唑， 收率为 15%-60%。 NMR (CDC13， 300 MHz): δ 8.34 (br, IH), 7.64 (d, J = 0.9 Hz, IH), 6.88-6.86 (m, IH), 3.43-3.31 (m, IH), 3.01-2.65 (m, 4H); MS-ESI (M + H ): 159.0; HR-MS(ESI)： cald. for C7H9F2N2+ (M + H ): 159.0728, found 159.0732.
实施例 4: 3-(4-(3，3-二氟代环丁基 )-1Η-咪唑 -1-基) -5-三氟曱基苯胺的制备 在惰性气体保护下， 将4-(3，3-二氟代环丁基)-111-咪唑(380 11^，2.4 )， 3- 溴 -5-三氟曱基苯胺 (480 mg， 2.0 mmol), 碳酸钾 (350 mg， 2.5 mmol), 碘化亚铜 (57 mg, 0.15 eq.), 8-羟基喹啉 (44 mg, 0.15 eq.)和无水二曱基亚9 3/4 (2 mL)加入压力瓶中， 然后加热 （约 115-120。C ) 并搅拌反应 48 小时。 反应结束后， 将反应液冷却至 40-50。C， 加入 15 mL饱和氨水搅拌 2小时后继续冷却至室温， 用乙醚萃取。 有 机相用水， 饱和食盐水洗涤， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 除去溶剂得到粗品， 经硅 胶柱层析得到纯的化合物 3-(4-(3，3-二氟代环丁基 )-1Η-咪唑 -1-基) -5-三氟曱基苯胺 400 mg, 收率为 63%。 NMR (CDC13, 300 MHz): δ 7.79 (d， J = 0.9 Hz, 1H)， 7.07 (s, 1H)， 6.94 (s, 1H)， 6.86 (s, 1H)， 6.79 (dd， J = 0.9， 2.1 Hz, 1H)， 4.10 (br, 2H)， 3.43-3.31 (m, 1H), 3.02-2.73 (m, 4H); MS-ESI (M + H ): 318.1; HR-MS(ESI)： cald. For C14H13F5N3+ (M + H ): 318.1024, found 318.1023.
实施例 5: N-(3-(4-(3，3-二氟代环丁基 )-1Η-咪唑 -1-基) -5-三氟曱基苯基 )-3-碘 -4 曱基苯曱酰胺的制备
将 3-碘 -4-曱基苯曱酰氯 (308 mg, 1.1 eq. ), 3-(4-(3，3-二氟代环丁基 )-1Η-咪唑 -1-基) -5-三氟曱基苯胺 (317 mg, 1.0 mmol), N，N-二异丙基乙胺 (0.25 mL, 1.5 eq.)和 4-二曱 ^吡啶 (30 mg, 0.25 eq.)溶于有机溶剂中， 室温搅拌反应 ( 8小时）。 反应 结束后， 加水淬灭， 用乙醚萃取， 干燥， 过滤， 除去有机溶剂后得到粗品， 经过 硅胶柱层析得到纯的化合物 N-(3-(4-(3，3-二氟代环丁基 )-1Η-咪唑 -1-基) -5-三氟曱 基苯基 )-3-碘 -4 曱基苯曱酰胺 504 mg, 收率为 90%。 ill NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 8.41 (d, J = 1.8 Hz, 1H)， 8.27 (d, J = 1.0 Hz, 1H)， 8.25 (t, J = 1.8 Hz, 1H)， 8.12 (s, 1H), 7.91 (dd, J = 1.8, 7.9 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.49 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.37-3.26 (m, 1H), 2.97-2.65 (m, 4H), 2.42 (s, 3H); MS-ESI (M + H ): 562.0; HR-MS(ESI)： cald. for C22H18F5IN30+ (M + H ): 562.0409, found 562.0416.
实施例 6: 4-曱基 -5-{[4-(3-吡啶基 )-2-嘧啶基】氨基 }-N-{3-[4-(3，3-二氟代环丁 基) -1H-咪唑 -1-基】 }-3- [(三氟曱基)苯基】 -苯曱酰胺的制备（根据说明书中的制备方 法 A )
在惰性气体保护下，将 N-(3-(4-(3，3-二氟代环丁基 )-1Η-咪唑 -1-基) -5-三氟曱基 苯基) -3-碘 -4-曱基苯曱酰胺 (247 mg, 0.44 mmol, 1.1 eq.)， 4-( 3-吡啶基） -2-胺基嘧啶 (69 mg, 1.0 eq.), Pd(0)催化剂（10-15%),碳酸铯 (182 mg, 1.4 eq.)， 1,4-二氧六环 (1.6 mL)和叔丁醇 (0.8 mL)的混合物加入压力瓶中， 所得混合物在 110-115。C搅拌反应 10小时。 在反应结束后， 将反应液冷却至室温， 加入二氯曱烷稀释， 加水洗去无 机盐， 有机相用硫酸钠干燥， 过滤， 除去溶剂得到粗品， 经柱层析得到纯的化合 物 4-曱基 -N-[3-(4-(3，3-二氟代环丁基) -1H-咪唑 -1-基) -5-三氟曱基苯基】3-[[4-(3-吡 啶基) 2-嘧啶基】氨基苯曱酰胺 170 mg,收率为 O0/)- 1!! NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 9.25 (d, J = 1.2 Hz, 1H)， 8.64 (dd， J = 1.0， 4.6 Hz, 1H)， 8.52 (d, J = 5.2 Hz, 1H)， 8.42 (dt， J = 8.0， 1.8 Hz, 1H)， 8.32 (d, J = 1.6 Hz, 1H)， 8.28 (t, J = 1.8 Hz, 1H)， 8.27 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.74-7.71 (m, 2H), 7.68 (s, 1H), 7.50-7.41 (m, 3H), 3.38-3.26 (m, 1H), 2.97-2.65 (m, 4H), 2.33 (s, 3H); MS-ESI (M + H ): 606.2; HR-MS(ESI)： cald. for C31H25F5N70+ (M + H ): 606.2035, found 606.2033.
实施例 7: 4-曱基 -5-{[4-(3-吡啶基 )-2-嘧啶基】氨基 }-N-{3-[4-(3，3-二氟代环丁 基) -1H-咪唑 -1-基】 }-3- [(三氟曱基)苯基】 -苯曱酰胺的制备（根据说明书中的制备方 法 B )
在惰性气体保护下， 向 3-(4-(3，3-二氟代环丁基 )-1Η-咪唑 -1-基) -5-三氟曱基苯 胺 (1.58 g, 5.0 mmol)和 4-曱基 -3-[[4-(3-吡啶基 )-2-嘧1^】 Α】苯曱酸乙酯 (1.84 g, 5.5 mmol, 1.1 eq.)的无水 THF悬浊液中緩慢滴加 15%叔丁醇钾 (3.0 eq.)的 THF溶 液， 维持内温 0-10。C， 滴加完毕后緩慢升温至 45 °C反应 3小时， 反应结束后， 降温， 用水淬灭反应， 萃取， 干燥， 过滤， 除去溶剂得到粗品， 经柱层析纯化得 到 TEB-415纯品 1.8 g, 收率 60%。 鉴定如实施例 6。
实施例 8: 4-曱基 -5-{[4-(3-吡啶基 )-2-嘧啶基】氨基 }-N-{3-[4-(3，3-二氟代环丁 基) -1H-咪唑 -1-基】 }-3- [(三氟曱基)苯基】 -苯曱酰胺的制备（根据说明书中的制备方 法 B )
在惰性气体保护下， 向 3-(4-(3，3-二氟代环丁基 )-1Η-咪唑 -1-基) -5-三氟曱基苯 胺 (1.58 g, 5.0 mmol)和 4-曱基 -3-[[4-(3-吡啶基 )-2-嘧啶基】 A】苯曱酸曱酯 (1.76 g, 5.5 mmol, 1.1 eq.)的无水 THF悬浊液中緩慢滴加 15%叔丁醇钾 (3.0 eq.)的 THF溶 液， 维持内温 0-10。C， 滴加完毕后緩慢升温至 45 °C反应 3小时， 反应结束后， 降温， 用水淬灭反应， 萃取， 干燥， 过滤， 除去溶剂得到粗品， 经柱层析纯化得 到 TEB-415纯品 1.8 g, 收率 60%。 鉴定如实施例 6。 生物测试
实施例 1:化合物 TEB-415对激酶 Flt3、 PDGFR alpha、 PDGFR beta、 AKT1、 EGFR、 Kit. JAK2或 Abl的活性抑制 IC50测定
测试化合物 TEB-415对激酶 Flt3、 PDGFR alpha. PDGFR beta. AKT1、 EGFR、 KIT. JAK2或 Abl的半数抑制活性 IC50值。
材料和仪器 2104 EnVision(R) Multilabel Reader (PerkinElmer); OptiPlate-384, White Opaque 384- well MicroPlate (Cat.6007290, PerkinElmer); HTRF kinEASE TK (Cat.62TKOPEC, Cisbio); HTRF kinEASE STK3 (Cat.62ST3PEB, Cisbio); Abl 酶 （Cat: 14-529， Millipore); PDGFRa (Cat: PV3811, Invitrogen); EGFR (Cat: PV3872, Invitrogen); Kit酶 （Cat: BML-SE447-0010, Biomol); JAK2酶 （Cat: BML-SE435-0010, Biomol); PDGFRp (Cat: P3082, Invitrogen); AKTl (Cat: P2999. Invitrogen); FLT3 (Cat: 14-500, Millipore); 10 mM ATP (Cat.PV3227, Invitrogen); 1 M DTT (Cat.D5545, Sigma); 1 M MgCl2 (Cat.M8266, Sigma); 1 M MnCl2 (Cat.244589, Sigma); 待测化合物 TEB-415。 试验步骤
1 )试剂配制
表 1示出 Flt3、 PDGFRa. PDGFRp、 AKT1、 EGFR. Kit. JAK2
八种激酶试剂的配制。
表 1. 八种激酶的反应体系各组分及浓度表
PDGF PDGF TK/STK3 FLT3 Abl EGFR JAK2 Aktl R Kit
6 10 0.5 1 0.6 4 0.2 0.4
酶浓度 ng wel ng wel ng wel ng wel ng wel ng we ng well ng well
1 1 1 1 1 11 在 i反应
920 50 ATP (μΜ) 步骤的终 30 μΜ 30 μΜ 10 μΜ 10 μΜ 50 μΜ 2.5 μΜ
nM μΜ 浓度 ( 10
100 330 200 500 500 Substrate 1 μΜ 1 μΜ 1 μΜ
nM nM nM nM nM 30 40 30 15 10 25 ?反应时间 20 min 30 min
min min min min min min 在完全反 62.5 125 12.5 20.6 62.5 31.25 62.5 Sa-XL665 25 nM
应中的终 nM nM nM nM nM nM nM TK/STK3-Ab- 浓度 ( 20 1:100 1:100 1:100 1:100 1:50 1:100 1:100 Cryptate 1:100
lxFLT3酶緩冲液： lmL lx激酶緩冲液中含有 200 μ? 5χ酶緩冲液、 5 1M MgCl2、 l L lM MnCl2、 Ιμ? 1Μ DTT. 793 ddH20;
lxPDGFRp酶緩冲液： lmL lx激酶緩冲液中含有 200 μ? 5χ酶緩冲液、 5 1Μ MgCl2、 Ιμ? 1M DTT、 20 SEB、 1 1M MnCl2 773 ddH20;
lx Abl酶緩冲液： lmL lx激酶緩冲液中含有 200 5x酶緩冲液、 5 1Μ MgCl2、 Ιμ? 1M DTT. 20 SEB. 774 ddH20;
lx EGFR酶緩冲液： lmL lx激酶緩冲液中含有 200 5x酶緩冲液、 5 1Μ MgCl2、 Ιμ? 1M DTT、 1 1M MnCl2 793 dd 3/4 0;
lxJAK2酶緩冲液： lmL lx激酶緩冲液中含有 200 μ? 5χ酶緩冲液、 5 1Μ MgCl2、 Ιμ? 1M DTT. 794 ddH20;
lxAKTl酶緩冲液： lmL lx激酶緩冲液中含有 200 5x酶緩冲液、 5 1Μ MgCl2、 Ιμ? 1M DTT. 794 ddH20;
lxKit酶緩冲液： lmL lx激酶緩冲液中含有 200 5x酶緩冲液、 5 1Μ MgCl2、 Ιμ? 1M DTT. 10 SEB. 784 ddH20;
lxPDGFRoc酶緩冲液： lmL lx激酶緩冲液中含有 200 5x酶緩冲液、 5 1Μ MgCl2、 Ιμ? 1M DTT、 8 SEB、 1 1M MnCl2 785 ddH20;
5x底物 -TK/STK3和 ATP工作液:底物 -TK/STK3和 ATP的具体浓度见表 1。 用 lx激酶緩冲液稀释底物 -TK/STK3和 ATP至反应浓度的 5倍；
5χ酶工作液： 八种激酶（Flt3、 PDGFR alpha. PDGFR beta. AKT1、 EGFR. KIT. JAK2或 Abl )的浓度优化已在之前的工作中完成， 筛选浓度见表 1。 用 lx 激酶緩冲液配制 5x酶工作液；
4xSa-XL665工作液： Sa-XL665在反应中的浓度参见表 1。 用检测緩冲液配 制 4xSa-XL665工作液；
4x TK/STK3-Ab-cryptate工作液：用检测緩冲液将 TK-Ab-Cryptate稀释 100 倍作为工作液； 用检测緩冲液将 STK3-Ab-Cryptate稀释 50倍作为工作液。
2 )试验流程
所有试剂按照上述方法配好后， 除酶外， 平衡到室温以后， 开始进行加样， 参见表 2。
TK/STK3--生物素底物、 ATP、 酶以及一定浓度的化合物在含有 50 mM Hepes/NaOH pH 7.0 、 0.02%NaN3 、 0.01% BSA 、 0.1 mM 原钒酸盐 ( orthovanadate )、 5 mM MgCl2、 1 mM MnCl2和 1 mM DTT的溶液中室温反应。 待测化合物 TEB-415的抑制浓度从 50 μΜ开始， 5倍梯度稀释，使用 2.5%的 DMSO 作为共溶剂。向所有反应孔中加入 10 μ?经含有 50 mM Hepes/NaOH pH 7.0、 0.1% BSA. 0.8 M KF和 20 mM EDTA的溶液稀释的链霉亲和素 --XL665和 TK/STK3 抗体铕穴状化合物 (1:100/1:50)混合检测液， 室温反应 lh 后， 用 ENVISION(Perkinelmer)仪器检测荧光信号 （320 nm激发； 665 nm、 615 nm发 射）。 通过全活性孔和背景信号孔计算出每个孔的抑制率， 复孔取平均值， 同时用 专业的画图分析软件 PRISM 5.0对每个待测化合物进行半数抑制活性（IC50 )的 拟合。 表 2. 试验加样流程图如下:
3) 数据分析
发射比 (ER)= 665 nm发射信号 / 615 nm发射信号；
Φ1)7 ]-^-= (ERp。SitiveER 阴性对照 _ ERsampleER样品) /(ERp。SitiveER阳性对照 _ ERnegativeER阴 性对照 )*100%； 试验结果
应用 HTRF kinEASE TK/STK3 kit检测化合物 TEB-415 分别对 Flt3、 PDGFRou PDGFRp. AKT1、 EGFR、 KIT. JAK2和 Abl酶的半数抑制浓度 (IC50) 进行验证测定， 化合物 TEB-415分别从 50 μΜ以 5倍的倍比稀释， 控制 DMSO 浓度为 1%， 10个测定浓度， 同步测定阳性化合物十字孢碱 (Staurosporine), 每个 浓度为复孔。 试验结果参见图 1-图 8
表 3. 激酶活性抑制的 IC50值测试结果汇总
通过上表可以看出 TEB-415对 ABL激酶有极好的选择性， 对其它类似的激 酶不具备抑制性。 从而使得 TEB-415具有较小的毒性。 实施例 2:化合物 TEB-415体外抗肿瘤细胞增殖的 IC50测定
应用 CCK-8检测试剂盒检测化合物 TEB-415对 8个肿瘤细胞株（L1210、 Jurkat E6-l、 HL-60、 A549、 K562、 RPMI8226. THP-1和 Ba F3 ) 的体外抗增 殖抑制 IC50值。 材料和方法
L1210 小鼠淋巴性白血病细胞株（购自中科院上海细胞生物研究所）； Jurkat E6-1 人 T淋巴细胞白血病细胞株 (购自中科院上海细胞生物研究所）； A549人 非小细胞肺癌细胞株 (购自中科院上海细胞生物研究所）； HL-60人急性髓细胞 白血病细胞株 (购自中科院上海细胞生物研究所）； K562 人慢性粒细胞性白血病 细胞株（购自美国 ATCC ); RPMI 8226 人多发性骨髓瘤细胞株 （购自美国 ATCC )； THP-1 人单核白血病细胞株 (购自美国 ATCC )； Ba F3 小鼠原 B淋巴细 胞株 (购自美国 ATCC )。
试剂和耗材：
Cell Counting Kit-8 ( Cat# CK04-13， Dojindo )； 96 L培养板（ Cat# 3599， Corning Costar ); 胎牛血清（ Cat#， GIBCO )； 培养基 ( Invitrogen ); 台式醉标仪 SpectraMax M5 Microplate Reader ( Molecular Devices ); 化合物 TEB-415 (MW605.56, 10mg)。
1) 试剂配制
表 4.培养基的配制
2) 化合物的制备： 用 DMSO稀释化合物使终浓度为 10mM。
3) 细胞培养
a) 收集对数生长期细胞， 计数， 用完全培养基重新悬浮细胞； b) 调整细胞浓度至合适浓度，接种 96孔板，每孔接种 100 μ?细胞 悬液；
c) 细胞在 37 °C， 100 %相对湿度， 5 % C02培养箱中孵育 24小 时。
4) IC50试验
a) 收集对数生长期细胞， 计数， 用完全培养基重新悬浮细胞， 调 整细胞浓度至合适浓度 (依照细胞密度优化试验结果确定）， 接种 96孔 板， 每孔加 100 μ?细胞悬液。 细胞在 37 °C， 100 %相对湿度， 5 % C02 培养箱中孵育 24小时；
b) 用培养基将待测化合物稀释至 500 μΜ后梯度稀释 8次。 按 25 μ?/孔加入细胞。 化合物终浓度从 100 μΜ至 0 μΜ， 4倍梯度稀释， 共 10个浓度点；
c) 细胞置于 37 °C， 100 %相对湿度， 5 % C02培养箱中孵育 72 小时；
d) 吸弃培养基 (悬浮细胞除外)，加入含 10% CCK-8的完全培养基 (对于悬浮细胞株， 直接加入 10 μ? CCK-8)置于 37 °C培养箱中孵育 2-4 小时；
e) 轻轻震荡后在 SpectraMax M5 Microplate Reader上测定 450 nm波长处的吸光度， 以 650 nm处吸光度作为参比， 计算抑制率。
5) 数据处理
按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：
肿瘤细胞生长抑制率％ = [(Ac-As)/(Ac-Ab)]xl00%
As: 样品的 OA (细胞 +CCK-8+待测化合物）； Ac: 阴性对照的 OA (细胞 +CCK-8+DMSO); Ab: 阳性对照的 OA (培养基 +CCK-8+DMSO)。
采用专业作图分析软件 GraphPad Prism 5.0拟合 IC50曲线和计算 IC50值。 试验结果
本试验检测了化合物 TEB-415对 8个肿瘤细胞株（L1210、 Jurkat E6-l、 HL-60、 A549、 K562、 RPMI8226. THP-1 和 Ba F3 ) 的体外抗增殖作用。 化合 物作用终浓度从 100 μΜ至 0 μΜ， 4倍梯度稀释， 共 10个点. 在测试过程中， 观 察到其中一个化合物 TEB-415在较高作用浓度下 （100 μΜ和 25 μΜ )加到细胞 培养基后出现浑浊和析出现象， 导致了这两个作用浓度点的数据不能准确地反映 该化合物对细胞增殖的抑制作用。 具体的试验结果参见图 9-图 16和表 5。 表 5.体外抗肿瘤细胞增殖的 IC50测定汇总
实施例 3: 化合物 TEB-415治疗 K562人源慢性粒细胞白血病异种移植模型 的药效学研究
供试药物和对照药物
名 称： TEB-415
提供单位： 天津泰瑞倍药研科技有限公司
性 状： 粉末
贮存条件： -20。 (：、 避光、 密闭、 干燥保存
名 称： 曱磺酸伊马替尼
提供单位： 天津泰瑞倍药研科技有限公司
性 状： 粉末
贮存条件： 常温、 避光、 密闭、 干燥保存
名 称： 尼洛替尼 (nillotinib)
提供单位： 天津泰瑞倍药研科技有限公司
性 状： 粉末 贮存条件： 避光， -20。C保存
供试药品配制方法（每次现用现配）：
( 1 ) 3 mg/mK 7.5 mg/mK 10 mg/ml 、 15 mg/ml TEB-415: 分别称取 9毫 克、 22.5毫克、 30毫克、 45毫克 TEB-415粉末溶于 0.3毫升 NMP中， 待其完全 溶解后， 加入 2.7毫升 PEG200混匀；
( 2 ) 7.5 mg/ml、 10 mg/ml伊马替尼： 称取 22.5毫克伊马替尼粉末溶于 0.15 毫升 DMSO中， 待其完全溶解后， 加入 2.85毫升的生理盐水（0.9%氯化钠注射 液）（四川科伦药业股份有限公司， 批号： M090714 ) 混匀。
( 3 ) 10 mg/ml尼洛替尼：称取 30毫克尼洛替尼粉末溶于 3毫升 MCT( 0.5% MC/0.25%Tween20 (含 0.5 曱基纤维素和 0.25ml Tween20的 100ml磷酸盐緩冲 液） 中。
( 4 )溶剂对照采用 10% NMP/ 90% PEG200 (天津市光复精细化工研究所）。 试验动物及饲养管理
试验所用小鼠（种属： Mus M 品系： NODSCID ), 6-8周龄、 雄性、 体重 20-26克、 75只 + 60只， 由北京华阜康生物科技股份有限公司提供 (生产许 可证号： SCXK (京） ; 质量合格证号： 0245145 )。
试验动物饲养在康龙化成（北京）新药技术有限公司动物中心（ AAALAC认 证单位）的 SPF级恒温恒湿的层流清洁房间内， 使用独立通风笼具 IVC, 温度为 ( 22±3 ) °C、 湿度为 40-80%。 饲料为清洁级鼠料， 购自北京科奥协力饲料有限公 司； 饮用水为超滤净化水， 食物和水均经过高压灭菌处理。 动物可以自由摄取高 压无菌食物和饮水。 通过耳缘打孔为动物编号。
每 5只鼠一笼， 笼具有聚碳酸酯制成， 体积为 300 mmxl80 mmxl50 mm。 软制玉米芯高压消毒清洁垫料， 每周更换两次。 每只笼具具有标签， 标明动物数 量、 性别、 品系、 接收时间、 组别以及试验开始时间。
用含有灭活的 10%胎牛血清， 100 U/ml青霉素和 100 g/ml链霉素以及 2 mM 谷氨酰胺的 IMDM培养基在 37°C、 5% C02的培养箱中培养 K562细胞。 细胞培 养起始浓度为 5xl05个 /毫升， 每隔 3至 4天待细胞长满后分瓶传代。 将处于对数 生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤的接种。
肿瘤细胞接种与分组 1
PBS重悬的 K562肿瘤细胞 1.0xl07/0.1ml接种于 SCID小鼠右側前胁肋部皮 下， 共接种 5只。 待肿瘤生长到 800 mm3时处死动物， 在无菌条件下， 剥离肿瘤， 选择生长良好的肿瘤组织， 用手术刀片将肿瘤组织切成 2x2x2 mm3瘤块，接种至 SCID小鼠右側胁肋部皮下， 共转接 75只动物。 待肿瘤长至 160 mm3左右时分组 给药， 共 5组（分别为溶剂对照组， TEB-415三种剂量治疗组以及伊马替尼治疗 组）， 每组 10只。
肿瘤细胞接种与分组 2
PBS重悬的 K562肿瘤细胞 1.0xl07/0.1ml接种于 SCID小鼠右側前胁肋部皮 下， 共接种 5只。 待肿瘤生长到 700 mm3时处死动物， 在无菌条件下， 剥离肿瘤， 选择生长良好的肿瘤组织， 用手术刀片将肿瘤组织切成 2x2x2 mm3瘤块，接种至 SCID小鼠右側胁肋部皮下， 共转接 60只动物。 待肿瘤长至 120 mm3左右时分组 给药， 共 4组（分别为溶剂对照组， TEB-415治疗组， 伊马替尼治疗组以及尼洛 替尼治疗组）， 每组 10只。
肿瘤的测量及试验指标
每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行两次测量， 测量肿瘤的长径和短径， 其体 积计算公式为： 体积 =0.536x长径 X短径 2。 根据肿瘤体积计算肿瘤生长
抑制率（ TGI ) = ( 1-T/C ) X 100%, 其中 T为各受试物组相对肿瘤体积的平 均值， C为溶剂对照组相对肿瘤体积的平均值。
治疗结束时， 将对照组和伊马替尼组的荷瘤鼠安乐处死， 其余 TEB-415和尼 洛替尼治疗组治疗组继续观察至 100天（针对分组 1 )或 102天（针对分组 2 )。
对于分组 1:
表 6示出应用化合物 TEB-415治疗 K562人源慢性粒细胞白血病异种移植模 型的药效学研究给药方案。 表 6. TEB-415治疗 K562人源慢性粒细胞白血病异种移植模型的药效学研究 给药方案
注： 给药容积依试验动物体重按 10 μ?/g, 出现体重下降 15-20%时停药至体 重恢复后再行给药； * 药物剂量显示药物纯品的量.
统计学分析
应用 SPSS17.0统计学软件进行 One-Way ANOVA检验， 对肿瘤体积进行组 间统计学分析. />>& 0.05认为有显著性差异.
治疗期间， 各治疗組的试验动物体重出现小幅的波动。 停药后继续观察 TEB-415治疗组的试验动物体重均恢复到初始的水平， 体重变化见图 17、 18.
肿瘤生长抑制结果参见表 7和图 17、 18、 19,
表 7. TEB-415对 K562人源 ft性粒细胞白血病异种移植模型的抑瘤作用 組別 动物数 肿痛体积 肿 *生长 肿癌完全
(D22, mm3)8 抑剁率（％) 竣解 b 组 1: 溶剂对照 10 3014 ± 226 ― 0/10 -- 组 2: TEB-415 ( 30 mg/kg ) 10 70 ± 15 97.7 4/10 & 0.001 组 3: TEB-415 ( 75 m / 1/2
) 10 0 100 10/10 & 0.001 组 4: TEB-415 ( 150 mg/kg ) 10 0 100 10/10 & 0.001 组 5: 伊马替尼 S mg/kg ) 10 2096 ± 237 30.1 0/10 0.103 注： a均数 ±标准误； b观察至 100天； '与对照组比较
尸值： 组 2 vs. 组 3 = 0.010; 组 2 vs. 组 4 = 0.010; 组 2 vs.组 S & 0.001;
a 3 vs.组 S & 0.001; 组 4 vs. 组 5 & 0.001.
在该测试中， 通过测试化合物 TEB-415在三个剂量水平对 K562人源' It性粒 细胞白血病异种移植模型肿瘤生长的体内抑制作用并与阳性对照药品伊马替尼的 治疗效果进行比较.
) K562瘤块接种 22天后，溶剂对照组的肿瘤体积均值为 3014 mm3。伊马替尼 75 mg/k 组肿瘤体积均值为 2096 mm3 (TGI = 30.1% , P = 0.103)。 TEB-415 30 mg/kg组肿瘤体积均值为 70 mm3 (TGI = 97.7% , 与对照组比较 P & 0.001)， 给药 结束 4天（接种 26天）有 4只小鼠的肿瘤消退，之后未见复发。 TEB-415 75 mg/kg 和 150 mg/kg治疗组的肿瘤全部消退， 继续观察 100天无肿瘤复发现象。
TEB-415 对 K562 肿瘤模型有极强的抗肿瘤效果。 中高剂量（75 mg/k 和 150 mg/kg )组的肿瘤完全消退，观察 100天未有复发迹象，意味着疾病达到治愈。 低剂量 TEB-415 ( 30 mg/kg )治疗组的肿瘤抑制率也显著高于伊马替尼 75 mg/kg 组（P & 0.001 )。 治疗期间， 各组试验动物对受试化合物耐受良好， 药物的安全性 很好。
对于分组 2:
表 8示出应用化合物 TEB-415治疗 K562人源慢性粒细胞白血病异种移植模 型的药效学研究给药方案。
表 8. TEB-415治疗 K562人源慢性粒细胞白血病异种移植模型的药效学研究 给药方案
注： 给药容积依试验动物体重按 10 μ?/g, 出现体重下降 15-20%时停药至体 重恢复后再行给药； * 药物剂量显示药物纯品的量。
统计学分析
应用 SPSS17.0统计学软件进行 One-Way ANOVA检验， 对肿瘤体积进行组 间统计学分析。 P& 0.05认为有显著性差异。
治疗期间和停药后 TEB-415和尼洛替尼组较初始体重未出现下降，伊马替尼 组出现 2%体重下降， 体重变化见图 20、 21。
.肿瘤生长抑制结果参见表 9和图 20、 21、 22。 K562瘤块接种 21天后， 溶剂 对照组的肿瘤体积均值为 3317 mm3。伊马替尼组 TGI = 34% , P = 0.003; 尼洛替 尼组 TGI = 100%, P & 0.001; TEB-415 组 TGI = 100%, P & 0.001。 肿瘤生长曲 线见图 22。
表 9. TEB-415对 K562人源慢性粒细胞白血病异种移植模型的抑瘤作用
肿瘤体积 肿瘤生长 肿瘤完全
组别 动物数 P c
(D21, mm3)a 抑制率(％) 緩解 b 组 1: 溶剂对照 3,317 ± 205 -- 0/10 -- 10
组 2: TEB-415 ( 100 mg k ) 10 0 ± 0 100 4/10 & 0.001 组 3: 伊马替尼（ 100 mg k ) 10 2,195 ± 156 34 0/10 0.003 组 4: 尼洛替尼 ( 100 mg k ) 10 0 ± 0 100 2/10 & 0.001 注： a均数 ± 标准误； b' 观察至 102天； e与对照组比较 。
P值： 组 2 vs. 组 3 & 0.001； 组 3 vs. 组 4 & 0.001
在该测试中， 测试化合物 TEB-415在对 K562人源慢性粒细胞白血病异种移 植模型肿瘤生长的体内抑制作用并与阳性对照药伊马替尼和尼洛替尼的治疗效果 进行比较。
伊马替尼 100 mg/k 组肿瘤体积均值为 2,195mm3 (TGI = 34%, p = 0.003),, TEB-415 和尼洛替尼组肿瘤体积均值均为 0 mm3 (TGI = 100%, p & 0.001)。
TEB-415组给药 8天（肿瘤接种 14天）， 肿瘤全部消退， 继续观察至接种后 102 天有 4只小鼠未出现肿瘤复发。 尼洛替尼组给药 8天（肿瘤接种 14天）， 肿瘤全 部消退， 继续观察至接种后 102天有 2 只小鼠未出现肿瘤复发。 治疗期间， 各组 实验动物对受试化合物耐受良好， 无不良反应。
TEB-415对 K562肿瘤模型有极强的抗肿瘤效果。 其肿瘤抑制率优于尼洛替 尼， 显著高于伊马替尼（P& 0.001 )。 治疗期间， 各组实验动物对受试化合物耐受 良好。
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