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A组人轮状病毒VP7和VP4基因型在全球的分布
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A组人轮状病毒VP7和VP4基因型在全球的分布
官方公共微信&&&&&大多数急性胃肠炎由病毒引起,病毒性胃肠炎病原体主要有以下几种,其分属不同病毒科,但其所致胃肠炎临床症状表现相似,主要为腹泻与呕吐,流行方式可分为5岁以内的小儿腹泻和与年龄无关的爆发流行两种。&　　胃肠炎是人类最常见的一种疾病，除细菌、寄生虫等病原体外，大多数胃肠炎由病毒引起。这些病毒分别属于四个不同的病毒科：的轮状病毒(rotavirus),杯状病毒科(Caliciviridae)的SRSV和‘经典’人类杯状病毒;腺病毒科的肠道腺病毒40、41、42和(Astroviridae)的星状病毒(astrovirus)。它们所致的胃肠炎临床表现相似，主要为腹泻与呕吐，但流行方式却明显分为两种：5岁以内的小儿腹泻和与年龄无关的暴发流行。　　轮状病毒　　轮状病毒是1973年澳大利亚学者Bishop等在急性非细菌性胃肠炎儿童十二指肠粘膜超薄切片中首次发现，是人类、哺乳动物和鸟类腹泻的重要病原体。
急性胃肠炎病毒 -
生物学性状
　　形态　　为大小不等的球形，直径60~80nm，双层衣壳，无包膜，负染后在电镜下观察，病毒外形呈车轮状，故名。　　基因组及其编码的蛋白质为双链RNA病毒，约18550bp，由11个基因片段组成。每个片段含一个架，分别编码6个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5个非结构蛋白(NSP1~NSP5)。VP6位于内衣壳，为组和亚组特异性抗原;VP4和VP7位于外衣壳，VP7为糖蛋白，是中和抗原，决定，VP4为病毒的血凝素，亦为重要的中和抗原。VP!~VP3位于核心。　　非结构蛋白为病毒酶或调节蛋白，在病毒复制中起主要作用。　　分型　　根据内衣壳VP6的抗原性，轮状病毒可分为7个组(A~G)。A组轮状病毒根据VP6又分为4个亚组(I、II、I+II、非I非II)。另外A组根据表面中和抗原VP7和VP4分14个G血清型(VP7为糖蛋白)和19个P血清型(VP4为蛋白)。　　抵抗力　　在粪便中存活数天到数周。耐乙醚、酸、碱和反复冻融，pH适应范围广(pH3.5~10)。在室温下相对稳定，55?C30分钟可被灭活.　
急性胃肠炎病毒 -
致病性和免疫性
　　轮状病毒呈世界性分布，A~C组轮状病毒能引起人类和动物腹泻，D~G组只引起动物腹泻。A组轮状病毒最为常见，主要流行的血清型为G1P8、G2P4、G3P8和G4P8，是引起6个月~2岁婴幼儿严重胃肠炎的主要病原体占病毒性胃肠炎的80%以上，是导致婴幼儿死亡的主要原因之一。年长儿童和成人常呈无症状感染。传染源是病人和无症状带毒者，病人每克粪便中排出的病毒体可达1010个，粪-口是主要的传播途径。病毒还可能通过呼吸道传播，从有呼吸道症状儿童的呼吸道分泌物中曾检出轮状病毒的存在，在动物中已证明气溶胶可传播病毒。温带地区晚秋和冬季是疾病发生的主要季节。　　病毒侵入人体后在小肠粘膜绒毛细胞内增殖，病毒基因产物VP4为主要致病因子，造成细胞溶解死亡，微绒毛萎缩、变短、脱落;腺窝细胞增生、分泌增多，导致严重腹泻，水和电解质的丧失。潜伏期为24~48小时，突然发病，发热、水样腹泻、呕吐和脱水，一般为自限性，可完全恢复。但当或已有脱水，若不及时治疗，是导致婴儿死亡的主要原因。　　B组病毒可在年长儿童和成人中产生暴发流行，但至今仅在我国有过报道。年，该组病毒在我国东北，西北矿区青壮年工人中引发了大规模霍乱样腹行，患者达数十万人。　　C组病毒对人的致病性类似A组，但发病率很低。　　感染后机体可产生型特异性抗体IgM和IgG，对同型病毒有保护作用，特别是肠道sIgA。对异型只有部分保护作用，细胞免疫亦有。
急性胃肠炎病毒 -
微生物学检查法
　　检测病毒或病毒抗原　　由于在腹泻高峰时，患者粪便中存在大量病毒颗粒，运用电镜、ELISA或乳胶凝集试验很容易检出病毒或其抗原。轮状病毒有特殊形态结构，应用直接电镜检查，其诊断率达90%~95%。直接或间接ELISA法检测轮状病毒，既可定量亦能进行G、P分型。　　分子生物学检测技术　　使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，根据A、B、C三组轮状病毒11个基因片段特殊分布图形进行分析判断，在临床诊断和流行病学调查中有重要意义，使用RT-PCR法不仅检测灵敏度高，利用引物设计技术还可进行G、P分型。
急性胃肠炎病毒 -
　　轮状病毒可在原代猴肾细胞传代MA104猴肾上皮细胞等中增殖，胰酶预处理病毒可加强其对细胞的感染性，但因病毒培养程序较复杂，非临床诊断常用方法。
急性胃肠炎病毒 -
　　主要是控制传染源，切断传播途径，严密消毒可能污染的物品。另外，洗手也很重要。治疗主要是及时输液，纠正电解质平衡等支持疗法，以减少婴儿的死亡率。特异性减毒活疫苗正在研究中。大多疫苗来自猴和牛轮状病毒，因它们与人轮状病毒有，但对人不致病，故可提供交叉保护，以减轻病情。利用基因重组含有人轮状病毒主要流行血清型的基因片段的疫苗正在进行人群试验，效果与自然感染获得的保护相似，可望获得批准应用。&
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保存二维码可印刷到宣传品猪轮状病毒VP7基因转化紫花苜蓿的研究--《吉林农业大学》2006年硕士论文
猪轮状病毒VP7基因转化紫花苜蓿的研究
【摘要】：苜蓿为豆科多年生草本植物，是世界上最优良最重要的豆科牧草。1972年，美国学者Saunders等首先从愈伤组织上获得了再生植株。随后，国内外学者也先后通过细胞和组织培养获得了再生植株，使这一领域的研究不断深入。苜蓿转基因在受体系统的建立，转化技术的研究和重要的农艺性状的遗传改良方面都取得重大进展。
用转基因植物生产疫苗新思路的提出，促成了转基因植物疫苗研究的兴起，使廉价疫苗的生产成为可能。转基因植物疫苗与常规疫苗和其他新技术疫苗相比，具有许多不可比拟的优势。转基因植物疫苗的研究已经证实异源的抗原蛋白能够在植物细胞中表达，而且植物表达的抗原蛋白能够引起动物和人的免疫反应。这说明利用植物生产疫苗是可行的。
本实验的研究目的是建立苜蓿组织培养高频再生体系，并将猪轮状病毒VP7基因转入紫花苜蓿中，得到稳定表达的转基因苜蓿，为建立VP7苜蓿反应器奠定基础。
本试验以公农一号、公农二号、紫花苜蓿、美国苜蓿王、草原一号5个品种成熟种子萌发的子叶及下胚轴为受体材料，用不同类型的培养基对其子叶及下胚轴进行诱导，研究以子叶及下胚轴为外植体诱导愈伤组织的几个重要影响因素。结果发现：最佳灭菌条件为70％酒精振荡3～5分钟，然后放入0.1％升汞振荡10分钟；苜蓿无菌苗的子叶和下胚轴均是诱导愈伤组织的理想外植体；不同的苜蓿品种均可诱导出愈伤组织，诱导率的高低主要取决于基因型、培养基种类、激素浓度等。对于不同基因型的苜蓿愈伤组织的诱导而言，改良的SH培养基诱导效果优于MS培养基，B_5培养基诱导效果较差，其中改良的SH培养基的胚性愈伤诱导率最高，并且愈伤组织表现良好的胚性；对于不同基因型苜蓿2，4-D浓度为2mg/l时胚性愈伤组织诱导率均较高；同时实验还证明，在以蔗糖为诱导培养基碳源时，不同苜蓿基因型间基本无差异，均以30g/l蔗糖作碳源时诱导效果较好，继代时蔗糖浓度采用30g/l较适宜；且胚性愈伤组织状态较好，适合于长期继代。苜蓿愈伤组织分化培养基为：NAA1.0 mg/L+KT1.0mg/L，分化率达85.1％；生根时蔗糖浓度采用10g/l较适宜。本试验建立了苜蓿的遗传转化受体系统，摸索出不同苜蓿品种愈伤组织诱导、继代、植株分化以及生根的有效方法，为苜蓿的遗传转化打下了坚实的基础。
利用农杆菌介导法将VP7基因导入公农一号中，研究农杆菌转化系统的条件，对不同类型的菌株、不同的侵染时间、不同的菌液的浓度以及不同的预培养、共培养时间等条件进行探讨。结果表明，苜蓿愈伤组织对Kanamycin的敏感浓度为50mg/L；
【关键词】：
【学位授予单位】：吉林农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2006【分类号】：S541.9;S852.65【目录】：
Abstract7-9
一.苜蓿组织培养研究进展9-10
二.苜蓿遗传转化研究进展10-14
1.苜蓿遗传转化方法10-11
2.苜蓿转基因进展11-14
三.转基因植物疫苗的研究进展14-21
1.转基因植物疫苗14-15
2.研究中的转基因植物可食疫苗15-20
3.目前可食疫苗研究的问题和前景20-21
四.本项研究的目的和意义21-23
第一部分 苜蓿高频再生体系的建立23-33
1.1 实验材料和方法23-24
1.1.1 实验材料23
1.1.2 实验方法23-24
1.2 结果与分析24-31
1.2.1 愈伤组织诱导24-27
1.2.2 苜蓿植株分化27-29
1.2.3 苜蓿苗的生根29-30
1.2.4 再生苗的移栽30-31
1.3 讨论31-33
第二部分 苜蓿遗传转化的研究33-48
2.1 材料和方法33-40
2.1.1 实验材料33
2.1.2 质粒和菌株33
2.1.3 苜蓿愈伤组织对Kanamycin的敏感性试验33
2.1.4 农杆菌介导法转化苜蓿愈伤组织33-34
2.1.5 转基因植株的检测34-40
2.2 结果与分析40-47
2.2.1 农杆菌转化研究40-44
2.2.2 抗性愈伤组织的分化、出苗44
2.2.3 转基因植株的分子检测44-47
2.3 讨论47-48
第三部分 结论48-49
参考文献49-55
作者简介62
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轮状病毒与感染
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轮状病毒(rotavirus)由Bishop等于1973年首次在急性非细菌性胃肠炎儿童十二指肠粘膜超薄切片中发现，是人类、哺乳动物和鸟类腹泻的重要病原体。轮状病毒归属呼肠病毒科轮状病毒属。
一、生物学性状
（一）形态与结构
成熟病毒颗粒呈球形，二十面体立体对称，无包膜，直径60～80nm。负染后在电镜下观察，病毒呈光滑车轮状，有两种形态：双壳颗粒为成熟病毒颗粒，有外层多肽衣壳，有传染性；双壳颗粒在自然条件下失去外层衣壳形成粗糙单壳颗粒，无传染性。
（二）基因组特征
基因组为节段性双链RNA病毒，全长约18 550 bp，由11个基因片段组成。每个片段含一个开放读码框架，分别编码6个结构蛋白（VP1～VP4，VP6～VP7）和5个非结构蛋白（NSP1～NSP5）。VP1～VP3位于核心，分别为病毒聚合酶、转录酶和帽相关蛋白。VP6位于内衣壳，为群特异性抗原。VP4和VP7位于外衣壳，为型特异性抗原；其中VP4组成外衣壳的刺突，为病毒血凝素，也是中和抗原；VP7为糖蛋白，为中和抗原。非结构蛋白为病毒酶或调节蛋白，在病毒复制中起重要作用；其中NSP4是一个穿膜糖蛋白，最近发现它可能是一种病毒肠毒素。
根据VP6的抗原性，轮状病毒可分为A～G 7个血清群。人类的轮状病毒只有A、B、C三个血清群。A群主要感染人类，婴幼儿为主要感染对象。B、C群可同时感染人类和动物，其中B群感染人类时，成人为主要感染对象；C群感染人类仅个别发现，青少年为主要感染对象。其他血清群主要感染动物。
根据VP4和VP7的抗原性，同一血清群的轮状病毒可再分为若干个血清型。目前只有A群的血清型被描述。轮状病毒的血清型称为P/G血清型，因为VP4被蛋白酶（protease）裂解，VP7被糖基化（glycosylation）。目前世界上88.5%的轮状病毒由P8G1、P4G2、P8G3、P8G4等4个血清型引起。
（三）病毒的复制
呼肠病毒科的不同病毒属入胞和出胞的方式不完全相同。呼肠病毒在细胞浆中复制，复制时不完全脱去衣壳，其原因是衣壳有抵抗蛋白酶消化的作用，藉此，呼肠病毒可防止受染细胞的完全破坏。翻译时以dsRNA 中的负链为模板，利用颗粒相关转录酶（particle-associated transcriptase）合成mRNA。节段性基因组允许重排。
根据猴肾细胞的连续培养，轮状病毒藉其外衣壳血凝素蛋白VP4与唾液酸受体结合而感染细胞。胰蛋白酶裂解VP4使病毒体进入细胞浆；外衣壳糖蛋白VP7保留在细胞的粗面内质网上。病毒复制开始时，只有部分基因被转录，其他基因被转录发生在早期病毒蛋白合成之后。轮状病毒前体芽出进入粗面内质网的扁囊，获得临时包膜；然后临时包膜被移除，在VP7的作用下组装成完整的外衣壳。在感染后6～7小时，内涵体形成。轮状病毒在猴肾细胞内的最大产量发生在感染后约为10～12小时。轮状病毒通过细胞溶解而释出。
（四）抵抗力
轮状病毒在室温下相对稳定，在环境表面能够存活数日，在粪便中数周。PH适应范围广（pH3.5～10），不易被胃酸和胆汁灭活。耐乙醚、酸、碱和反复冻融。
对热敏感，55℃ 30分钟可被灭活。
二、致病性
（一）致病机制
在组织培养时，轮状病毒有非常广泛的易感细胞系；动物研究显示，轮状病毒感染回肠有微绒毛的成熟肠上皮细胞；通过连接成熟肠上皮细胞微绒毛顶端而感染。轮状病毒在经口摄入后直接感染小肠，其感染部位主要在十二指肠和2/3近端回肠。
有三个机制参与轮状病毒感染性。首先是消化-吸收型绒毛上皮细胞的脱落。绒毛上皮细胞的脱落一方面引起肠道的吸收容量减少，导致液体和电解质吸收障碍；另一方面引起消化酶如蔗糖酶和异麦芽糖酶的表达减少，导致肠腔食糖积聚和渗透压升高。其次是病毒性肠毒素NSP4活性的增加。动物实验指出，NSP4通过启动细胞信号和钙动员而诱导剂量和年龄依赖的分泌型腹泻；NSP4诱导分泌型腹泻似乎发生在感染早期，先于炎症和细胞损伤。最后是肠道植物神经系统的兴奋，植物神经系统具有促进肠道分泌的功能，在腹泻的维持中起一定作用。
（二）流行病学
患病和隐性感染的人和动物为主要传染源。感染轮状病毒的动物品种繁多，包括猪、马、牛、羊、鼠、猴、犬、鹿等。最常见的传播方式是粪-口途径，较常见的传播方式是人-人传播。轮状病毒常通过污染物品如玩具和台面而传播，可通过污染水体而造成爆发流行。轮状病毒也可通过飞沫传播。
轮状病毒性胃为世界性传染病，是发展中国家婴幼儿腹泻最常见的原因，也是发达国家婴幼儿腹泻住院的主要原因。轮状病毒性胃肠炎在热带地区无明显的季节高峰；在亚热带和温带地区多流行于干燥和寒冷季节，流行多发生在11月～4月，流行高峰多在11月～12月。轮状病毒性胃肠炎具有年龄依赖性，多发生在4～24月龄的儿童，几乎所有儿童在5岁以前经历过至少一次轮状病毒感染。成年流行非常少见。
（三）所致
轮状病毒是婴幼儿腹泻的主要原因。潜伏期通常为1～2天。症状期通常持续3～8天。
疾病谱从隐性感染到严重脱水。约50%的轮状病毒感染无明显不适。显性感染的特点为，起病急，先出现发热和呕吐，随后出现喷射性水样腹泻。腹泻频度每日10次左右。显性感染的严重度，轻度、中度和重度分别占62%、35%和3%；约7%的患儿需要住院。
需要指出的是，一些罕见报道打破了轮状病毒只感染肠道的惯性思维。1984年已经有轮状病毒感染相关的无菌性和无菌性脑病的报道。迄今已经报道的20例轮状病毒感染相关的脑膜炎或脑病分别有15例完全恢复、3例有神经并发症、2例死亡。除神经系统外，轮状病毒感染血液与其他系统和器官也有报道。
三、免疫性
轮状病毒感染后产生系统或局部免疫，包括型特异性抗体IgM、IgG和sIgA和细胞免疫，对同型病毒有保护作用，其中肠道型特异性sIgA最为重要，血清型特异性IgG可长期存在。
轮状病毒感染后产生的型特异性体液免疫和细胞免疫对异型病毒只有部分保护作用，因此轮状病毒可多次感染。但是，轮状病毒首次感染不仅可减少再次感染的可能性，而且能减轻再次感染的严重性。
四、实验室检查
（一） 病毒分离与鉴定
电镜是鉴定轮状病毒的金标准，腹泻高峰时，取粪便标本应用电镜检查，其灵敏度达90%~95%。
快速试验包括酶免疫法和乳胶凝集法，能够鉴定所有A群轮状病毒常见的群抗原VP6；酶免疫法有超过95%的灵敏度和99%的特异度，乳胶凝集法的灵敏度和特异度相对较低。轮状病毒株的血清型可通过特异性单克隆抗测，常用放射免疫法或间接ELISA法，既可定量亦能进行G、P分型。轮状病毒株的血清型主要用于流行病学调查。
虽然轮状病毒能够在原代猴肾细胞、传代MA104猴肾上皮细胞等中增殖，胰酶预处理病毒可加强其对细胞的感染性，但因病毒培养困难，程序复杂，仅限于专业化的实验室。
（二） 血清学试验
轮状病毒感染后5天，血清可检测出特异性IgM抗体，有一定的诊断价值。
（三）分子生物学检查
轮状病毒株的电泳型（Electropherotype）可通过RNA电泳（进入11个不同的条带）来确定。轮状病毒株的电泳型主要用于流行病学调查。
需要指出的是，对轮状病毒感染作出特异性诊断并不能改变治疗方案，因此，临床实践通常不需要特异的实验室检查。
五、诊断和鉴别诊断
轮状病毒性胃肠炎不能仅根据临床表现作出正确诊断，因为其临床症状和体征与其他致病因子所致胃肠炎的症状和体征不可鉴别。但是，加上轮状病毒感染在温和气候和易感年龄，通常可以作出轮状病毒感染的诊断。
轮状病毒性胃肠炎与细菌性、真菌性和原虫性腹泻鉴别比较较易；与其他病毒性胃肠炎的鉴别较难，需要特异性实验室检查。
六、防治原则
（一）预防
采取以切断传播途径为主的综合性预防原则。减少水体和食品污染、做好隔离消毒工作为最重要的措施。口服含各型轮状病毒的减毒疫苗可刺激肠道局部产生IgA抗体，为目前最为有效的预防措施。
（二）治疗轮状病毒性胃肠炎为自限性疾病，多数患者预后良好；婴幼儿患者病情较重，需要及时治疗。目前尚无特效的治疗药物。支持和对症治疗，即补充丢失的液体和电解质，预防和治疗脱水和电解质紊乱仍是轮状病毒性胃肠炎的主要治疗。
发表于： 20:26
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