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测定微生物数量的一种方法
先感谢生产第一线的人们，因为是他们日积月累真实的情况记录，才有我文章中所使用的基本数据。我仅是穿针引线吧了。
1，适用范围，微生物生长繁殖过程存在有培养液稀稠度变化者。
2，用具：一根内径适合、一定长度的玻璃管，一个秒表。
3， 微生物数量以直读法，以粘度（秒）表述。
4，特点：用样量少、测定用时短、出结果快、避免温度、空气影响的干扰、仪器简单、比测定固体量法灵敏度高。
5，由此测定知道影响生物量变化的因素，现知有如下一些。：
培养基组分
原材料质量
移种系统粘度状况
6，粘度合适变化曲线与抗生素合成有一定相关。发酵罐前期控制尤为重要。
日 10:13:34
&&&图示：正在测定链霉素培养液粘度操作(拍摄)。
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粘度测定在链霉素中应用的一些探讨
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李烈铭 （ ）
在链霉素发酵使用的摇瓶种子，在结束培养时，用手摇动瓶子，使培养液铺在瓶内壁，然后，目测培养液在瓶壁向下滑落速度，视快慢程度，即稀稠度。以此作为选择种子的一个外观依据。但每个人之间及一个人在不同时间是难于掌握着同一标准，而且在记录上也没留下其差别的程度。为此，必须寻找一个较为客观捡测的方法。这个方法，必须满足以下要求：
①& 测定培养液用量要小，不大于5
&测样品为固体悬浮物，其培养基中原料（如黄豆餠粉颗粒）颗粒最大直径不能（如堵塞）影响测定；
&&&&③&
测定用时不能过长。
以上几个要求，对目前测定液体粘度的仪器均不能满足，不是需样量过多，加之耗时过长，易使菌体在非正常环境下，产生变化；不就是流过管径过细，造成堵塞。
据此，我们按上述要求，选择以一定内径（&#---3.0mm）和一定长度（600mm）的玻璃管加一个秒表构成测定仪器。其稀稠度（粘度）表示方法采用直读法，就是记取所测样品在此管内垂直自由下落一定距离的时间。用时长者在概念上表示稠，反之表示稀。实践证明，由于用量少，耗时短，使用同一仪器，结果有记录，可以客观比较。所以这种观测手段是有效、可行的。不但对摇瓶种子小样本可测定，同样运用到生产运转罐大样本上进行测定。
用这种方法始于1960年初，今天仍保持这方面观测。这种方法所得数值（时间）说明了什么呢？在我们所观测范围，它表示着：一，培养液内菌体数量；二，以及相关的菌体网状结构。即反映此部分固形物变化状况。在间隔取样观测，就可以了解培养生产过程变化的面貌，可成为一项指标。通过它去确定及寻找影响生长变化的因素，从而加以控制，实现过程的正常。
我们利用上述粘度的测定方法，研究了一些相关情况，现整理提供讨论研究。
一，& 粘度与固体量及菌丝网状结构关系
固体量是取一定量样品，经在4000转/分离心机，离心5分钟后，用所得固体物占样品体积部分的百分数表示。菌体结构通过用显微镜观察菌体的网状状况。
周期(小时)
网状不明显,有自溶现象
网状不明显,有自溶现象
菌体长，网状密
菌体长，网状密
上述结果反映粘度之差别与固体物量差别不成一定比例，但在一定固体物数量范围内则与其菌体网状结构密切相关，因而粘度值更具有反映菌体结构特征的一个指标。也就是粘度由小变大时，可了解到菌体长而多，反之，则预示着菌丝体的解体自溶。
培养基组份对生长过程的影响
我们采用摇瓶培养试验方法，观察了无机磷、硫酸铵、硫酸镁等不同量以及黄豆餠粉不同处理对菌体的生长过程变化的影响。
⒈& 无机磷、硫酸铵、硫酸镁不同量对生长过程变化的影响。
以往的研究，对组分不同配比仅注意抗生素合成这一方面的影响，而较少注意由此影响到菌体生长繁殖过程的情况。
现利用粘度测定方法，观察了这些组分不同而引起生长过程的变化。见表一。从结果可知，导致链霉素合成不同，首先是影响了菌体的生长状态。
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表一& 培养基组分不同与培养液粘度变化
组分↓ 时间→
硫酸镁0.02%
硫酸镁0.04%
硫酸镁0.06%
无机磷的缺乏是不利于菌体的繁殖生长，；反之，无机磷的过多，促使菌体的过速繁殖，及过早的迅速解体。
②& 硫酸铵的过量却是菌体旺长，而长期处在年轻状况。
③& 硫酸镁对合成链霉素的作用，表现促进菌体的生长繁殖，并推迟衰老解体的到来。
注：培养基配比
对照组——黄豆餠粉3%、葡萄糖4%、硫酸铵0.6%、磷酸二氢钾0.05%、氯化钠0.25%、碳酸钙0.6%，装量80ml/750ml,摇瓶，纱布六层。
无磷组——即不加磷酸二氢钾；
高磷组——磷酸二氢钾 0.1%；
低氮组——硫酸铵 0.3%；
高氮组——硫酸铵 1.0%。余均同对照组。
⒉& 黄豆餠粉加工不同对生长的影响
用冷榨黄豆餠粉干热至粉呈浅黄色，并散发出香气，嚼之无生豆味，此为高温处理者，与未处理者进行了对比试验。采取不同配比组合成总量为4%黄豆餠粉培养基。
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两种餠粉组合表
冷榨黄豆餠粉 %
高温处理餠粉 %
由于黄豆餠粉的处理条件不一，对生长过程的影响见表二。这个结果说明，经高温处理的黄豆餠粉有利菌体的迅速繁殖、生长，且维持较长的生命期，由此带来较高合成链霉素的能力。可以推想，经高温处理之黄豆餠粉是处在被缓慢的分解过程，过程的结果没有不利于菌体生长的条件，如过高的PH
表二 黄豆餠粉加工不同与培养液粘度变化
粘度（秒）
组别 ↓ 时间→
三，黄豆餠粉质量与菌丝液粘度
摇瓶种子所用黄豆餠粉，一般在筛选好后，即留出一定数量存放备用。在1978初选好后将留存部分置于冰库的缓冲间，随用随取。但在半年后，开始发现其母瓶种子粘度普遍下降，直接影响了子瓶效价，比原水平低10%左右。问题较长而未解决。拖至年底。经分析认为是否因黄豆餠粉存放时间过长，发生变质有关。于是更换使用新的黄豆餠粉后，母瓶粘度立即恢复正常，子瓶效价亦提高到原水平。见表三。由此可见，存放时间久的黄豆餠粉会发生质量降低的变化，直接影响菌体的生长。最明显的是反应在母瓶种子液的粘度。若使用这种种子时，则会减慢下一步菌体的生长繁殖速度，特别是前期生长，结果是合成抗生素时间的推迟。
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表三& 黄豆餠粉存放时间对菌丝液粘度影响
效价（u/ml）
批数/时间→
四，培养温度不同对菌体生长影响
M3繁殖罐，在1978年初开始，其种子质量一直较差，前期培养液粘度偏低，效价也低。至5月份，经过多方面检查，发现此罐温度仪表指示值比实际值高3℃，经校正后，情况即恢复正常，从1978年3月份所列数据，见表四。看出又一次说明前期菌丝繁殖生长状态如何，对此后培养结果好坏关系较大。培养温度过低，减慢了生长速度，虽然以后菌丝粘度仍赶上正常罐水平，但其抗生素累积已受影响。
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表四，培养温度与菌丝液粘度变化
培养温度 ℃
40小时消耗
通气状况与菌丝粘度
目前普遍的通气控制方法是在前期（一般10小时）通气量偏低外，过后即增大通气水平，一直维持至放罐，除非因体积过大引起逃液可能时，才适当调低通气，几乎毫无例外。发酵过程通气量应否变更？变更的指示是什么？过去并没有提出来并加以研究，问题直至最近才被引起注意。事情发生在一个以小罐开始，计算传代倒种至第十代的一个罐批发酵上，效价竟低至6522u/ml,/186小时，分析其发酵液粘度变化曲线，发现其粘度在18小时具有一个正常粘度后，迅速下降至最低点。此后一直未能恢复。（见图二，605—22曲线）。在运转过程中，虽提出了通气量与粘度关系，并进行了通气量的调整，仍未奏效。分析其原因可能是菌体分解已有较长时间，仅调整通气量已不足挽救所致。因此，确定在出现粘度明显下降时，立即调整通气量（见图二，605—37曲线），结果表明通气量与粘度有一定关连，即通气状况影响到生长繁殖和解体过程，并比较敏感，一般在调整通气量达到影响程度时，就会在4小时内出现。这里反映了一个事实，通气量的过大（？），导致菌丝解体，直接影响了链霉素的合成，但一旦粘度恢复到一定水平时，链霉素合成又继续进行。但粘度处在什么水平能取得最好链霉素合成，现在还未搞清。
以上述关系，分析发酵单位高（78年2月）、低（80年4月）两种结果的移种系统（小罐→中罐→大罐）的菌丝液粘度变化情况。见图四。结果显示了两种菌丝变化图谱：高发酵水平罐批，其移种系统具有正常上升而在移种时无明显下降；但在低发酵水平罐批，则出现在移种前即有明显下降趋势。经过实际检查并提出了种子罐的通气量适当调低方案，特别是小罐（因无计量仪表，前后通气量无法表示），经过调低后，其粘度曲线及其效价水平又恢复至高单位罐批程度。
&图一 发酵罐通气量（&10m3/小时，纵坐标）变化
图二 发酵液粘度（秒，纵坐标）出现的影响
& 图三单位增长（u/ml/8小时，纵坐标）后果
注：1，横坐标均为培养周期(小时)
2，蓝色线 代表 605-22，红色线 代表 605-37 。
2，605-22放罐单位6522u/ml,周期186小时，605-37放罐单位16700u/ml,周期180小时。
3，箭头向上、箭头向下分别表示通气量提高、降低。
图四 统计发酵单位高、低罐批的移种系统粘度变化情况
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&&&&&&&&&繁殖罐&&&&&&&&
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⑴统计依据
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⑵粘度数据（秒）
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⑶ u/ml
六，突然停气后发酵液粘度变化状况
在发酵过程中，由于客观或主观因素会出现突然停气，在此情况时，应该采取什么措施才比较有利呢?即损失最少的方案，这个问题是值得研究的。
根据我们测定粘度的方法，可以提出一个指标，并以此作为处理方法的依据是可行的。
现列出1978年停电停气时，发酵罐内的培养液粘度变化情况。
表五表示突然停气无疑对于需气菌体是一个极为不利环境，其影响趋势是菌体解体自溶。所列结果，其影响程度是不一致的，这完全反映了菌体在不同生长阶段对缺氧的耐受力是不同的。并随着其缺氧时间长短其影响也不一致。这里有几点是肯定的。
a, 停气短时影响较少，而随时间延长影响加深；
b, 周期短的培养液内菌体耐缺氧能力要高于周期长者；
c, 染菌罐且周期长者，影响更为严重，甚至当恢复通气后，仍无法继续运转下去；
d, 不管怎样，菌丝液粘度明显下降至1秒以下时，已预示着无法继续运转的可能；
根据前面所述，有几项工作开展是有益的。
ⅰ，停气时，立即采取降低罐温，以减缓菌体的解体自溶；
ⅱ，出现停气后，定时取样观测菌丝液粘度变化情况，作为采取措施的参考；
&&&&ⅲ，当恢复通气时，视其粘度情况，全恢复或暂时低通气量，逐渐过渡到全恢复操作；
ⅳ，粘度已降低至危险水平，并无好转时，要做好放罐处理，特别是染菌罐；
ⅴ，在注意力方面，先要放在周期较长的运转罐，而不是放在前中期罐上
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停气时发酵液粘度变化
停气时间(分)
发酵周期(小时)
发酵液粘度(秒)
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无法继续运行
无法继续运行
无法继续运行
无法继续运行
无法继续运行
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注：& 粘度测定为用一根内径为3
mm长600 mm玻璃管，测定发酵液在其中垂直自由下落一段距离的时间，以秒表示。
表示已染菌
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1.我们用玻璃管测定链霉素培养液的粘度，初步看来，这种方法能指示培养液内菌体的生长变化。并能起到指导生产的作用。
2.培养液的粘度，表示该系统的一个微生物状态数值，它受着影响微生物生长繁殖的所有因素变化而发生变化。这个变化结果是综合性的，可能是相互加强、相互抵消、共同削弱过程。
3.根据观测，预示要取得较好的生产效果，存在一个模式粘度曲线图，但可惜，由于各种情况未能找到。至少有两点似乎可以肯定；一是作为种子培养液在移种时，不能处在明显下降过程；二是发酵过程前期必须要有一个迅速上升的粘度曲线，上升后稳定在一定水平范围。
&&&&4、由于培养液粘度是一个微生物状况的数量值，因此要与显微镜观察菌体状况相结合。
&&&&5.影响微生物生长繁殖的因素是多方面的，但在实际调整时，则择其可行因素处理，如补加促进、抑制、稳定生长繁殖的物料。但最简单的是温度和通气的调整。如果能在这方面做些研究，是会对发酵过程控制手段更多些，更有效。
感谢：此文中曲线图绘制是女儿李昕琳所作，特表感谢。。
日 08:43:20
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以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。根据图象可得热敏电阻随温度的变化情况,再根据串联电路的电流随电阻的增大而减小即可得出.从图象上读出时,热敏电阻的阻值,再根据即可求出电压表的示数.分别根据欧姆定律和串联电路的特点求出两电表最大量程时电路的情况,从而根据图象读出电路能够测量的最高温度,再根据求出热敏电阻消耗的电功率.
解:因为热敏电阻的阻值随温度的升高而减小,所以当温度降低时,热敏电阻的阻值增大,电路中的总电阻增大,电路中的电流减小,故电流表的示数减小.从图象中可以看出,温度为时,热敏电阻的阻值为,电路中的电流为,电压表的示数为.当电压表的示数为时,此时电路中的电流为;当时,电路的总电阻为,热敏电阻的阻值为,由图可知,此时热敏电阻消耗的电功率为.答:当培养箱内的温度降低时电流表的示数会减小;当培养箱内的温度为时电压表的示数为;电路能够测量的最高温度为;此时热敏电阻消耗的电功率为.
串联电路的特点和欧姆定律是基础,利用好热敏电阻的图象是本题关键:知道培养箱内的温度,就可以知道热敏电阻的阻值;知道热敏电阻的阻值,就可以知道培养箱内的温度.
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求解答 学习搜索引擎 | 现代生物医学研究使用的细菌培养箱内的温度需要精确测控,测控的方法之一是用热敏电阻来探测温度.如图甲所示的电路,将热敏电阻{{R}_{0}}置于细菌培养箱内,其余都置于箱外.这样既可以通过电流表的示数来表示箱内温度,又可以通过电压表的示数来表示箱内温度.已知该电路中电源电压是12V,定值电阻{{R}_{1}}的阻值是200Ω.热敏电阻{{R}_{0}}的阻值随温度变化的关系如图乙所示.求:(1)当培养箱内的温度降低时,电流表的示数如何变化?(2)当培养箱内的温度为{{40}^{\circ }}C时,电压表的示数是多大?(3)已知电流表的量程是0--30mA,电压表的量程是0--8V,则此电路能够测量的最高温度是多大?此时热敏电阻{{R}_{0}}消耗的电功率是多大?| | | | | |
核心提示：一、菌落总数介绍：　　菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成
一、菌落总数介绍：
　　菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
　　菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
　　菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
二、检验方法
　　菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
　　基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
　　国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。
　　检验方法参见：
　　GB 《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》
　　SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品菌落计数》
（一）样品的处理和稀释：
　　1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
　　固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。
　　用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
　　另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。
　　2．无菌操作：操作中必须有&无菌操作&的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
　　操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
　　3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
　　4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。
　　在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
　　为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。
　　5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。
（二）倾注培养
　　1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
　　将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
　　待琼脂凝固后，翻转平板，置36&1℃温箱内培养48&2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
　　2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。
　　倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。
　　3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。。
　　4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。
　　5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。
　　在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。
（三）计数和报告
　　1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。
　　2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。
　　3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。
　　4．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。
　　5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。
　　6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。
　　7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。
　　8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。
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谈利用PCRDGGE技术检测、鉴定乳酸菌.pdf76页
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利用PCR-DGGE技术检测、鉴定乳酸菌
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