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【求助】怎样检测 双荧光素酶报告基因检测试剂盒
【求助】怎样检测 双荧光素酶报告基因检测试剂盒
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这个帖子发布于4年零40天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
欲用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞。其Kit的说明书上说：是先以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)，后以coelenterazine为底物来检测海肾荧光素酶(Renilla reniformis luciferase，简称Renilla luciferase)，并且在后续加入Renilla luciferase的底物时同时加入了抑制Firefly luciferase催化luciferin发光的物质，使后续检测仅仅测定到Renilla luciferase的活性，实现双荧光素酶报告基因检测。 萤火虫荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。海肾荧光素酶可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定上述荧光素酶催化的氧化过程中释放的生物荧光。如果用多功能酶标仪（Bio-Tek Synergy HT）测定，具体怎么操作呢？实验室的多功能酶标仪需要选择激发光的波长和发射光的波长，但是本说明书上未提及激发波长和发射波长，我在网上查到萤火虫荧光素的发射波长在560nm左右，但是没有激发波长，所以不知道仪器该怎样设定，用全波长扫描尝试了一次发现本底很高，即未加细胞，只有细胞裂解液和底物的溶液都能测出很高的值 ，这肯定是不对的，想请教各位大侠有没有谁做过类似的实验，仪器具体是怎么设定的？
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这个是自发荧光，当然是不需要激发光的。通常Synergy HT的荧光部分有四组滤光片，你检查下发射光Em（Emission）滤光片轮是不是有空的？检测自发荧光的话必须要有空的滤光片轮（如果满了就取一个滤光片下来），然后还要在软件里面设置哪个位置是空的，才能检测的，不然是不能检测自发荧光或化学发光的，不知道你明白了没有？
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有些明白了，我再去研究研究，十分感谢这位大侠的回答！
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还有，自发荧光是一个波段范围内的所有光的总和。具体设置：打开KC4--点system--Readers--filters/wavelength--fluorescence/luminescence--然后把空的位置写上点确定就设置好啦！滤光片轮就在正门下方，从下面打开就行啦
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呵呵，刚刚对照着我们的仪器设置的，应该没错
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