实验新手必读（二）：PCR设计宝典、软件应用、操作细节.....
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实验新手必读（二）：PCR设计宝典、软件应用、操作细节.....
作者：解螺旋.子非鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手导语遥想当年，小鱼初遇PCR时，原以为可以轻松的搞定，谁知PCR却是一个不折不扣的大坑。各种假阳性、假阴性结果齐飞，非特异性扩增条带一如狗皮膏药一般挥之不去，在寻找各种原因无果后，小鱼愤怒的捏碎了电泳胶。然而痛定思痛后，小鱼发现PCR之所以能成为科研路上的拦路虎，首先，引物设计可算是一大功臣。 PCR引物设计宝典 好的引物会让PCR实验成功一半，因而，引物设计一直都是PCR非常重要的环节。因而，小鱼也从神师兄那里搜刮囊括了几种引物设计方法，在此分享给大家。&当然首推的经典之法就是让Premier5携手oligo，共同设计PCR引物。1\以小鼠的IL-17为例，进入NCBI界面,选择Nucleotide后，输入IL-17，点击search。然后选择人类IL-17的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，选定目的序列。2、打开Primer Premier5软件，点击菜单栏File|New|DNA Sequence，在出现的对话框里黏贴目的序列，并在paste对话框里选择As Is，点击OK。3、点击Primer，弹出菜单后点击search按钮。在弹出的Search Criteria中，选择PCR&primers，Pairs&参数，并选择所需PCR产物长度，点击OK。在弹出的search progress菜单中，点击OK。4、在搜索出的结果列表里选择Rating值高，bug较少的引物#1，在Primer Premier中选择S（正义链）/A（反义链），点击edit&primer，将所得引物改成为Rating值为100，无bug的引物，即无发夹（Hairpin）、无二聚体（Dimer）、无错配（False Priming）和交叉配对（Cross Dimer）的引物。5.点击菜单栏中Edit∣Copy∣Sense Primer/Anti-sense Primer，即可得到设计的引物。Sense Primer:5'& TCAGACTACCTCAGCCGTTCC& 3'Anti –sense Primer: 5'& GGTGGTCCATCTTTCCCT& 3'6.接下来，就要用Oligo软件验证评估Premier5软件所设计的引物，打开Oligo界面如下：单击菜单栏里File∣New Sequence可打开以下窗口，并将设计好的上游引物黏贴在空白框里。7.点击菜单栏里Accept/Discard中的Accept，则会出现Tm、△G和Frq三个窗口, △G值反应了序列与模板的结合强度，最好引物的△G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对较低。8、点击菜单栏里的Select中的Upper Primer将当前引物设置为上游引物。同时点击菜单栏里的Edit中的“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列。点击Accept and Quit命令即可。9、最后，在菜单栏中Analyze完成引物△G值、Tm值、引物二聚体和发夹结构的分析后，可将引物序列送至公司进行合成即可。&然而，此法虽好，但是下载软件总归是件麻烦事儿！有木有更简单粗暴的设计引物的方法呢？答案是YES！有！这3款简单实用的在线PCR引物设计软件可以说是懒癌晚期患者的福音。 3款简单实用PCR引物设计软件No.1 NCBI的Primer-Blast1、打开以下网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 进入Primer-Blast界面，开始引物的设计。2、验证引物好坏3、外显子内含子（Exon/intron）如果设计的引物是跨内含子和外显子的交界处，可在此处设置成为Primer must span an exon-exon junction。外显子的匹配碱基数和内含子的长度等设置一般选择默认。4、特异性（Specificity check）在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。其中，数据库中的RefSeq mRNA和Genome (reference assemblies from selected organisms)是经过专家注释的数据，可得出更准确的结果。5、最后建议用oligo6或primer5验证引物自身的特性：发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体，△G的绝对值。No.2 Primer3 Plus1、点击这个网址：/可打开Primer3Plus软件。点击Run latest Version of Primer3Plus进入了设计引物的主页面。2、在General Settings中，依照引物设计原则，设置产物长度（3、点击右上放绿色按钮，可获得若干对引物，并按照5’到3’的顺序，包含了引物和产物的一些基本参数。此时，应尽量选择G、C结尾的引物进行合成。4、设计好引物后，仍需用NCBI blast 引物验证，点击http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi可出现以下界面。5、点击Basic BLAST中的nucleotide blast选项，在下面框中，按照5’－3’顺序，分别输入上游引物和下游引物，上下游引物之间间隔20个以上n。6、选择物种数据库，如Human，Mouse或者Others（如果是非人和非小鼠物种）。7、选择Somewhat similar sequences(blastn)8、点击Algorithm parameters, 在Expect threshold 输入1000，在Word Size（读长）输入7，便可按照7个一组核苷酸序列放到GeneBank中进行比对。&9、点击BLAST进行比对得出结果。颜色代表得分，选择引物的原则是：列表中大部分是目的基因，说明引物特异性高；但是可能物种不同，说明该基因在不同物种中保守。No.3 Primerbank该数据库是哈佛大学的一个qPCR引物数据库，目前有超过20万条引物，涵盖了人和小鼠大部分已知的基因，且其引物有效率为82.7%。&1、点击该网址：http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/，进入搜索界面。搜索类型这里，可以根据GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol以及keyword六个选项进行搜索。2、以小鼠的beta-actin为例。首先到NCBI上找出β-actin的gene ID，如图，选择gene,输入beta-actin，并点击Results by taxon中的Mus musculus，可得到以下结果。小鼠beta-actin的NCBI gene ID是11461，而actb则是小鼠beta-actin的NCBI gene symbol。3、将Gene ID:11461输入到primerbank点击submit，可得到以下结果。4、往下拉动滚动条，还可看到经过验证的引物，点击Validation Results，即可看到溶解曲线、电泳结果等信息。PCR操作中必知的6大细节 引物设计好后，想必很多小伙伴们都在摩拳擦掌，准备正式开始PCR实验了。然而，细节决定成败，为了获取好的实验结果，这些隐藏的细节你不可不知。&1、最好使用一次性进口tip头，以避免液体残留；同时，tip头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。2、加样时，tip头要伸入PCR反应管的液面下一点，然后将液体缓缓打入液面下，至恰好打出一个小气泡为至；加样过程最好在冰块上操作；移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性，而导致加样量的不准确。&3、配制反应体系时，若反应物为冻结制品，需在融解后上下颠倒轻轻均匀混合；加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均；按照液体体积由大到小的顺序将反应物加入到PCR管中；引物和模板和体系所加的比例要合适，模板过量反而会抑制体系的反应。4、&操作多份样品时，可先制备反应混合液，即将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好后分装，这样即可避免污染，又可增加反应的精确度。&5、避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心；PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。6、如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 PCR的疑难杂症及应对之法 可是有时即便小伙伴们将上述实验细节处理的妥妥当当的，依然等不来奇迹发生的时候，各种非特异性条带、拖带等糟心的实验结果纷纷出来给大家心中添堵。在此，小鱼归纳了几类PCR常见的问题，并将其相应的解决方法分享给大家。Q1：PCR产物出现假阳性（即空白对照出现目的扩增产物）Answer：1）引物设计不合适：扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可扩增出非靶序列的序列；靶序列太短或引物太短，可导致假阳性。此时需重新设计引物。2）为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂及器材应高压消毒，所有离心管及加样枪头等均应一次性使用；必要时，加样前反应管和试剂均用紫外线照射，以破坏存在的核酸；3）为了避免靶基因受到空气中小片段核酸（与靶序列具有一定同源性）污染，可用巣式PCR方法减轻或消除。&Q2：PCR产物中出现假阴性或无扩增产物（即阳性对照中有条带，而样品则无条带）Answer:1）条带放置时间过久,核酸被降解，最好在48h内进行电泳检测。2）DNA模板纯度低，如含有杂蛋白质或Taq酶抑制剂，此时可对DNA进行再次纯化或重新用优质试剂盒提取DNA; DNA浓度太低时，可以加大模板量；对具有二级结构DNA使用较好的聚合酶；提取DNA时，避免吸入酚类试剂。3）对设计不合理的引物进行重新设计合成；引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融而降解失效；检测引物OD值并进行电泳检测以确保两条引物浓度一致。4）酶失活时，可更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。5）PCR反应条件：提高变性/退火温度；适当增加循环次数。如果反应系统中污染了蛋白酶及核算酶，则在未加Taq酶以前，将反应体系95℃ 加热 5~10 分钟。6）Mg2+浓度过低可影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，而Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性，因而可适当提高Mg2+浓度。7）如果靶序列发生突变或缺失时，也会影响引物和模板的特异性结合，产生假阴性结果。&Q3：非特异性条带扩增或者条带出现拖尾现象Answer：1）当引物特异性差或引物形成二聚体时，可重新设计引物或者使用巣式PCR。2）若模板或引物浓度过高，可适当降低模板或引物浓度，如质粒DNA3）酶量过多，则适当减少酶量；酶质量差，可调换另一来源的酶。4）Mg2+浓度偏高，则降低镁离子浓度。5）退火温度偏低，适当提高退火温度或使用二阶段温度法（94℃变性，65℃左右退火与延伸）6）循环次数过多，不仅会降低扩增效率，且会使错误掺入率增加，因此需要减少循环次数。7）电泳体系有问题：凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；凝胶没有凝固好；琼脂糖质量差。8）PCR 试剂盒则可能由于运输储存不当引起试剂盒失效，或者试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。&Q4：提高PCR特异性的策略有哪些？Answer:四种策略：1）巣式PCR（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的灵敏度；降低了扩增多个靶位点的可能性；提高PCR特异性。2）递减PCR（Touch Down PCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性；循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2，直到退火温度低于Tm 5 。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。3）热启动PCR：抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪到达变性温度。如在冰上配制PCR反应液以抑制Taq酶活性，后将其置于预热的PCR仪中。4）使用PCR增强剂：甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等可以降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。但是增强剂的浓度要适当。&最后，小鱼把这首魔性的PCR之歌送给大家，与君共勉！
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【求助】PCR产物再次PCR
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这个帖子发布于2年零269天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我用cDNA作为模板进行PCR，产量很少，在片段内部有用另外一对引物进行扩增，第二次PCR产物应该在第一次PCR产物片段内，可以第二次PCR跑胶后没有产物，怎么回事呀？
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你引物有blast过吗？第一对引物是不是P出了非特异性片段？
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两条引物经过blast后没有同时match到一个基因。
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第一次的PCR产物已经经过酶切证实
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dxy_doctor 两条引物经过blast后没有同时match到一个基因。 没match一个基因，还PCR个啥。根本就做不下去嘛。为啥还做呢
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另外的基因
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dxy_doctor 第一次的PCR产物已经经过酶切证实 没有blast同一个基因就是第一次的PCR不对了，酶切验证可能是其他的条带被切开了，有测序验证过吗?
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[求助]PCR产物为何拖带？
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这个帖子发布于11年零195天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我最近的PCR产物跑电泳时不知为何变成了大片的拖带，以前跑的条带一直很好现在的PCR条件和以前的是一样的。是引物出问题了吗？请各位高人指点，万分感激！
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是不是模板加多了?
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你用的是否是新提取的DNA,会不是新提取的DNA中含有的杂质有点多呢?比如说,盐离子呀等,还有你的摸板是否由于经过保存后有断裂的现象呢?就是在你操作时由于用力有点猛使得造成是机械剪却呢
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我估计和模板没有什么关系，因为我用DEPC替代模板作为空白对照，同样出现明显的拖带，我又用以前成功扩增的模板重新PCR，还是出现拖带。我怀疑会不会是我的体系里面存在对引物有降解作用的物质，破坏了引物，请大家帮帮忙，谢谢了！
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你以前做时没有出现这种情况,会不会是胶和缓冲液的问题呢(不过,我觉得这不大可能呀),排除你的循环数和摸板与引物的可能.按理来说,你的对照也出现这种问题,你的这种情况让人想不明白.
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呵，你做的什么PCR，我做ISSR，用的是简并引物，大部分引物的空白都做出了这一现象，找老师问，他们说简并引物做出这种现象是比较正常的。
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丁香园准中级站友
我做的是普通的PCR。我的反应体系是这样的：模板 1 ul , Tag酶 1.5U, Mgcl2
2.5ul,Buffer 2.5ul , dNTP 0.5ul,上下游引物各1ul,DEPC水 15ul,反应条件：94度预变性5分钟，94度变性40秒，60度退火30秒，72度延伸1分钟，共40个循环，最后再延伸7分钟。以前一直是这样扩增的，产物就是一条很清晰的条带，现在不知道什么环节出了问题，每次扩增都是大片的拖带，目的片断根本无法分辨。请大家帮我出出主意，谢谢了！
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做Pcr产生smear的原因如下：1.模板不纯2.tm偏低3.酶量过高4.dntp，mg的浓度过高5.循环次数过多6.引物量太多个人认为：1.你的taq酶加的量较多，循环的最适次数是25～35，因为你加的dntp是一定量的。2.还有就是做pcr是用高压的无菌三蒸水就可以了，没有必要也不应该用depc水，因作pcr是尽量使成分单纯，以避免对实验的影响。作rt时才应该用depc水。3.一般引物加0.5ul就足够了4.你是否找下模板的原因，例如是否降解？个人意见，供参考，希望对你有帮助！
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可能是缓冲液出现问题了，换新的跑跑看！
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谢谢syd5993，我用DEPC替代模板作为空白对照，同样出现明显的拖带，我又用以前成功扩增的模板重新PCR，还是出现拖带。引物我也用过0.5ul试过，但是一样有拖带。如果是循环数太多的话，那为什么我以前用同样的反应参数可以扩增出非常漂亮的条带呢？而现在的情况是拖带十分严重，根本无法判断目的条带有没有存在，请大家指点，谢谢各位！
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既然你的空白对照都有smear，是不是因为你的某种成分有污染而导致的，按理说空白对照是没有东西的，建议你是否考虑一下？实验做不出来要从多个方面找原因。
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taq酶会不会有问题？我也觉得你的酶加得比较多
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nbacl2003 如果是循环数太多的话，那为什么我以前用同样的反应参数可以扩增出非常漂亮的条带呢？而现在的情况是拖带十分严重，根本无法判断目的条带有没有存在，我曾经碰到和你一模一样的问题,我把所有的试剂全部更新,都不能跑出原来漂亮的带都是smear,最后都不出带.而这个体系我们用了5年,都很稳定.首先考虑模板是否有问题,如果用别的引物能扩的出的话,建议从考虑引物着手,因为你之前能括出很漂亮的带,先看引物是否时间太长,是否讲解,不行就更换引物.我建议你如果模板没问题,就重新设计引物毕竟引物比较便宜,但它的作用非常中重要.Good luck. Hope you could solve your problem in a short time. I spent almost three months to solve the problem. After i chang the new primer, everthing is fine.
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谢谢skybluee ，可是我的引物是最近刚刚才合成的啊，而且同样的一份模板用其他不同的引物扩增时却不出现拖带，这又如何解释呢？
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你是不是nbacl2003 ,我当年重新合成两次新的引物(引物序列相同,第一次合成后仅做过一次出来漂亮的带,然后都是smear,开始以为实验员母液引物稀释时发生错误,又合成相同序列的引物,还是不行.然后老板说重新和合成引物,才解决问题.我问老板如何解释,he said he donnot know.(老外一般不知道,就说不知道,一般不会不懂装懂.)做PCR虽然有很多理论,但是还要靠经验和摸索,还有运气.Good luck!
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我也遇到和你一样的情况,如果问题解决了,请上传post,谢谢啦
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谢谢skybluee
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会不会是你的酶有问题?我之前用的那些酶做的空白都有条带出现,最近刚买的酶用来做做ＰＣＲ,空白就正常了.
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感谢各位一直以来的支持,我按照各位的意见逐一寻找原因.现在问题已经解决了是循环数太多引起的.我把循环数降低至32后(其他条件不变),所有拖带都已不见了.但我还是有一点疑问,为什么我以前用40个循环进行扩增, 可以得到很漂亮的条带,而做了一段时间以后却出现拖带?谢谢大家!
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我的引物刚合成了一周，可是上游引物被污染，不出条带，我用了新引物就好了。你可以试试新引物。
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nabcl2003看来你比我幸运的多了，我和你遇见了同样的问题，第一对引物只出现一次目的带其余都是拖带十分严重，根本无法判断目的条带有没有存在。换过引物后最初几次p都不出带，调整退火温度后出来一次，随后又全是拖带。相同的模板做其他引物的pcr次次都出，估计模板没大问题。循环周数我一直是40，后来降到36还是一样只不过拖带亮度弱一些。看了你的帖子我想问一下为什么空白对照也出现拖带，你降低循环周数空白的也没了吗？谢谢
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nbacl2003不知道你看过我上次给你的留言否，我现在真的非常着急，想得到你的帮助，看了你的帖子我想问一下为什么空白对照也出现拖带，你降低循环周数空白的也没了吗？谢谢
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nbacl2003 感谢各位一直以来的支持,我按照各位的意见逐一寻找原因.现在问题已经解决了是循环数太多引起的.我把循环数降低至32后(其他条件不变),所有拖带都已不见了.但我还是有一点疑问,为什么我以前用40个循环进行扩增, 可以得到很漂亮的条带,而做了一段时间以后却出现拖带?谢谢大家!电泳检测也有个极限灵敏度，会不会是当没有达到检出量时，你的目的条带很单一，但是随着循环数增加，其他的片断积累达到一定的量，可以被电泳检测到了，所以就突然间的出现了？（以上纯属本人胡思乱想的。）
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大家好,我做的是AFLP,用一组引物已经跑出了一块很漂亮的聚丙烯酰胺胶板.所以我想预扩增以后的模板应该没什么问题.但现在选择性扩增后的产物片段出现了明显的拖带(2000bp以下都有),不在我所需要的100-600bp之间,所有的试剂包括引物都换新的了,结果还是不理想.我的PCR体系是:TaqE buffer2ul(含Mg离子),两个引物(50ng/ul)都是0.6ul,dNTPs(10mM)0.4ul,TaqE0.1ul,ddH2O11.3ul,模板是预扩增以后稀释了75倍,取5ul.PCR程序是:step1.94℃1min,step2.94℃30sec,step3.65 ℃ 30sec,每个循环降低0.7℃,step4 72℃1min, step5.goto step2 12 cycles. step6 94℃ 30sec,step7 56℃ 30sec,step8 72℃ 1 min, step9 goto step6 22 cycles,step10 72℃ 5min.请各位老师指点,谢谢!
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最近跑以PCR产物为模板，3ul的量也出现了类似问题。
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根据聚合酶酶的说明书设置循环次数，设置多了容易产生拖带，，，，
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出现缘由：（1）模板是不是太多（2）胶点样孔不整齐，就是你做胶的时候胶没有凝固好，你可以试试重新做块胶（3）优化你的PCR体系吧，模板过量或是镁离子浓度过大都会出现拖尾。marker跑的很好，说明不是胶的问题。（4）退火温度较低，可以提高2到3度（5）Mg离子浓度一般的PCR在1.5mM就可以了，不知楼主用的多少（6）模板浓度较高或者含有其他PCR抑制剂，建议稀释下模板（7）延伸时间一般1kb/min，时间太短可能会延伸不完全（8）循环数太高也可能引起拖带，考虑平台期，30－35循环应该足够了（9）另外请教楼主;跑电泳时LOADINGBuffer是不是加的有点多？或者是胶的点样孔不好造成电泳条带有月牙状和不整齐？
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【求助】PCR产物和T载体连接的问题
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这个帖子发布于8年零40天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位老师，请问一下，我的PCR产物上有HindIII和BamHI的酶切位点，是否可以直接连接到pMD-18T载体上呢，（该载体上有这两个酶切位点），这样是否会给我的后续试验带来繁琐步骤，（T载体只是为了测序和保存，还需连接到其他载体上）我是否有必要重新设计一个没有酶切位点的引物来PCR呢，谢谢指导！:P
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嗯，支持新手。给你讲讲吧。你试验的目的首先要清楚，是克隆序列还是表达蛋白。很多情况下pcr产物是可以酶切后直接连接载体的，不一定非要通过T载体克隆，通过T载体就好比省力气了，多走点，更容易达到，当然也有你说的好处，保存一个完美的而且容易提取的序列。但是设计这样的pcr引物前往往要加保护碱基，目的是提高酶切效率。如果你现在没加，就只好先做T载体克隆好些。就不要设计没酶切位点的引物了，后面更麻烦。
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谢谢老师的指导啊
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如果你现在没加酶切位点，连T后，不但要测序正确，还要注意插入T载体的片段的方向是不是你想要的，千万别连到目的载体里才发现目的基因终止信号在启动子一侧。所以我建议你最好现在就把酶切位点加上，这样就不用考虑方向的问题了。
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我想问一下，你那两个酶切位点是在设计引物时加上的吧？如果是特意加上的，并且PCR片段里面没有，那你可以联T载体。等测序正确，再用这两个酶切下，连到你要用的载体上就行，当然前提是你载体上也有同样的酶切位点。还有，你用的哪种taq酶？如果是Ex taq等能自动在PCR产物末端加A的，那就能连到商品化的PMD18-T载体上，如果是高保真taq酶，末端不能自动加A的，则连不上。
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谢谢各位的悉心指导，我用的是Takara的rTaq酶，就因为高保真酶不加A尾，就放弃了，不知会不会影响结果呢。我还想问一下，要送去测序时自己如何留下备份呢，谢谢哦
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Takara的LA Taq比rTaq的保真性要好一些，而且也能加A。如果PCR产物已经有酶切位点的话，最好连到pMD19T-simple vector上，这种T载体没有多克隆位点，连上后可以直接用设计的酶将目的片段切下。
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我一般用甘油保种，500ul，测序送200ul，自己留300ul。
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谢谢各位，祝大家试验顺利！
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