【求助/交流】马丁氏培养基培养真菌 - 生物科学 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
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【求助/交流】马丁氏培养基培养真菌
用马丁氏培养基培养真菌，长出的真菌是什么样子的？
那要看你培养的是什么菌了，不同的菌有不同的形态的 不同的菌有不同的形态，真菌有很多种的 呵呵，最好说具体点，培养什么菌，培养多少时间，大家才好帮你啊 对啊，真菌的种类那么多，到底是哪种？！
即使同一属的也有不同的 培养基只是菌生长的问题，一般形态变化不会太大，当然你加了特殊物质的话会有颜色反应也说不定。关键还是你培养的菌的种属问题 Originally posted by gaiyf at
那要看你培养的是什么菌了，不同的菌有不同的形态的 其实只是用来分离计数的，不用细分到种和属。里面加了链霉素，我已经在28度下培养了5天了，什么都没有，有点着急，谢谢！ Originally posted by 白水龙·han at
对啊，真菌的种类那么多，到底是哪种？！
即使同一属的也有不同的 只是做真菌的平板计数，不用细分。我还想请教一下，我用改良的高氏一号培养的放线菌，就是加了重铬酸钾的，长出来的菌落怎么觉得像细菌呢？我查过资料说用改良的高氏一号培养的放线菌菌落生长初期像细菌的菌落，到底对还是不对阿！请指教！ : Originally posted by 秦时月8312 at
只是做真菌的平板计数，不用细分。我还想请教一下，我用改良的高氏一号培养的放线菌，就是加了重铬酸钾的，长出来的菌落怎么觉得像细菌呢？我查过资料说用改良的高氏一号培养的放线菌菌落生长初期像细菌的菌落 ... 我也遇到同样的问题，现在还在找原因。
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E-mail： & QQ：8835100【分享】培养基的配制 - 食品 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
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【分享】培养基的配制
培养基的配制
　一、牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)
　　牛肉膏 3g
　　蛋白胨 10g
　　NaCl 5g
　　琼脂 15—20g
　　水 1000ml
　　pH 7．0—7．2
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　二、淀粉琼脂培养基(高氏1号培养基，培养放线菌用)
　　可溶性淀粉 20g
　　KNO3　 1g
　　NaCl 0．5g
　　K2　HPO4　 0．5g
　　MgSO4　 0．5g
　　FeSO4　 0．01g
　　琼脂 20g
　　水 1000ml
　　pH 7．2—7．4
　　配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，在火上加热，边搅拌边加水及其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　三、查氏培养基(培养霉菌用，实验16)
　　NaNO3　 2g
　　K2　HPO4　 1g
　　KCl 0．5g
　　MgSO4　 0．5g
　　FeSO4　 0．01g
　　蔗糖 30g
　　琼脂 15—20g
　　水 1000ml
　　pH 自然
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　四、马丁氏(Martin)琼脂培养基(分离真菌用)
　　葡萄糖 10g
　　蛋白胨 5g
　　KH2　PO4　 1g
　　MgSO4　&#　O 0．5g
　　1/3000孟加拉红(rose bengal，玫瑰红水溶液)
　　琼脂 15—20g
　　pH 自然
　　蒸馏水 800ml
　　0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌30分钟。
　　临用前加入0．03%链霉素稀释液100ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
　　五、马铃薯培养基 (实验16)
　　马铃薯 200g
　　蔗糖(或葡萄糖) 20g
　　琼脂 15—20g
　　水 1000ml
　　pH 自然
　　马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000ml。1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　六、麦芽汁琼脂培养基 (实验15)
　　1．取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6—12小时，置15℃阴暗处发芽，上盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。
　　2．将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴锅中糖化3—4小时，糖化程度可用碘滴定之。
　　3．将糖化液用4—6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20ml，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。
　　4．将滤液稀释到5—6波美度，pH约6．4，加入2%琼脂即成。
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　七、葡萄糖-醋酸盐培养基 (实验15)
　　葡萄糖 1g
　　酵母浸膏 2．5g
　　醋酸钠 8．2g
　　琼脂 15g
　　蒸馏水 1000ml
　　pH 4．8
　　分装试管，0．70kg/cm2　(10磅/英寸2　)，115．2℃灭菌20分钟后制成斜面。
　　八、半固体肉膏蛋白胨培养基 (实验26)
　　肉膏蛋白胨液体培养基 100ml
　　琼脂 0．35—0．4g
　　pH 7．6
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　九、合成培养基 (实验36，39)
　　(NH4　)2　PO4　 1g
　　KCl 0．2g
　　MgSO4　&#　O 0．2g
　　豆芽汁 10ml
　　琼脂 20g
　　蒸馏水 1000ml
　　pH 7．0
　　加12ml0．04%的溴甲酚紫(pH5．2—6．8，颜色由黄色变紫色，作指示剂)。1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　十、豆芽汁蔗糖(或葡萄糖)培养基 (实验37，38)
　　黄豆芽 100g
　　蔗糖(或葡萄糖) 50g
　　水 1000ml
　　pH 自然
　　称新鲜豆芽100g，放入烧杯中，加水1000ml，煮沸约半小时，用纱布过滤。用水补足原量，再加入蔗糖(或葡萄糖)50g，煮沸溶化。1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　十一、油脂培养基 (实验40)
　　蛋白胨 10g
　　牛肉膏 5g
　　NaCl 5g
　　香油或花生油 10g
　　1．6%中性红水溶液 1ml
　　琼脂 15—20g
　　蒸馏水 1000ml
　　pH 7．2
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　注：1．不能使用变质油。
　　2．油和琼脂及水先加热。
　　3．调好pH后，再加入中性红。
　　4．分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。
　　十二、淀粉培养基 (实验40，45)
　　蛋白胨 10g
　　NaCl 5克
　　牛肉膏 5克
　　可溶性淀粉 2g
　　蒸馏水 1000ml
　　琼脂 15—20g
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　十三、明胶培养基 (实验40)
　　牛肉膏蛋白胨液 100ml
　　明胶 12—18g
　　pH 7．2—7．4
　　在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。溶化后调pH7．2—7．4。
　　0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌30分钟。
　　十四、蛋白胨水培养基 (实验42)
　　蛋白胨 10g
　　NaCl 5克
　　水 1000ml
　　pH 7．6
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　十五、糖发酵培养基 (实验41)
　　蛋白胨水培养基 1000ml
　　酸性复红水溶液① 2—5ml
　　pH 7．6
　　另配20%糖溶液(葡萄糖、乳糖、蔗糖等)各10ml。
　　制法：
　　1．将上述含指示剂的蛋白胨水培养基(pH7．6)分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管，使充满培养液。
　　2．将已分装好的蛋白胨水和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟；糖溶液0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌30分钟。
　　3．灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0．5ml(按每10ml培养基中加入20%的糖液0．5ml，则成1%的浓度)。
　　配制用的试管必须洗干净，避免结果混乱。
　　①0．5%酸性复红水溶液100ml加1mol/LNaOH16ml即成。
　　十六、葡萄糖蛋白胨水培养基 (实验42)
　　蛋白胨 5g
　　葡萄糖 5g
　　K2　HPO4　 2g
　　蒸馏水 1000ml
　　将上述各成分溶于1000ml水中，调pH7．0—7．2，过滤。分装试管，每管10ml，0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌30分钟。
　　十七、H2　S试验用培养基 (实验42)
　　蛋白胨 20g
　　NaCl 5g
　　柠檬酸铁铵 0．5g
　　Na2　S2　O3　 0．5g
　　琼脂 15—20g
　　蒸馏水 1000ml
　　pH 7．2
　　先将琼脂、蛋白胨溶化，冷至60℃加入其他成分。分装试管，0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌15分钟，备用。
　　十八、柠檬酸盐培养基 (实验42)
　　NH4　H2　PO4　 1g
　　K2　HPO4　 1g
　　NaCl 5g
　　MgSO4　 0．2g
　　柠檬酸钠 2g
　　琼脂 15—20g
　　蒸馏水 1000ml
　　1%溴麝香草酚蓝酒精液 10ml
　　将上述各成分加热溶解后，调pH6．8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色，分装试管，1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟后制成斜面。
　　十九、土霉素效价测定用培养基 (实验44)
　　培养基Ⅰ(供培养试验菌用)
　　蛋白胨 5g
　　酵母膏 3g
　　牛肉膏 1．5g
　　NaCl 3．5g
　　葡萄糖 1g
　　K2　HPO4　 3．68g
　　KH2　PO4　 1．32g
　　琼脂 20—25g
　　蒸馏水 1000ml
　　pH 7．2
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　培养基Ⅱ(供摊布双碟的上，下层用)
　　蛋白胨 6g
　　酵母膏 6g
　　牛肉膏 1．5g
　　葡萄糖 1g
　　琼脂 15—18g
　　蒸馏水 1000ml
　　pH 6．8
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　二十、酪蛋白培养基 (实验46)
　　KH2　PO4　 0．36g
　　Na2　HPO4　&#　O 1．3g
　　NaCl 0．1g
　　ZnSO4　&#　O 0．02g
　　CaCl2　&#　O 0．002g
　　酪素 4g
　　酪素水解氨基酸 0．05g
　　琼脂 15—20g
　　蒸馏水 1000ml
　　pH 7．0—7．2
　　先称取4g酪素，再加入0．5mol/LNaOH约2ml，将酪素溶解；然后依次加入其他药品，最后调pH7．0—7．2。0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌30分钟。
　　二十一、完全培养基(TYEG培养基) (实验47)
　　胰蛋白胨 10g
　　酵母浸膏 5g
　　K2　HPO4　 3g
　　葡萄糖 1g
　　琼脂 15—20g
　　蒸馏水 1000ml
　　pH 7．0
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　二十二、基本培养基(MM培养基) (实验47)
　　(NH4　)2　SO4　 1g
　　K2　HPO4　 7g
　　KH2　PO4　 3g
　　柠檬酸钠 0．5g
　　MgSO4　&#　O 0．1g
　　葡萄糖 5g
　　琼脂 15—20g
　　蒸馏水 1000ml
　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。
　　二十三、复红亚硫酸钠培养基(远藤氏培养基) (实验60，61)
　　蛋白胨 10g
　　乳糖 10g
　　K2　HPO4　 3．5g
　　琼脂 20—30g
　　蒸馏水 1000ml
　　无水亚硫酸钠 5g左右
　　5%碱性复红乙醇溶液 20ml
　　先将琼脂加入900ml蒸馏水中，加热溶解，再加入磷酸氢二钾及蛋白胨，使溶解，补足蒸馏水至1000ml，调pH至7．2—7．4。加入乳糖，混匀溶解后，0．70kg/cm2　(10磅/英寸2　)，115．2℃灭菌20分钟。称取亚硫酸钠置一无菌空试管中，加入无菌水少许使溶解，再在水浴中煮沸10分钟后，立刻滴加于20ml5%碱性复红乙醇溶液中，直至深红色褪成淡粉红色为止。将此亚硫酸钠与碱性复红的混合液全部加至上述已灭菌的并仍保持溶化状态的培养基中，充分混匀，倒平皿，放冰箱备用。贮存时间不宜超过2周。
　　二十四、伊红美蓝培养基(EMB培养基) (实验60，61)
　　蛋白胨水琼脂培养基 100ml
　　20%乳糖溶液 2ml
　　2%伊红水溶液 2ml
　　0．5%美蓝水溶液 1ml
　　将已灭菌的蛋白胨水琼脂培养基(pH7．6)加热溶化，冷却至60℃左右时，再把已灭菌的乳糖溶液、伊红水溶液及美蓝水溶液按上述量以无菌操作加入。摇匀后，立即倒平板。乳糖在高温灭菌易被破坏必须严格控制灭菌温度，一般是0．70kg/cm2　(10磅/英寸2　)，115．2℃灭菌20分钟。
　　二十五、乳糖蛋白胨培养液(“水的细菌学检查”用) (实验60、61)
　　蛋白胨 10g
　　牛肉膏 3g
　　乳糖 5g
　　NaCl 5g
　　1．6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml
　　蒸馏水 1000ml
　　将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及Nacl加热溶解于1000ml蒸馏水中，调pH至7．2—7．4。加入1．6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于有小倒管的试管中。0．70kg/cm2　(10磅/英寸2　)，115．2℃灭菌20分钟。
学习了，哈哈哈 对于培养基的配制可以参考天津科技大学出的一本，微生物实验技术指导，这本书不错 挺全的，学习了，呵呵 :tiger05:呵呵....谢谢了 谢谢！正在科普此方面的知识。:hand: PDA的琼脂 在7~10就行了吧？多了不是容易裂板么``。。。我放了20&&结果 `一天 全裂了`` 培养酵母的培养基用哪种呢？ 好贴，培养酵母我直接就用牛肉膏蛋白胨培养基。 好帖子当然要顶&&顶顶更健康 麦芽汁培养基。或者马铃薯也行。 MM培养基中加了葡萄糖还能121度 20min灭菌？ 这个书上可以有 很實用呀! 感謝樓主分享. 察氏培养基的碳源怎么替换掉呢？ 标记下，回去电脑看看 请问这里面的马丁培养基是10倍的吗？/link?url=lY3Krb3KrULeT0CRPm5BIaO2YPQyJNulBNb_bhr8dhjkphHNumlKMWGfNNOPxFpyzTxjtYHve4VzTQSC_UWfJ_
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求助无机盐培养基的配置问题
最近需要配一种无机盐培养基，成分有Glucose ，K2HPO4 ，KH2PO4 ，MgSO4 x 7 H2O ，FeSO4 x 7 H2O ，MnSO4 x 6 H2O ，ZnSO4 x 6 H2O，CuSO4 x 6 H2O ，Na2MoO4 x 2 H2O，PH6.5.文献上只说葡萄糖单独灭菌，我就把其他的无机盐放在一起了，结果形成了絮状沉淀，调PH值也没有用。我的问题有几个：
1、各种无机盐的量都很少，不好称量，我能配成母液再用吗？配成母液的话会因为浓度高了不容易溶解吗？
2、我查了网上，大家说磷酸盐和二价阳离子的要分开灭菌，大家帮我看看我这个是不是就是需要这样？
3、这个培养基还让调PH值，我如果配成母液或者分开灭菌，最后只能在超净台里混合，这样我怎么调PH值呢？
谢谢大家的帮忙！
怎么没有人呢？分开灭菌之后再混合，怎么样保证一定不会再有沉淀呢？ 我觉得一定会有沉淀的，即便你分开灭也是一样。我以前配微量元素培养基，将大量元素和微量元素分开用细菌过滤器过滤灭菌之后混合，溶液直接就浑浊了（就是那种乳浊液一样），时间长了就沉淀。所以就是每次用每次混合，用多少多混合一些就行。 : Originally posted by cx at
我觉得一定会有沉淀的，即便你分开灭也是一样。我以前配微量元素培养基，将大量元素和微量元素分开用细菌过滤器过滤灭菌之后混合，溶液直接就浑浊了（就是那种乳浊液一样），时间长了就沉淀。所以就是每次用每次混合 ... 谢谢，需要用过滤除菌吗？不能高压灭菌？那混合以后有沉淀的话还能用吗？ : Originally posted by yuehongshan at
谢谢，需要用过滤除菌吗？不能高压灭菌？那混合以后有沉淀的话还能用吗？... 我配的培养基中含有维生素，烟酸等物质，所以不能高压灭菌，只能用滤膜过滤除菌。你的这个培养基中有亚铁离子，不知道高温会不会影响培养基成分。我是现配现用，沉淀不可避免，所以我觉得可以用，不过最好还是现配的用。 有人配过微量元素母液吗？是黄色还是透明的？ 这个问题我也一直在思考：高温条件下二价铁离子是一定会被氧化的，就失去了它的作用；我们的微量元素配好后是无色的 滤膜过滤应该是一个不错的方法，但是加入时又是个麻烦的问题 这个有很多原因啦，首先磷酸盐混合灭菌会产生沉淀（这个影响不大），硫酸亚铁高温灭菌会被氧化，建议过滤除菌，硫酸铜和钼酸钠反应会生成钼酸铜的沉淀（这个我前几天刚碰到，我把硫酸铜和钼酸钠混合在一起还没灭菌就产生絮状沉淀了，我就去网上查了下。
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E-mail： & QQ：8835100实验三 培养基的制备、灭菌及微生物的分离与纯化
实验三 培养基的制备、灭菌及微生物的分离与纯化
1. 了解配制培养基的一般方法和步骤；掌握牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基和马丁培养基的制备方法。 2. 了解灭菌的原理，掌握高压蒸气灭菌的操作方法。 3. 掌握严格的无菌操作技术，掌握从土壤中分离微生物的方法。 二、实验内容 1．学习牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基和马丁氏培养基的配制。 2．学习高压蒸气灭菌的操作方法。 3．学习用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌；用平板划线方法分离微生物。 4．学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。 三、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、4.5mL无菌水6管，10%酚液，49.5mL无菌水(带玻璃珠)1瓶。 土壤样品、试管、培养皿、移液管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、称量纸、牛角匙、pH试纸、棉花、报纸、记号笔、线绳、纱布、酒清灯等。 电炉、立式高压蒸气灭菌锅、手提式高压蒸气灭菌锅、超净工作台等。 四、操作步骤 （一）培养基的制备 1．牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6 （1）称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 （2）加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 （3）调pH：检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用lmol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 （4）过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。 （5）分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 （6）加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 （7）包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。 （8）灭菌：将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存。 （9）摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2。 （10）无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。 2．高氏l号培养基的配制 高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下： 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，FeSO4?7H2O 0.01g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4～7.6。
（l）称量和溶解：先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4?7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO4?7H2O，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 （2）pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 3．马丁氏培养基的配制 马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下： K2HPO4 1g，MgSO4?7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH。 （1）称量和溶解：先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 （2）分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。 （3）链霉素的加入：链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素30μg。 （二）灭菌 采用高压蒸气灭菌法进行灭菌，步骤如下： 1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。&
切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。 2．放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min灭菌。 灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。 5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。 压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。 6．将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。 (三)土壤微生物的分离 1．取土壤：取表层以下5～10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。 2．制备稀释液(要无菌操作) (1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。 (2)稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。 3. 混菌法测定菌落数的方法 (1)细菌：取10-7、10-6两管稀释液各1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作。 （2）放线菌：取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液5～6滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中，选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌平板。 （3）霉菌：取10-2、10-3两管稀释各1mL，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。在融化的土豆蔗糖培养基中，每100mL加入灭菌的乳酸1mL，轻轻摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。 4．培养：将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28～30℃中恒温培养，细菌培养1～2d，放线菌培养5～7d，霉菌培养3～5d。观察生长的菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。 （四）平板制作及划线分离方法。 1．倒平板：按无菌操作要求，在火焰旁操作，做法如3（1）。 2．划线分离：使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落。 3．培养：方法同“土壤稀释分离”。 （五）斜面接种和穿刺接种 1．斜面接种 （1）取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上。 （2）接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部（图3―4A）。注意划线要轻，不可把培养基划破。 （3）接种后30℃ 恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。 2．穿刺接种 （1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名）、接种日期，接种人等）。 （2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。 （3）接种后30℃恒温培养， 24h后观察，比较两种菌的生长结果。 五、注意事项 1．称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。 2．调pH时要小心操作，避免回调。 3．不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。 4．一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。 5．在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。 6．放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。 六、实验报告 l．记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 2．检查培养基灭菌是否彻底，记录无菌检查结果 3．记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。 计算方法：选择长出菌落数30～300之间的培养皿进行计数，按以下公式： 总菌数/g=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数 4．分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。 七、问题和思考 l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查? 3．试设计实验对饮料进行无菌检查。 4．高压蒸气灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么? 5．试设计实验，从土壤中分离出酵母菌，并进行计数
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