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铜绿假单胞菌检测
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食坛骨干, 积分 12352, 距离下一级还需 5648 积分
如何进行铜绿假单胞菌的检测,盼高手支招!
[ 本帖最后由 首席大弟子 于
11:53 编辑 ]
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参照化妆品检测吧
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独沐秋风，看枫红落英
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我晕，为什么总有这样的问题，也不说清楚想问什么，就弄个一句话的大标题往这儿一搁。
多谢指出,是我的错
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我晕，为什么总有这样的问题，也不说清楚想问什么，就弄个一句话的大标题往这儿一搁。
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首席大弟子 金币 +1 多谢指出,是我的错
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我不是说你，是说楼主。
本来回帖的时候还想夸你脾气真好，这样不明确的提问也能耐心回答
嘻嘻，因为我看她是新手啊
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看来是我太缺乏耐心了
生活如此美好，我却如此暴躁，这样不好，不好。。。。。。
不,你这样挺好,更能显出我的美好,哈哈
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那我也要管理一下我的形象
－－－－－－－－－－－－－－－－－－
不知道楼主要做的是什么样品，关于铜绿假单胞的检测标准，我知道的有三个，一个是大弟子说的那个化妆品标准，还有一个是美国药典微生物限度检测里面有关于铜绿假单胞的（USP&61&），另外就是新的饮用天然矿泉水标准里新加了铜绿假单胞的指标，检测方法说见GB/T ，在论坛里面就有可以下载，我还没有看，你可以搜索一下。
嘻嘻,其实你的形象是很不错滴拉
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楼上说得很好。
我们国家标准中间还有一个“进出口瓶装水中铜绿假单胞军的检验方法”。
你也可以参考使用。
哈哈,来了个形象更不错的了
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哇，野兽老师来了！那个标准我找找看。。。。。。
广州的培训班您会去么？我要去见您真人啊
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广州的培训班？
等到具体日程确定了，
我会考虑参加。
你想看见真人？
你好像也知道什么叫做“见面不如闻名”……
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回复 10# 野兽 的帖子
马老师对自己没自信啊
俺对你有信心，去吧。
独沐秋风，看枫红落英
(矿山从业人员)
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GB/T 里也有铜绿假单孢菌的检测方法。
没有垃圾食品，只有不良的饮食习惯。
WAR IS PEACE/FREEDOM IS SLAVERY/IGNORANCE IS STRENGTH
战争即和平，自由即奴役，无知即力量。
食坛骨干勋章
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食品论坛特约评论员
食坛传奇勋章
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特邀主讲人
特邀主讲人
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2009年度魅力人物
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食坛大师勋章
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Powered by《中国药典》2015版中药制剂微生物限度检查方法的比较及问题分析
广西省桂林三金药业股份有限公司&&广西&&桂林&&541004
摘要：《中国药典》2015版非无菌产品微生物限度检查中，一般采用常规法、稀释法、中和法、薄膜过滤法以及几种方法的联合使用。关于检查方法的综合比较文献较少，本文就中药制剂微生物限度检查的几种方法进行探讨，并就新药典应用中遇到的问题进行分析，旨在为新药典在实际检验工作运用中提供参考。
关键词：微生物限度检查；《中国药典》2015版；方法比较；方法适用性试验
中药制剂是我国独一无二的瑰宝，其成分、生产工艺复杂，其微生物限度检查存在这几方面的问题：一其通常含有抑菌成分，如黄芩、大黄等；二其污染菌种类复杂、污染源多样、污染风险大；三其炮制方法多样，通常不易制备成是均匀的供试液。故中药制剂微生物限度检查方法必须经过方法适用性试验，选择合理、合适的方法。
笔者经查阅资料发现，对中药制剂非无菌产品微生物限度检查方法综合比较的文献很少，故根据多年微生物限度检查方法验证、方法适用性试验的工作经历对《中国药典》2015版微生物限度检查方法进行探讨，讨论内容包括微生物计数法以及控制菌检查法中的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌检查法。
1 微生物计数法
计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。
1.1 平皿法
1.1.1 常规法：直接吸取1ml分散均匀的1:10或1:1（原液）供试液注皿。
1.1.2&稀释液稀释法：以稀释液稀释供试液。稀释度一般不大于该产品质量标准的数量级。
1.1.3&培养基稀释法：将供试液分注多个无菌平皿，或采用大直径平皿。以增加培养基量达到稀释减弱供试液抑菌作用的目的。
1.1.4 中和法：中和剂或灭活剂种类应根据中药制剂抑菌成分选择。采用此法须确认中和剂或灭活剂有效性和对微生物无毒性。
1.2 薄膜过滤法：此法适用于能制备成完全溶解的供试品溶液的中药制剂的检查。
1.3 &MPN法：中药制剂污染源广，污染量大小不能确定，不建议使用此法。
表1 &计数方法的比较
薄膜过滤法
稀释液稀释法
培养基稀释法
操作简便，节省人力、物力、时间成本
消除供试品抑菌作用较为方便，平皿、培养基、培养空间相对少
供试液制备简单，稀释度低，计数结果具有代表性
合适的中和剂或灭活剂，可以减弱或消除抑菌作用
直接、彻底消除抑菌作用，计数结果精确度、准确度高
对于某些微生物污染量很小的供试品，MP可能更合适
供试液制备繁琐，稀释度越高，计数结果随机性越大，不能满足限度质量标准要求；不能彻底消除抑菌作用
对供试液分配精度要求高，且皿内液体量少、蒸发；使用大直径平皿则对培养空间要求大；不能彻底消除抑菌作用
抑菌成分不明确、多样化的中药制剂，其中和剂或灭活剂的选择存在较大难度；难以彻底消除抑菌作用
操作繁琐；对实验环境要求高；不适用于非完全溶解的供试品
精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法；不适用于霉菌计数
2 控制菌检查法
适用性试验一般只需对药典中规定&经方法适用性试验确定&的步骤进行试验。
2.1 常规法：沙门菌检查时，胰酪大豆胨胨液体培养基（TSB）一般为200ml，以免供试品不能完全分散；耐胆盐革兰阴性菌检查时，肠道菌增菌液体培养基一般为10ml；其余项目检查时，TSB一般为100ml。
2.2 稀释法：在常规法基础上增加增菌液体积，以达减弱抑菌作用的目的。
2.3 薄膜过滤法：取规定量供试液，薄膜过滤，取滤膜放入TSB中，依规定检查。此法一般不用于耐胆盐革兰阴性菌检查。
2.4 中和法：选择合适的中和剂或灭活剂适量，加入稀释液中灭菌，用于制备供试液，或在增菌液中加入适宜的中和剂，依常规法检查。
表2 &控制菌检查方法的的比较
薄膜过滤法
操作简便，节省人力、物力、时间成本
供试液制备简单，操作上比较节省时间成本
对抑菌作用的消除较为直接、彻底，精确度、准确度较高
消除抑菌作用更简便
所用培养基量大，并相应增加了培养空间；不能彻底消除抑菌作用
操作繁琐，且对实验环境要求高；不适用于非完全溶解的供试品
抑菌成分不明确、多样化的中药制剂，其中和剂或灭活剂的选择存在较大难度；不能彻底消除抑菌作用
3.1 中药产品成分复杂，微生物限度检查时，往往需要几种方法的联合使用。综合各方面考虑，检验方法选择优势如下：常规法＞稀释法＞中和法＞薄膜过滤法＞几种方法的联合使用。
3.2 笔者实验室通过多次试验，进行方法适用性试验时，以下几点应该特别考虑。首先，耐胆盐革兰阴性菌TSB预培养增菌时，加入试验菌预培养约2小时后，试验菌大量繁殖或受抑制或死亡，经查阅文献发现已有关于此问题的讨论。试验菌非受损菌体，故可与预培养后的供试液同时接种至肠道菌增菌液体培养基。其次，供试液制备时，若TSB作为稀释液，若不能及时检验，供试液中的微生物会繁殖，影响检验结果准确性，在适用性试验中尤为明显。
3.3 目标菌挑战试验：可以根据企业情况，方法适用性试验时，增设目标菌挑战试验，目标菌即从被污染产品中分离保存的菌种。中药制剂一般会存在特定的易污染菌种，如芽孢。增加目标菌的挑战试验，具有重要的统计学意义，更客观评价检验方法对该产品的适用性，对生产可能被污染的环节进一步指导。
参考文献：
[1]《中国药典》2015版第四部.
[2]王威，丁莉，凌真. 对具有抑菌作用中药制剂微生物限度检查污染菌回收验证方法的探讨.&第九届江苏省药师周论文集.～238.
[3]刘洪祥，曹晓云．《美国药典》35版附录&&62&非无菌产品微生物检查：控制菌检查法&中两个问题的探讨．天津药学.）：9～12.
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& & & & & &王丽 & 刘艳春 &袁丹丹 &邹颜平 熊梅
& & & & & & 张烨 &江玲 &童成云 丁巧玲 &王志美
& & & & & & 郭欢 &吴康 & &白营 & & &谢永桃 & 李建华
& & & & & & 程玲 & 聂伟 &刘素梅 & 庹长平 & 舒太娟
& & & & & & 李阳 &刘彩杰 屈美玲 &陈泽宣 &赵联盟&
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24小时开机：/&2015版药典微生物限度检查法
上一条：总局公布2015年第三期食品安全监督抽检情况
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试剂名称：2015药典微生物培养基
英文名称：
国产/进口：国产
产地/品牌：北京/陆桥，广东/环凯
参考报价：100
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产品类别：
中国药典培养基系列产品（2015版）
品种包括用于：
无菌检查法；
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
抑菌剂效力检查法
抗生素微生物检定法
监测菌：大肠埃希氏菌、耐胆盐革兰氏阴性菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、
梭菌、白色念珠菌等
1、无菌检查法
产品说明及用途
胰酪大豆胨液体培养基（颗粒剂型)
用于药品的无菌检查
硫乙醇酸盐流体培养基（颗粒剂型）
用于药品的无菌检查
0.5%葡萄糖肉汤培养基（颗粒剂型）
用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检验
胰酪大豆胨琼脂培养基（颗粒剂型）
用于药品的无菌检查
沙氏葡萄糖液体培养基（颗粒剂型）
用于药品的无菌检查
沙氏葡萄糖琼脂培养基（颗粒剂型）
用于药品的无菌检查
PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（颗粒剂型）
用于药品检验的稀释液
0.1%蛋白胨水溶液（颗粒剂型）
用于药品检验的稀释液
2、非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
产品说明及用途
胰酪大豆胨琼脂培养基（颗粒剂型）
用于一般细菌的纯培养及需氧菌总数测定
胰酪大豆胨液体培养基（颗粒剂型)
用于药品中一般细菌的纯培养和MPN法计数
马铃薯葡萄糖琼脂
用于药品中霉菌的纯培养
沙氏葡萄糖琼脂培养基（颗粒剂型）
用于药品中霉菌酵母菌的计数和纯培养
沙氏葡萄糖液体培养基（颗粒剂型）
用于药品中白色念珠菌的增菌培养
玫瑰红钠琼脂培养基（颗粒剂型）
用于药品中霉菌酵母菌的计数
PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（颗粒剂型）
用于药品检验的稀释液
R2A琼脂培养基（颗粒剂型）
用于药品中纯化水、注射用水的微生物计数
3、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
（1）大肠埃希菌
产品说明及用途
胰酪大豆胨液体培养基（颗粒剂型)
用于大肠埃希菌的前增菌
麦康凯琼脂培养基（颗粒剂型）
用于大肠埃希菌的选择性分离培养
麦康凯液体培养基（颗粒剂型）
用于大肠埃希菌的选择性增菌培养
（2）耐胆盐革兰阴性菌
胰酪大豆胨液体培养基（颗粒剂型)
用于耐胆盐革兰阴性菌的增菌培养
肠道菌增菌液体培养基（颗粒剂型）
用于耐胆盐革兰阴性菌的增菌培养
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（颗粒剂型）
用于耐胆盐革兰阴性菌的选择性分离培养
（3）沙门菌
三糖铁琼脂培养基
用于沙门菌的生化鉴定
胰酪大豆胨液体培养基（颗粒剂型)
用于沙门菌的增菌培养
RV沙门菌增菌液体培养基（颗粒剂型）
用于沙门菌的选择性增菌培养
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
用于沙门菌的选择性分离培养
（4）铜绿假单胞菌
氧化酶试剂
0.5mL&20支
氧化酶试验
氧化酶试纸
氧化酶试验
胰酪大豆胨液体培养基（颗粒剂型)
用于铜绿假单胞菌增菌培养
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基基础（颗粒剂型）
用于铜绿假单胞菌的选择性分离培养
（5）金黄色葡萄球菌
胰酪大豆胨液体培养基（颗粒剂型）
用于金黄色葡萄球菌的增菌培养
甘露醇氯化钠琼脂培养基（颗粒剂型）
用于金黄色葡萄球菌的选择分离培养
梭菌增菌培养基（颗粒剂型）
用于梭菌的增菌培养
哥伦比亚琼脂培养基（颗粒剂型）
用于梭菌的选择性分离培养和鉴定
3%过氧化氢
用于梭菌的鉴定
（7）白色念珠菌
白色念珠菌显色培养基
用于白色念珠菌的选择性分离培养
沙氏葡萄糖液体培养基（颗粒剂型)
用于白色念珠菌的增菌培养
沙氏葡萄糖琼脂培养基（颗粒剂型）
用于白色念珠菌的选择性分离培养
4、抑菌剂效力检查法
胰酪大豆胨液体培养基（颗粒剂型）
用于细菌的纯培养
胰酪大豆胨琼脂培养基（颗粒剂型）
用于细菌的纯培养
沙氏葡萄糖液体培养基（颗粒剂型)
用于白色念珠菌的增菌培养
沙氏葡萄糖琼脂培养基（颗粒剂型）
用于真菌的培养
欧洲药典（EP）培养基系列产品
硫乙醇酸盐流体培养基（颗粒剂型）
胰酪大豆胨琼脂培养基（颗粒剂型）
胰酪大豆胨琼脂培养基（颗粒剂型）
胰酪大豆胨液体培养基（颗粒剂型)
沙氏葡萄糖琼脂培养基（颗粒剂型）
沙氏葡萄糖液体培养基（颗粒剂型)
马铃薯葡萄糖琼脂培养基
PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（颗粒剂型）
肠道菌增菌液体培养基（颗粒剂型）
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（颗粒剂型）
麦康凯液体培养基（颗粒剂型）
麦康凯琼脂培养基（颗粒剂型）
RV沙门菌增菌液体培养基（颗粒剂型）
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基基础（颗粒剂型）
甘露醇氯化钠琼脂培养基（颗粒剂型）
梭菌增菌培养基（颗粒剂型）
哥伦比亚琼脂培养基（颗粒剂型）
缓冲蛋白胨水（颗粒剂型）
抗生素检定培养基1号（pH7.9&0.1）（颗粒剂型）
R2A琼脂培养基（颗粒剂型）
用于纯化水中菌落总数的测定
美国药典（USP）培养基系列产品
胰酪大豆胨液体培养基（颗粒剂型)
硫乙醇酸盐流体培养基（颗粒剂型）
胰酪大豆胨琼脂培养基（颗粒剂型）
沙氏葡萄糖液体培养基（颗粒剂型)
沙氏葡萄糖琼脂培养基（颗粒剂型）
马铃薯葡萄糖琼脂培养基
PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（颗粒剂型）
肠道菌增菌液体培养基（颗粒剂型）
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（颗粒剂型）
麦康凯琼脂培养基（颗粒剂型）
麦康凯液体培养基（颗粒剂型）
RV沙门菌增菌液体培养基（颗粒剂型）
伊红美蓝琼脂（颗粒剂型）
亚硒酸盐胱氨酸增菌液
四硫磺酸钠亮绿培养基基础
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
三糖铁琼脂培养基
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基基础（颗粒剂型）
酪胨-卵磷脂-吐温20液体培养基
甘露醇氯化钠琼脂培养基（颗粒剂型）
Baird-Parker琼脂基础
Vogel-Johnson琼脂基础
梭菌增菌培养基（颗粒剂型）
哥伦比亚琼脂培养基（颗粒剂型）
厦门敏测实验器材有限公司成立于风景如画的海滨城市――厦门，是一家服务于实验室行业的专业供应商，主营食品安全检测、医药、微生物、检验检疫、水质环境等领域仪器设备和试剂耗材，代理陆桥环凯等众多知名品牌产品，包括微生物培养基及实验室仪器耗材，为食品企业、医药企业、质检商检及第三方检测机构、科研院校等单位提供选型、采购、安装调试、技术培训和售后支持等服务。公司紧邻集美大桥，交通便利，立足厦门，辐射厦漳泉闽南三角地区，服务八闽及华东地区。公司本着“诚信为本，质量保证，合作共赢，共同发展”的原则，以“保障食品药品安全，关爱公众生命健康”为目标，为客户提供优质的产品和服务。
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中国生物器材网 电话：021-导读：1.目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，2.适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试，4.1非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数，当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，适用于活菌制剂的检查，本检查法可采用替代的微生物检查法，等效于药典规定的检查方
1. 目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，
确保检验结果准确。
2. 适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试
3. 责任者：QC检验员、QC经理。
4.1 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
4.1.1 简述
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，
应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不
适用于活菌制剂的检查。
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法
等效于药典规定的检查方法。
微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区
域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影
响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或
灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中
和剂或灭活剂的相容性。
第 1 页 共 27 页
4.1.2 计数方法
计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，
简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小
的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。
供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，
所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试
品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。
4.1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验
供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该
产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试
表1 试验菌液的制备和使用
第 2 页 共 27 页
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查
方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。
4.1.4 菌种及菌液制备
菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为
第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。计
数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
菌液制备 按表1 规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、
枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%
无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml 含
0.05％聚山梨酯80 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢
子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％聚山梨酯80
的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢
菌液制备后若在室温下放Z，应在2 小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时
内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
第 3 页 共 27 页
4.1.5 阴性对照
为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
4.1.6 培养基适用性检查
微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
按表 1 规定，接种不大于100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，Z表1 规定条件下培养。
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。
4.1.7 计数方法适用性试验
⒈供试液制备
根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1 小时。
常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。
⑴ 水溶性供试品 取供试品，用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10 供试液。
若需要，调节供试液pH 值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
⑵ 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10 供试液。分散力较差的供试品，可在稀释剂中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH 值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10 倍系列稀释。
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