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标题: 具有实战经验的western&blotting&高手请指导（急！）
摘要: 具有实战经验的western blotting 高手请指导（急！）具有实战经验的western blotting 高手请指导（急！）大家好，我现在做western blotting ，昨天刚跑了一次电泳，但是没有完全转膜，今天又进行了一次，可能还差点。 我一个人在实验室做实验，没人指导，也没人帮我，而老板要我（或者说）希望我能一次就能成功检测到目标蛋白。（因为买的一抗只够用一次的）。 有实战经验的人，能不能先教教我，给我提个醒，在实验中应注意什么问题？
关键词:[抗体 滤纸 转膜 电泳 血清]……
具有实战经验的western blotting 高手请指导（急！）
大家好，我现在做western blotting ，昨天刚跑了一次电泳，但是没有完全转膜，今天又进行了一次，可能还差点。
我一个人在实验室做实验，没人指导，也没人帮我，而老板要我（或者说）希望我能一次就能成功检测到目标蛋白。（因为买的一抗只够用一次的）。
有实战经验的人，能不能先教教我，给我提个醒，在实验中应注意什么问题？
我这次搞得很糟糕。第一：配TBS，其pH值竟然小于2，原因是，配0.1MHCl（1000ml 水118mlHCl),谁能告诉我标准的（或者说）是约定俗成的配法，不胜感激！第二：配BSA封闭液时，将BSA加进TBS中，大部分没有溶解，而只买了25克的BSA，真是烦！第三：剪滤纸，我要花很久，尤其是对齐，对不齐，能不能告诉我点密方。第四：在组装三明治时，是不是不能比滤纸和膜大很多呀。怎么样才会导致短路呀。
还有后面的实验，请先告诉我点注意事项，（能不能不用封闭液稀释抗体呀，BSA封闭，用牛血清稀释抗体，行吗？）
怎么没人理我呀。！！！回复:
可能好好参考《分子克隆实验指南》，将需要做流程的记录下来，每步进行推敲，然后再做，即会明白该怎么做。
若还不放心，则用缓冲液代替，按流程认真实际操作一遍，即可达到练手的目的。
我在摸索条件时经常这样，可节约贵重。回复:
Transfer buffer(25mM Tris-HCl,192mM Gly,20%甲醇)
Tris 3.03g
Gly 14.42g
甲醇:200ml
10mM Tris-HCl pH7.4-7.5
150mM NaCl(0.9%)
封闭buffer:5-6%脱脂奶粉之TBS,
洗膜液:0.05%吐温20之TBS; 1%BSA,0.05%吐温20之TBS.
碱性底物buffer:
100mM Tris-HCl,pH9.5,
100mM NaCl,
1ml 70%DMF(二甲基甲酰胺)
132ul NBT加入20ml碱性底物buffer,混匀,加入66ul BCIP,混匀,30min内有效,避光.
1切与之相同大小的NC膜,膜与胶分别在transfer buffer中平衡10min(摇床上进行);
2,装好转印槽,按Mini VE说明进行,滤纸等均润湿;
3,电转,397mA,37V左右,电转2.5hr,
4,电转完后,将膜放入平皿中,加入50ml封闭液,封闭1.537℃,摇床;
5, 37℃平皿,摇床,0.05%吐温20之TBS液洗膜2×12
6, 37℃平皿,摇床, 1%BSA,0.05%吐温20之TBS润洗2
7,一抗(1000×),5ul,加入5ml 1%BSA,0.05%吐温20之TBS中, 37℃,密封袋,摇床,45
9,二抗(500×),10ul至5ml 1%BSA,0.05%吐温20之TBS中, 37℃,密封袋,摇床,45
11,染色,将膜放入有20ml染色液中,平皿,37℃,显色至带出为止.
3 在4度冰箱转,不然会烧胶
水要事先冷却
我补充几点吧：
1）第一个问题，配TBS，楼上的兄弟已经介绍得很清楚了，我不多说。
2）配BSA封闭液，没有溶解？应该不会的，不知你配的浓度是多少。我一般配1%-5%的，很好溶的。
3）滤纸的对齐问题，先按胶的大小剪好，然后润湿，粘在胶上就OK了，很容易对齐的，你试一试。有点水就比较好对齐的。
4）组装三明治时，只要差别不是很大，一般情况下都不容易短路的。
5）抗体可以不用封闭液稀释，改为TBS。
6）其他：三明治中要保证没有气泡；转印在低温下进行；若用硝酸纤维素膜，润湿后可直接用，若为PVDF膜，还需用甲醇浸泡活化30分钟后再使用。回复:
用裁纸刀很方便的回复:
多谢大家啦。我会努力的。回复:
coco965,用TBS稀释抗体会不会出现问题呀。
我买的二抗，说明书上建议用牛稀释，不按它上面的做行吗？回复:
建议当然是最好的选择了，只是你手头的牛不够呀，用buffer代替没有问题的。你可以试一试哦！
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&& ?&你真的成年了吗？对照一下这20个标准
什么标准可以衡量一个人真正地成年？为什么？每个人的答案都会是一个主观的认识。其实，严格来说，成人的标准不是年龄，而是情感上的成熟。那么，又是什么决定了一个人情感的成熟，进而决定他是否成年呢？一个人真正成年应具备以下20条起决定性作用的特征和能力：1、认识到成熟不是一个状态，而是一个渐进的过程，是一个连续的自我发展的过程。2、能管理好自己的羡慕和妒忌的情感。3、能够听取并正确评价他人的观点。4、对日常事务具有足够的耐性和灵活性。5、你不可能永远都赢，接受这一事实，并从错误中学习，而不是怨天尤人。6、对正在考虑的问题，不要高估它的负面因素，而应寻找它的积极因素。7、做决定时，知道什么是理性，什么是冲动。8、要知道，无论多大的能力，多大的才华，都取代不了积极准备的作用。9、能管理好脾气，控制好怒气。10、了解别人的情绪，不让私心膨胀。11、知道什么是需要，什么是想要。12、自信大方，但不要趾高气扬。13、从容处理压力。14、对自己的行为负责，敢于担当。15、管理好自己的恐惧心理。16、能发现不同情形下正确与错误，是与非之间的共同之处。17、接受负面的反馈，将其视为自我提高的机会。18、保持危机感，关注自尊。19、能判断什么是真爱，什么是一时的迷恋。20、懂得开诚布公的交流是人际关系和谐发展的关键。总之，真正的成年人，必须做的事情，绝不推诿逃避；想做的事情，时机一到，绝不畏首畏尾。真正的成年人，头脑清醒，判断准确，并能对自己的时间和付出做有效的管理。说话诀窍号：shuohuajq（&&长按复制）?说话是一门学问，更是一门艺术。巧妙的掌握说话中的艺术，从关注@说话诀窍开始。教你做幸福女人微信号：zuoxinfunvren（&&长按复制）?女人，因智慧而美丽，因聪明而幸福。关注@教你做幸福女人，聪明的女人，幸福的选择！女人心计学微信号：xinjixue007（&&长按复制）?懂点心计，会点手段，做这样的女人挺好。关注@女人心计学，从今天起，做个幸福女人!教你扎头发微信号：jnztoufa（&&长按复制）?女人，发型对了，怎么穿都美！爱折腾头发就关注@教你扎头发！做漂亮女人！轻松瘦到90斤微信号：vvshoushen（&&长按复制）?平胸穷三代，腰粗毁一生。 脸大不是病，腿粗要人命。 赶紧减肥，赶紧瘦！学会读懂男人心微信号：ddnanrenxin（&&长按复制）?女人不狠，地位不稳。问世间情为何物，不过是一物降一物！关注@学会读懂男人心，教你轻松搞定他！教你变漂亮微信号：jnbpiaoliang（&&长按复制）?美丽，是你的责任！没有丑女人，只有懒女人！关注@教你变漂亮，每天漂亮一点点！ ~幸福更近一点点~穿衣搭配那点事微信号：aachuanyidapei（&&长按复制）?人靠衣装马靠鞍，再好的身材也靠穿！学点穿衣搭配！今天起，认识一个不一样的自己！教你做女神微信号：jiaonizuonvshen（&&长按复制）?你渴望拥有妲己的容颜么?你渴望妩媚漂亮么?你渴望拥有200%的回头率么?一周速变女神,穿衣打扮、瘦身美容我们手把手教您!↓↓↓点【阅读原文】查看更多精彩内容！
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解读社保费率下调的改革方向
中国新闻人民网&2016年03月21日 17:40
人民网北京3月21日电（唐述权 杨文全）“从全面长期来看，中国政府对中国公民保证养老金发放是没有问题的”，“老有所养不会、也绝不能是一句空话。”3月16日，国务院总理李克强在会见中外记者时，郑重做出“安民告示”。
李克强总理的“安民告示”，基于我国的“家底”：“我们去年养老保险收支结余3400多亿元，累计结余34000多亿元，我们还有全国的社会保障基金储备16000亿元没有动，同时还能够划拨国有资产来充实养老基金。”
李克强总理的“安民告示”，给全国老百姓吃下“定心丸”，给地方和企业刻下“定盘星”：“在国家规定的统一框架下，可以给地方更多的自主权，让他们根据当地的实际情况，阶段性地、适当地下调‘五险一金’的缴存比例是可以做的。”
当前，我国社会保险包括基本养老、医疗、失业、工伤、生育五大险种。下调社保费率，事关企业和个人减负，也事关社会保障工作的平稳运行。下调目的，按照李克强总理的话说，“总的是让企业多减轻一点负担，让职工多拿一点现金。”从长远考虑，是“增强人民群众获得感”。
“适当降低社会保险费率”，这是“十三五”规划中提出的明确方向。而这项改革早已开始“试水”。2015年，国务院常务会议分两次先后要求下调失业险费率，以及工伤险、生育险费率，社保“五险”费率由41%降低到39.25%，总降幅为1.75%。据测算，每年可为企业和职工减负670亿元左右。
未来5年适当降低社保费率的空间在哪里？
业内专家表示，目前39.25%社保费率中，养老保险和医保占36%左右，确实是今后降低费率的挖潜空间。
人社部社会保障研究所所长金维刚表示，“适时适当降低社会保险费率是中央提出的要求，也是广大企业的呼声，并且也列入政府的工作计划。但是，由于费率调整涉及因素较多，具体什么时候能降、能降多少，暂时还无法预计”。
降低后将如何化解支付压力？
近年来，我国人口老龄化程度持续加剧，各项社保待遇水平持续提高，社保基金收支平衡面临压力。据新华社“新华视点”报道，要降低社保费率，至少还要过三道难关。
一是全国统筹。目前我国社保基金以省级统筹为主，不能在全国范围内调剂，各地基金结余不均衡，地区间费率高低差异明显。有代表认为，加快社保全国统筹的进度，降低城乡、区域差别，有助于解决一些地方收支压力。
二是征缴扩面。较低社保费率，
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想买辆1500左右的山地车骑着玩&但不知道如何选择&那个品牌的性价比高啊&知道的说下&谢谢了
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