冷刺激活化的棕色脂肪对动脉粥样硬化病变的影响和机制研究--《山东大学》2013年博士论文
冷刺激活化的棕色脂肪对动脉粥样硬化病变的影响和机制研究
【摘要】：背景
动脉粥样硬化(AS)相关的心血管疾病严重危害人类健康,已成为全球范围的首要致死原因。尽管在AS预防和治疗方面取得很大进展,但仍有许多重大的科学问题亟待解决。早在1938年,Bean WB等报告冷环境与心肌梗死发生率增加具有相关性研究。经过了几个世纪的研究,越来越多的流行病学证据提示,心血管痫事件的发生与寒冷的季节或冷环境有着密切的相关联系。研究表明,气温与心肌梗死和中风的发生率有明显的负相关性。最近一项临床研究表明,冬季平均气温每降低1℃,心肌梗死的发生率将增加2.2%,再次证明冷环境可增加心血管病事件.然而,冷刺激或低温诱发心血管病事件的具体机制一直未明。长期以来,寒冷所致的血压升高和血管痉挛被认为是导致心血管事件的原因,但这些生理反应均为一过性,既不能解释温度与事件之间的定量关系,也不能解释寒冷环境下无血压升高的血管痉挛发生的心血管事件的发生。
近年研究发现,低密度脂蛋白胆固醇水平作为心血管疾病重要的危险因素,与冬季心血管病事件发生率增加这一季节性变化相一致。在2013年美国心脏病学会ACC第62届年度科学会议上,巴西坎皮纳斯州立大学医学博士Filipe Azevedo Moura等人报道了一项令人瞩目的大样本人群研究。他们在年间收集了22.7万名坎皮纳斯居民的血液样本,发现与夏季相比,受试者LDL-C130mg/dl的发生率在冬季平均增加8%；与冬季相比,夏季HDL-C40mg/dl的发生率则会增加大约9%,TG150mg/dl的发生率约增加5%。证明,气温和人血脂水平之间具有明显相关性,为深入研究冬季致心血管事件增高的机制提供新的思路。
近年研究发现,脂肪的代谢与温度存在密切关系,寒冷环境中,脂肪组织的代谢发生变化。脂肪组织是人体重要的代谢器官,主要由两种功能不同的脂肪组织组成：白色脂肪组织和棕色脂肪组织。WAT是能量储存、调节机体代谢和分泌胰岛素抵抗激素和细胞因子的主要部位；BAT的生理性作用是产热维持机体的温度,主要负责分解白色脂肪,转化为二氧化碳、水和热量,是基础性和诱导性能量输出的主要部位。寒冷环境下激活的脂肪代谢产热就是由棕色脂肪来完成。
在啮齿类动物中,冷刺激可有效地活化棕色脂肪组织,也可有效地促进白色脂肪组织向具有高代谢率的棕色脂肪样组织(BAT-like tissue, BRITE)转型。近期几项研究表明,成年人体内有大量的BAT,而且冷刺激可促进BAT的活化。基于以上文献和研究,我们提出了以下假说：1.冷刺激可显著活化apoE-/-小鼠棕色脂肪组织,影响脂肪组织脂降解速率,改变小鼠的血脂水平和能量代谢；2冷刺激可促进apoE-/-小鼠WAT转变为BRITE,影响脂肪组织脂降解速率,改变小鼠的血脂水平和能量代谢；3.冷刺激可影响BAT的活化和WAT/BRITE的转换,改变血脂水平,从而影响apoE-/-小鼠AS的进程。
为了验证以上假说,我们利用冷刺激模型(4℃)进行研究和并选用等热区内环境(30℃)作为对照,选取AS的经典动物模型apoE-/-小鼠以及同样基因背景的C57野生型小鼠作为对照,并着重研究雄性小鼠的以下几个脂肪组织储点：皮下白色脂肪组织(sWAT)、附睾白色脂肪组织(eWAT)(?)口肩胛间区棕色脂肪组织(iBAT)。将8周龄apoE-/-雄性小鼠随机分为30℃组和4℃组,观察冷刺激后,BAT的活化以及WAT向BRITE的转化对小鼠AS进展和斑块稳定性的影响。
1.研究冷刺激是否能有效活化BAT
2.研究冷刺激是否能促进WAT向BRITE转化
3.研究冷刺激是否促进AS的进程
1.实验动物：8周龄雄性C57BL/6小鼠和apoE-/-小鼠购白北京维通利华公司,所有动物在取材时,均使用0.8%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后脱臼处死。所有动物实验均符合山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。
2.冷刺激模型构建：apoE-/-和C57BL/6野生型小鼠,随机分组,先将冷刺激组小鼠放入18℃中冷适应一周后,再转移至4℃中饲养；将30℃组小鼠直接放置在30℃中饲养。
3.代谢率检测：在冷刺激结束时,将小鼠麻醉后置于小动物呼吸代谢测量仪的呼吸室中,连续记录30min的O2消耗量,CO2呼出量以及温度,湿度和压力,作为小鼠的基础代谢率。皮下注射NE,继续连续记录90min的呼吸代谢参数,作为小鼠活体状态下BAT活性的检测指标。
4.脂降解速率检测：冷刺激结束后,将apoE-/-小鼠麻醉,分离eWAT组织,一部分组织用于制备组织匀浆,检测脂肪组织中cAMP水平；另一部分脂肪组织,消化分离脂肪细胞,检测细胞脂降解产物甘油的水平。
5.组织样本采集：各组小鼠禁食过夜,麻醉后从心尖抽取血液。处死小鼠后,分别收集各储点的脂肪组织,心脏血管组织。用于检测基因mRNA水平等的分子生物学研究的样本,分离组织后迅速置于液氮中保存备用。用于组化研究的组织则置于4%甲醛中固定过夜后,用1X PBS洗涤,一部分组织用于石蜡包埋,一部分用于制备冰冻切片。
6.血脂水平检测：小鼠麻醉后,留取血液分离血浆,并检测血浆中TC、TG、LDL-C、 HDL-C、FFA和皮质醇水平。
7.组织学染色以及免疫组织化学染色：脂肪组织和血管组织均进行HE染色。对血管组织还进行天狼猩红染色来评估胶原含量,进行油红O染色反映斑块内脂质含量。并对各组织切片进行相应的免疫组织化学染色,检测各指标的蛋白表达情况。
8.统计学分析定量数据均以均数±标准误表示,应用双侧t检验。设P0.05为有统计学意义。
1.冷刺激活化BAT并诱导BRITE
sWAT和eWAT的组织学分析显示冷刺激组小鼠的脂肪细胞形态更小,sWAT和eWAT总体积也小。HE染色显示,4℃组小鼠的sWAT和eWAT具有更致密和丰富的细胞器。免疫组织化学染色显示4℃组sWAT和eWAT中UCP1高表达,而在30℃组几乎检测不到。这些证据提示,冷刺激可促进apoE-/-小鼠的WAT向BRITE转化。冷刺激显著增加iBAT中的UCP1的表达,显著增加apoE-/-小鼠NST能力,证实冷刺激可迅速活化小鼠BAT。免疫组化染色和脂肪组织整体包埋染色均显示冷刺激可显著增加4℃组的WAT和BAT中的微血管密度。
2.冷刺激促进脂降解和代谢
冷刺激显著减轻的apoE-/-和野生型小鼠的体重和体重指数,证实冷刺激增加了机体的代谢率,使小鼠呈现苗条的形态。冷刺激显著增力(?)apoE-/-小鼠的代谢率。血浆甘油三酯水平显著降低,而总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平以及甘油水平显著增加,游离脂肪酸的水平基本无差别。
3.脂降解相关的基因表达增加
为了研究代谢相关基因的表达水平变化,我们选取有显著BRITE改变的inWAT,进行全基因组芯片分析。基因簇和主要成分分析表明基因表达模式具有极高的可重复性。4℃组inWAT的许多脂降解相关基因(UCP1, Cidea, Pdk4, Acadvl, Cox8b, Cox7al, Thea, FabpS, Acaa2, Slc25a20, Elov13等)的表达水平显著增加。而且,其中许多高表达的脂降解相关的基因(HSL, FAS, GK)都是脂质氧化分解相关的重要的酶。实时定量PCR进一步证实了这些基因的高mRNA水平。
与30℃组相比,冷刺激组eWAT的cAMP水平显著增加。另外,将30℃和4℃小鼠eWAT分离的脂肪细胞,加入或不加ISO进行培养,4℃组小鼠的脂肪细胞在[SO作用下,迅速增加了脂降解产物甘油的释放速率,证实4℃组小鼠的脂肪细胞具有更高的脂降解速率。
4.冷刺激促进apoE-/-小鼠斑块的生长
大体油红O染色显示冷刺激组小鼠的主动脉弓,胸主动脉,腹主动脉和髂总动脉均有更广泛的斑块。横截面切片分析也证实,冷刺激组小鼠主动脉根部的斑块显著高于30℃对照组。油红O染色也进一步证实冷刺激显著促进AS斑块的增长。
1.冷刺激可显著活化apoE-/-小鼠BAT,引起WAT向BRITE的转化。
2.冷刺激引起的脂肪组织变化,可显著促进脂降解速率,增加血浆LDL-C水平。
3.冷刺激可显著加重apoE-/-小鼠AS的病变。
根据WHO最新发布的卫生统计公告,由AS所导致的急性心肌梗死、心绞痛、心脏性猝死、缺血性脑卒中、心力衰竭等心血管疾病已成为全世界第一位死因,年死亡人数近2000万,占各种疾病死因的22%。据预测,至2030年,心血管疾病仍将是全球的首位死因,占全因死亡率的26%。我国平均每11.6秒即有1人死于心血管疾病,心血管疾病已成为中国的第一位杀手,这一死亡速度是美国的3倍。因此,解决重大问题深入研究AS的发生机制治疗靶点已成为急需。AS的主要危害在于AS所导致的急性心血管事件。传统观点认为,急性心血管事件的发生是由于AS斑块逐渐增大突入管腔,造成管腔狭窄和组织缺血。然而近年研究发现,斑块破裂和糜烂所诱发的血栓形成是急性心血管事件发生的主要机制,因而这类斑块被称为不稳定斑块。稳定型心绞痛的AS斑块是：有较厚的纤维帽、内含大量的细胞外基质、较少的脂质和巨噬细胞等炎性细胞,属于较稳定的斑块。
血管壁中胆固醇的沉积贯穿AS的发生和发展过程,在AS斑块的破裂中也充当了重要角色,LDL-C可促进内皮细胞和平滑肌细胞凋亡,激活基质金属蛋白酶,削弱纤维帽,进一步促进炎症反应,最终引发斑块破裂和血栓形成。AS的发生和发展是一个慢性炎症的过程。AS斑块中的慢性炎症转变为急性炎症是斑块发生破裂的关键因素。大量研究证实,斑块内出血显著加剧AS斑块不稳定性,斑块内出血主要来源于斑块内不成熟的新生滋养血管。
为了排除冷刺激对AS的影响仅存在于apoE-/-小鼠这一特殊模型,我们选择了另一经典AS小鼠模型LDLR-/-小鼠,进一步研究冷刺激对AS的影响和作用机制。结合以上文献和前期研究,我们提出如下假说：1.冷刺激能够明显加剧BAT活化和促进WAT/BRITE转化,增加脂肪组织的脂降解速率和肝脏胆固醇合成速率,影响血脂的代谢平衡,促进AS的进展和AS斑块的易损性：2.冷刺激显著增加apoE-/-小鼠外周循环和斑块局部的炎症反应,促进斑块内血管新生,从而显著增加AS斑块的不稳定性；3.冷刺激显著促进了LDLR-/-小鼠的AS进程并加重了斑块易损性。基于以上假说,我们选取apoE-/-小鼠禾口LDLR-/-小鼠,进一步探讨了冷刺激对AS病变的影响及其具体机制。
1.实验动物：8周龄雄性apoE-/-小鼠购白北京维通利华公司,8周龄雄性LDLR-/-小鼠购白南京动物模型研究所,所有动物在取材时,均使用0.8%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后脱臼处死。所有动物实验均符合山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。
2.冷刺激模型构建：apoE-/-和LDLR-/-小鼠,随机分组,将冷刺激组小鼠先放入18℃中适应一周后,转移至4℃中饲养；而30℃组小鼠则直接放置在30℃中饲养。
3.代谢率检测：在冷刺激结束前,将小鼠麻醉后置于小动物呼吸代谢测量仪的呼吸室中,连续记录30min的O2消耗量,CO2呼出量以及温度,湿度和压力,作为小鼠的基础代谢率。皮下注射NE,继续连续记录90min的呼吸代谢参数,作为小鼠活体状态下BAT活性的检测指标。
4.脂降解速率检测：冷刺激结束后,将apoE-/-小鼠麻醉,分离eWAT组织,一部分组织用于制备组织匀浆,检测脂肪组织中cAMP水平；另一部分脂肪组织,消化分离脂肪细胞,检测细胞脂降解产物甘油的水平。
5.组织样本采集：各组小鼠禁食过夜,麻醉后从心尖抽取血液。处死小鼠后,分别收集各储点的脂肪组织,心脏血管组织。用于检测基因mRNA水平等的分子生物学研究的样本,分离组织后迅速置于液氮中保存备用。用于组化研究的组织则置于4%甲醛中固定过夜后,用1X PBS洗涤,一部分组织用石蜡包埋,一部分用于制备冰冻切片。
6. FPLC检测：快速蛋白液相质谱分析法被用于详细分析血浆中胆固醇和TG的具体脂蛋白成分。吸取100u1血浆样本,使用Superose6HR10/30分离柱,用无菌1×PBS (0.02%sodium azide, pH7.4.)进行洗脱。以0.5ml/min的速度进行洗脱,收集60个fraction样本,0.5ml/fraction。使用ELISA检测法,检测每fraction中胆固醇和TG的含量。其中5-10分升被用于计算VLDL/IDL,11-19用于分析LDL,而20-30分升被用于分析HDL。
7.肝脏胆固醇合成速率：在冷刺激八周末,分别随机选取6只小鼠,腹腔注射20μCi[3H]标记的水。1小时后,[3H]标记的水与小鼠体内的水达到平衡状态。麻醉后,留取小鼠的全血,分离获得血浆。用生理盐水灌注小鼠循环系统,分离肝脏组织。分别从每只小鼠取约200-300mg左右的肝脏组织,将肝脏组织匀浆后,皂化,分离出洋地黄皂甙可沉淀的甾醇。检测每小时每g组织中,有多少[3H]标记的水掺入到洋地黄皂甙可沉淀的甾醇。
8.组织学染色以及免疫组织化学染色：脂肪组织和血管组织均根据标准的HE染色步骤进行染色。对血管组织还进行天狼猩红染色来评估胶原含量,进行油红O染色反映斑块内脂质含量。并对各组织切片进行相应的免疫组织化学染色,检测各指标的蛋白表达情况,使用各种一抗,检测主动脉根部斑块的脂质,巨噬细胞,平滑肌,以及I型胶原含量,计算斑块的易损指数。易损指数的计算公式：(脂质+巨噬细胞)／(平滑肌+I型胶原)。
9.统计学分析定量数据均以均数±标准误表示,应用双侧t检验。设P0.05为有统计学意义。
1.冷刺激活化BAT并诱导BR1TE
sWAT和eWAT的组织学分析显示冷刺激组小鼠的脂肪细胞形态更小,sWAT和eWAT总体积也小。HE染色显示,4℃组小鼠的sWAT和eWAT具有更致密和丰富的细胞器。免疫组织化学染色显示4℃组sWAT和eWAT中UCP1高表达,而在30℃组几乎检测不到。这些证据提示,冷刺激下apoE-/-小鼠的WAT可转变为BRITE。冷刺激也显著增加了肩胛间区BAT中的UCP1的表达。冷刺激也可显著增加4℃组的WAT和BAT中的微血管密度。
2.冷刺激促进脂降解和代谢
冷刺激显著减轻的apoE-/-和野生型小鼠的体重和体重指数,证实冷刺激增加了机体的代谢率,使小鼠呈现苗条的形态。冷刺激显著增加apoE-/-小鼠的代谢率。血浆TG水平显著降低,而TC和LDL-C水平以及甘油水平显著增加,游离脂肪酸的水平基本无差别。
3.脂降解相关的基因表达增加
为了研究代谢相关基因的表达水平变化,我们选取有显著BRITE改变的inWAT,进行全基因组芯片分析。基因簇和主要成分分析表明基因表达模式具有极高的可重复性。4℃组inWAT的许多脂降解相关基因的表达水平显著增加。而且,其中许多高表达的脂降解相关的基因都是脂质氧化分解相关的重要的酶。实时定量PCR进一步证实了这些基因的高nRNA水平。
冷刺激组的eWAT与30℃组相比,具有显著增加的cAMP水平。另外,将30℃和4℃小鼠eWAT分离的脂肪细胞,加入或不加ISO进行培养。4℃组小鼠的脂肪细胞在ISO作用下,迅速增加了脂降解产物甘油的释放速率,证实4℃组小鼠的脂肪细胞具有更高的脂降解速率。
4.冷刺激明显改变血脂成分
FPLC检测发现,冷刺激组小鼠的血浆胆固醇以VLDL增加为主,IDL和LDL也显著增加。血浆HDL胆固醇含量则基本与30℃组小鼠无很大差别。我们利用腹腔注射[3H]-标记的水,进行检测小鼠肝脏胆固醇合成速率,发现冷刺激下的apoE-/-小鼠具有显著升高的胆固醇合成速率。我们还发现肝脏组织中胆固醇合成相关的几个重要基因的mRNA水平也在冷刺激下发生了显著增加。其中,HMG-CoA还原酶,SREBPs等多个胆固醇合成相关的转录因子以及其结合蛋白SCAP等都显著增加。而血浆TG在冷刺激下显著降低。
5.冷刺激促进apoE-/-小鼠斑块的增长
大体油红O染色显示,长期冷刺激组的apoE-/-小鼠主动脉根部斑块与短期冷刺激组相比,斑块面积显著增加,而30℃环境中,长期和短期相比仅有较小的增长趋势。横截面组织切片的HE染色显示,长期冷刺激组小鼠的斑块面积显著增长,而30℃小鼠在经过不同的暴露时间是,其变化不是很明显。
6.冷刺激加剧apoE-/-小鼠斑块的易损性
免疫组织化学染色显示,冷刺激8周后,小鼠主动脉斑块的平滑肌和I型胶原含量显著减少,巨噬细胞和脂质的含量显著增高,显著增加apoE-/-小鼠AS斑块的易损指数。组织化学分析还显示,冷刺激组织小鼠的主动脉斑块有更大的坏死核心和更薄的纤维帽。这两个参数进一步证实,冷刺激组的apoE-/-小鼠主动脉根部斑块具有更高的不稳定性,更加易于破裂,危险性更高。
7.冷刺激促进LDLR-/-小鼠斑块的增长和易损性
与apoE-/-类似,冷刺激8周后,WAT的UCP1表达显著增加,向BRITE转变；LDLR-/-小鼠BAT的UCP1表达量也显著增加。同时,在匹配饮食量喂养的条件下,冷刺激也能显著减低LDLR-/-小鼠的体重和体重指数。表明,脂降解在冷刺激组的LDLR-/-小鼠中也得到了显著增加。而NST相关的代谢率检测则进一步证实在冷刺激下的LDLR-/-小鼠中具有更高的代谢状态。
冷刺激显著增加了脂降解相关的重要的成分cAMP的水平。而同样地,冷刺激组LDLR-／-小鼠脂肪细胞的脂降解产物甘油水平也显著高于30℃对照组,进一步提示,冷刺激使其脂降解速率显著增加。4℃组小鼠具有较高的血浆TC水平禾(?)LDL-C水平。FPLC的进一步分析显示4℃组小鼠具有较高的VLDL-C和LDL-C水平,HDL-C水平则在两组间无显著差异。
与apoE-/-小鼠相比,LDLR-/-小鼠的斑块发展没有那么的迅猛。但组织学检测仍然发现,冷刺激显著增力(?)LDLR-/-小鼠的斑块面积,斑块易损性相关指标包括巨噬细胞浸润,脂质沉积都显著高于nLDLR-/-小鼠,,平滑肌和I型胶原含量则显著降低。冷刺激下的LDLR-/-小鼠的易损指数比30℃组高出约8倍多。与apoE-/-小鼠类似,冷刺激组的斑块也具有更大的坏死核心和薄的纤维帽。综上所述,冷刺激可显著促进LDLR-/-小鼠的AS斑块的发展和易损性,而且这一现象并不只局限于某一特类小鼠中。
1.冷刺激显著增加apoE-/-小鼠肝脏的胆固醇合成速率,增加血浆VLDL-C和LDL-C水平。
2.冷刺激显著增加apoE-/-小鼠循环系统和斑块局部的炎症反应,增加AS斑块内新生血管,从而显著促进AS斑块的不稳定性。
3.冷刺激显著促进LDLR-/-小鼠的AS进程,加剧AS斑块的易损性。
大量研究表明,冬季心血管疾病的死亡率显著增加。但冬季与高发的心血管疾病尤其是冠心病间相关性的机制仍存在争议,研究者们多认为冷环境和／或呼吸道感染或冬季的间接影响如铲雪等导致这些疾病的高发。但冷刺激具体是通过何种机制影响心血管疾病进程,至今尚无公认观点。我们在前期研究中已验证,冷刺激可显著加剧小鼠的AS进程,增加斑块的不稳定性,同时我们还发现,冷刺激也显著增加了小鼠血浆LDL-C。冷刺激是通过活化交感神经系统-NE-BAT/BRITE-UCP1-脂降解事件链而发挥了以上的影响。为了进一步证实以上作用通路具体环节,在本研究中我们分别在NE和UCP1这两个关键靶点展开了相关研究。
众所周知,冷刺激迅速兴奋交感神经系统,释放大量NE。为了阐明NE的生理作用在多大程度上通过β3-肾上腺素能受体介导完成,学者们常对比研究NE刺激和某些β3-肾上腺素能受体特异性激动剂的差异。其中CL-316243为现有的最为特异性p3-肾上腺素能受体激动剂。相反地,想要去除β3-肾上腺素能受体的活化作用,常使用β3-肾上腺素能受体拮抗剂(SR59230A)。结合前期研究我们推测,冷刺激对apoE-/-小鼠AS的影响是因为NE激活β3-肾上腺素能受体,活化BAT并引发WAT向BRITE的转换,脂降解增加,脂质代谢改变,引发胆固醇合成增加外,高血浆胆固醇水平而促进AS的进程。
脂肪因子尤其是脂联素与AS的关系备受关注。脂联素转基因小鼠证实脂联素可改善胰岛素抵抗和糖尿病,而脂联素敲除小鼠则表现出中度胰岛素抵抗以及血糖不耐受,同时也体现了代谢综合征的其他的一些特征,包括血脂异常和高血压。研究证明,低脂联素血浆水平与人类胰岛素抵抗相关的许多状态密切相关,如血脂异常,心血管疾病以及高血压。鉴于脂肪组织和脂联素以及脂联素和AS间的密切关系,我们推测冷刺激明显改变脂肪组织的代谢状态,可影响血浆脂联素水平,外源性注射脂联素,亦可反向影响冷刺激条件下脂肪组织的代谢。
在分泌脂肪因子和调节机体代谢方面,BAT与WAT有着类似的功能。但与WAT不同的是,BAT的生理性作用是产热维持机体的温度。棕色脂肪细胞通过其大量的线粒体成分,利用UCP-1解偶联细胞呼吸链而产热起到保温的作用。据此,我们提出以下科学假说：冷刺激活化的交感神经系统,释放的神经递质NE,主要作用于β3-肾上腺素能受体,发挥其对BAT和WAT/BRITE的作用,从而改变UCP1表达,进而影响脂降解速率以及血脂水平和AS进程等。
为了明确p3-肾上腺素能受体在此过程中发挥的作用,我们在本文中选取了p3-肾上腺素能受体激动剂(CL-316243)和β3-肾上腺素能受体拮抗剂(SR59230A),研究了冷刺激对apoE-/-小鼠棕色脂肪组织和AS病变影响。为了进一步探讨UCP1是否是冷刺激影响AS发生和发展的关键环节,我们在本研究中构建apoE-/-UCP1-/-双基因敲除小鼠。随机将8周龄apoE-/-UCP1-/-雄性小鼠分为30℃C组和4℃组,探讨UCP1敲除后,冷刺激是否仍会引起脂肪组织的代谢改变,并加剧AS的进程和易损性,进一步揭示冷刺激影响AS的具体机制。
1.研究CL316243是否能对apoE-/-小鼠产生于冷刺激类似的影响。
2.研究SR59230A是否能阻断冷刺激对apoE-/-小鼠AS的影响。
3.研究冷刺激对脂联素水平影响,以及脂联素与UCP1的关联。
4.研究UCP1在冷刺激加剧AS进程中的作用。
1.实验动物：
8周龄雄性apoE-/-小鼠购自北京维通利华公司,将apoE-/-小鼠和UCP1-/-小鼠杂交,构建apoE-/-UCP-1-/-小鼠。所有动物在取材时,均使用0.8%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后脱臼处死。所有动物实验均符合山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。
2.实验动物分组：
8周龄雄性apoE-/-小鼠,高脂喂养四周后随机分组：盐水对照组和β3-肾上腺素能受体激动剂(CL316,243)组,仍放于22℃中正常饮食喂养四周后取材；
8周龄雄性apoE-/-小鼠,高脂喂养四周后随机分组：盐水对照组和β3-肾上腺素能受体拮抗剂(SR59230A),同时改为正常饮食,先放入18℃中适应一周后,转移至4℃中饲养三周。
apoE-/-和AUDK小鼠,随机分组,冷刺激组小鼠先放入18℃中适应一周后,转移至4℃中饲养；而30℃组小鼠则直接放置在30℃中饲养。
脂联素实验组的apoE-/-小鼠,随机分为30℃对照组,4℃空白对照组(4℃-VT)和4℃脂联素治疗组(4℃-Adipo)。
3.代谢率检测：在冷刺激结束前,将小鼠麻醉后至于小动物呼吸代谢测量仪的呼吸室中,连续记录30min的O2消耗量,CO2呼出量以及温度,湿度和压力,作为小鼠的基础代谢率。皮下注射NE,继续连续记录90min的呼吸代谢参数,作为小鼠活体状态下BAT活性的检测指标。
4.组织样本采集：各组小鼠禁食过夜,麻醉后从心尖抽取血液。处死小鼠后,分别收集各储点的脂肪组织,心脏血.管组织。用于检测基因mRNA水平等的分子生物学研究的样本,分离组织后迅速置于液氮中保存备用。用于组化研究的组织则置于4%甲醛中固定过夜后,用1X PBS洗涤,一部分组织用石蜡包埋,一部分用于制备冰冻切片。
5.组织学染色以及免疫组织化学染色：脂肪组织和血管组织均根据标准的HE染色步骤进行染色。对血管组织还进行天狼猩红染色来评估胶原含量,进行油红O染色反映斑块内脂质含量。并对各组织切片进行相应的免疫组织化学染色,检测各指标的蛋白表达情况,使用各种一抗,检测主动脉根部斑块的脂质,巨噬细胞,平滑肌,以及I型胶原含量,计算斑块的易损指数。易损指数的计算公式：(脂质+巨噬细胞)／(平滑肌+I型胶原)。
6.分子生物学检测：将脂肪组织一部分用于提取蛋白组织,进行western-blotting检测小鼠脂肪组织中UCP1的蛋白表达水平；另一部分脂肪组织用于提取RNA,进行RT-PCR检测小鼠脂肪组织中UCP1的mRNA表达水平。
7.统计学分析定量数据均以均数±标准误表示,应用双侧t检验。设P0.05为有统计学意义。
1.β3-肾上腺素能受体激动剂(CL316,243)对apoE-/-小鼠的影响
与冷刺激的作用相似,β3-肾上腺素能受体激动剂显著减低了常温条件下apoE-/-小鼠的体重和体重指数,增加了小鼠的氧耗量即小鼠的NST能力。组织学病理分析表明,CL316,243显著减小了脂肪细胞大小,增加了UCP1的表达量,增加了脂肪组织的新生血管量,即活化了BAT,并促进了VVAT向BRITE的转换。RT-PCR检测同样提示,p3-肾上腺素能受体激动剂的作用类似于冷刺激的直接影响,CL316243可显著增加脂肪组织中UCP1等基因的nRNA表达水平。
β3-肾上腺素能受体激动剂对apoE-/-的AS进程同样具有类似于冷刺激直接作用的影响,CL316243组小鼠的血浆总胆固醇水平、LDL-C、HDL-C显著高于盐水对照组。大体油红O染色显示,CL316243(?)(?)著增加了apoE-/-小鼠血管组织的表面斑块面积,主动脉根部横截面组织切片染色则进一步提示,CL316243可显著促进小鼠AS斑块的进展,加剧小鼠斑块的不稳定性。斑块组织的RT-PCR也提示,CL316243可显著增加斑块组织的炎性因子表达水平。
2.β3-肾上腺素能受体拮抗剂(SR59230A)对apoE-/-小鼠的影响
将β3-肾上腺素能受体拮抗后,SR59230A并未影响冷刺激下小鼠体重和体重指数的改变,但其显著抑制了冷刺激对小鼠血浆总胆固醇和LDL-C水平的增加作用,但仍高于30℃组。组织病理学染色则提示,β3-肾上腺素能受体拮抗剂显著抑制了冷刺激对apoE-/-小鼠AS斑块的促进作用,且稳定了冷刺激中的小鼠斑块,增加了斑块的纤维帽厚度,从而抑制了冷刺激对AS进程的恶化作用。
3.冷刺激对apoE-/-UCP1-/-(AUDK)小鼠的影响
4℃组AUDK小鼠体重和体重指数与30℃组AUDK小鼠无明显的差异：4℃组AUDK小鼠的氧耗量和C02呼出量与30℃组AUDK小鼠无明显的差异；脂肪组织免疫组织化学染色验证AUDK小鼠中UCP1被完全敲除,iBAT和eWAT中均未见UCPl阳性着色；脂肪组织的脂降解速率指标cAMP和glycerol水平在AUDK小鼠的两组间无明显的差异。
4℃组AUDK小鼠血浆总胆固醇水平明显低于4℃-apoE-/-小鼠,与30℃AUDK小鼠间无明显的统计学差异；4℃组AUDK小鼠血浆低密度脂蛋白胆固醇水平则显著低于4度apoE-/-小鼠,30℃组AUDK小鼠；4℃组AUDK小鼠血浆甘油三酯水平高于4℃组apoE-/-小鼠,而与30℃小鼠间无明显的统计学差异。
4℃组AUDK小鼠主动脉根部斑块面积明显小于4℃组apoE-／-小鼠,略高于30℃组AUDK小鼠；4℃组AUDK小鼠斑块内脂质和巨噬细胞含量明显低于30℃组AUDK小鼠；4℃组AUDK小鼠斑块内平滑肌含量明显低于30℃AUDK小鼠；4℃组AUDK小鼠斑块内I型胶原含量明显高于30℃AUDK小鼠；4℃组AUDK小鼠斑块的易损指数与30℃组AUDK小鼠无明显差异,却明显低于4℃组apoE-/-小鼠。
4.冷刺激对apoE-/-小鼠血浆脂联素水平的影响
冷刺激4周明显降低了apoE-/-小鼠血浆脂联素的水平,具有显著的统计学差异；冷刺激8周的apoE-/-(?)、鼠血浆脂联素水平持续低于30℃对照组apoE-/-小鼠,虽然差异不像短期刺激组那么明显,但仍具有显著的统计学差异；全程正常喂养条件下,冷刺激组的apoE-/-(?)、鼠血浆脂联素水平明显低于30℃对照组,具有明显的统计学差异。
5.脂联素治疗对冷刺激条件下apoE-/-小鼠的影响
冷刺激条件下,脂联素治疗组(4℃-Adipo)apoE-／-小鼠的血浆总胆固醇水平明显低于4℃空白对照组(4℃-VT),高于30℃组；4℃-Adipo组小鼠血浆LDL-C水平明显低于4℃-VT组,仍高于30℃。
冷刺激条件下,脂联素治疗组apoE-/-小鼠的sWAT、eWAT和iBAT组织的UCP1蛋白表达水平明显高于4℃空白对照组,并具有显著的统计学差异；冷刺激条件下,脂联素治疗组apoE-/-、鼠的主动脉根部斑块面积明显低于4℃空白对照组,并具有显著的统计学差异；冷刺激条件下,脂联素治疗组apoE-/-小鼠的斑块的易损指数也明显低于4℃空白对照组,具有明显的统计学差异；冷刺激条件下,脂联素治疗组apoE-/-(?)、鼠的斑块坏死核心面积明显低于4℃-VT组,具有显著的统计学差异；冷刺激条件下,脂联素治疗组apoE-/-小鼠的斑块的纤维帽厚度则明显高于4℃-VT组,具有明显的统计学差异。
分子生物学检测结果表明,冷刺激条件下脂联素治疗组apoE-/-小鼠的sWAT、 eWAT和iBAT组织的UCP1基因mRNA表达水平明显低于4℃的空白对照组,具有明显的统计学差异；western-blotting检测进一步证实,冷刺激条件下,脂联素治疗组apoE-/-小鼠的sWAT、eWAT和iBAT组织的UCP1蛋白表达水平也明显低于4℃组的空白对照组,甚至在sWAT和iBAT中,4℃-Adipo组UCP1蛋白表达水平明显低于30℃组小鼠,并具有显著的统计学差异。
1.β3-肾上腺素能受体激动剂CL-316243活化BAT/BRITE,改变apoE-/-血脂水平,影响AS进程。
2.β3-肾上腺素能受体拮抗剂SR59230A阻断了冷刺激对apoE-/-小鼠AS进程的影响。
3.UCP1在冷刺激加剧的AS进程中发挥了重要的作用。
4.脂联素通过抑制UCP1表达,而发挥其对AS的保护性作用。
【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：R543.5【目录】：
论文 Ⅰ 短期冷刺激对动脉粥样硬化小鼠模型机体代谢和血管病变的影响8-75 摘要8-13 ABSTRACT13-20 符号说明Ⅰ20-22 前言22-25 材料和方法25-48 结果48-51 讨论51-57 结论57-58 附表58-60 附图60-69 参考文献69-75论文 Ⅱ 长期冷刺激对动脉粥样硬化小鼠模型机体代谢与斑块稳定性的影响和机制研究75-145 摘要75-81 ABSTRACT81-91 符号说明Ⅱ91-93 前言93-95 材料和方法95-108 结果108-115 讨论115-121 结论121-122 附表122-123 附图123-141 参考文献141-145论文 Ⅲ 冷刺激影响动脉粥样硬化病变的机制研究145-202 摘要145-151 ABSTRACT151-159 符号说明Ⅲ159-161 前言161-163 材料和方法163-170 结果170-174 讨论174-180 结论180-181 附表181-182 附图182-195 参考文献195-202致谢202-204攻读博士学位期间发表SCI文章204-205SCI论文Ⅰ205-238SCI论文Ⅱ238-267学位论文评阅及答辩情况表267
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