实时荧光定量pcr的ppt结果无法分析，求助

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-26 06:55 标签： abi实时荧光定量pcr仪
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如果是你看的这样，我觉得可能是实验室污染了，理论上阴性不应该有曲线吧！
理论上NTC是不应该扩增的。但是定量pcr极其灵敏，有ct值也是正常的。一般ct值都在30以后的。只能说明最后一个稀释梯度已经达到和NTC一样的结果了，这个孔的数据也是不能用的
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随时随地聊科研实时荧光定量PCR的结果该怎样分析?为什么最好不用Syber Green？
如果有标准曲线,按照标准曲线计算.一般都是相对量.则用delta delta CT方法来计算.举例如下：对照组基因A的CT值为20,内参（比如βactin)CT值15.实验组基因A CT值18,内参CT值14.首先算加样量：delta CT=15-14=1.2的1次方是2.也就是说实验组的加样量是对照组的2倍.基因A:delta CT=20-18=2.2的2次方是4.也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍.但是由于加样量是2倍,所以4处以2=2,最后的相对量是2倍.几点注意：1.必须确定扩增的特异性2.只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同）3.2的某次方只是理论值,实际扩增效率低于2.4.最好不用Syber Green
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看CT值、起始拷贝数、标准偏差等如果是SYBR做的话，再看下溶解曲线
扫描下载二维码实时荧光定量pcr数据如何统计?近日做实时荧光定量pcr,得到了不同的ct值,只是计算了△△ct以及2-△△ ct的值,但是我不知道如何使用spss进行统计分析,看到别人的文章都是均数±标准差的形式,我不知道如何这样统计.例如我有 3个组,正常组,模型组,药物组,3个基因 tnf nf-kb 以及actin内参,重复3次,这样得到27个ct值,如何统计成x±s的方式呢?以及计算p值等.（也可以站内联系）
首先你这样做出来的统计没有意义.应该是至少3次独立实验,而不是重复3次PCR.如果3次试验,每次重复3次（取平均值算一次）.然后先定各个基因在对照组的值为一,再算出其他组该基因的相对量,比如内参CT值一样（都是15）,而TNF的CT值对照组是20,而模型组是19,则相对量是2 （对照组为1）.△△ct=（19-15）-（20-15）= -1,2-△△ ct= 2.以此类推.其实你只有3组,2个基因.用ANOVA先算,然后再用t test就可以了.结果表达为TNF：对照组1,模型组想x± d,药物组y± d.NF-kB:对照组1,模型组想x± d,药物组y± d.TNF和NF-kB间不需要比较.请参考我发表的文章：如果你提供email,我可以发全文给你.
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我想做实时荧光定量PCR，是荧光染料法，仪器是Roche公司的，做绝对定量,想自己制备目标基因标准品,如何办. 请指教.
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扩增目标基因，纯化后，用分光光度计，定浓度后做为标准品。最好是将此目标基因接入TA克隆，转导入大肠杆菌后扩增，抽质粒，可达1X10十二次方，再以每10倍稀释后作为标准品，一般从1X10八次方开始稀释。标准品一般选六个点，起跳的Ct值最好在20-30之间。另外，标准品及样品要同时重复做2-3管，标准曲线的R值在0.98以上，每10倍稀释的标准品Ct值一般相差3.3左右。
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楼上给的建议简洁明了。
我也给点建议，因为荧光染料法的特异性不如taqman探针法的，所以RNA的质量必须保证，先测OD值，再跑RNA电泳，基本上可知道RNA的质量。因为RNA容易降解，只有保证其质量，才能反应真实的情况。这种方法比较适合细胞株，多个基因的检测。如果做的基因不多，都是人类正常基因的化，我推荐应用AB公司的Assays-on-Demand(TM) Gene Expression Products 试剂盒，价格反而便宜，质量也有保证。
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各位老大，我想做DNA（非RNA）的定量，带内对照的半定量即可，能否用此法？另，我的量比较大，200左右，导师只给预算1万，能否OK？盼告
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我选用MGB探针的话是不是用普通的Taq酶就可以？还有一个问题，HOTSTAR酶可以用于荧光定量PCR吗？
谢谢帮助！！！Wink
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我做荧光定量PCR是用的普通Taq酶。
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对于Taqman探针，Taq酶只要有5'外切活性就可以，HotStart好一些，酶贵一点，我原来做都是用我自己做的Taq酶，效果不错，Mg浓度高一点3.5
如果200个反应定量PCR 8000以内肯定搞定。
大规模做PCR最好用UNG－dUTP 抗污染系统，否则一旦污染就太麻烦了。
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200个标本，1万的预算你可以直接购买ABI公司的Taqman专用试剂，使用其96孔反应板，既可以保证速度和质量，还可以在预算之内。我曾经做过240个标本，包括预实验在内，只用四天就搞定了（事先提好了DNA）。自己合成引物和探针，没有问题的。
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我问过ABI公司的，他们的探针和引物倒是不是很贵，就是那个金牌TAq酶贵。好像一万元搞不定的。假如你买一个目的基因的试剂盒和一个看家基因的试剂盒的话
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不需要什么特别taq的，上面smmu不是说了么。我们用的是1毛钱的酶，结果很好的，我曾经贴过图的，从LCM切下来的东西里括出来的，3个复孔拟合的很好的，我认为用taqman的方法自己设计引物和合成探针最好了。
当然如果你有热启动，那最好了，我们是一大批没有用完。另外用普通PCR检测特异性还可以就算了。

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