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【求助】恒压湿转到后来怎么变成恒流了？？
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丁香园准中级站友
这个帖子发布于9年零196天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
今天第一次独立做WB，132KD和86KD的蛋白用伯乐的转膜仪湿转，准备100V恒压转4个小时，但是差不多转了2个小时的时候电压变成88V了，电流400mA，重新设电压，还是上不去，依然是恒流400mA，转了3个小时的时候就变成84V,400mA了，最后结束的时候是83V，400mA，这是怎么回事呢？为什么越转电压越低，由恒压变恒流了呢？我的转膜缓冲液是2.9g甘氨酸，5.8gTris，200ml甲醇，双蒸水定容1000ml。我转的时候在转膜仪里放了一个冰袋，难道是冰袋的影响么？请各位老师指教。
不知道邀请谁？试试他们
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Biorad的电源有高电流与低电流之分,我们通常用的都是低电流的,也就是说最大电流只能到400mA,这时就变成稳流了;你可以一开始就设置为稳流.我们用的电转液是3.05g Tris,14.4g甘氨酸,200ml甲醇，双蒸水定容1000ml。你的蛋白分子量较大,可另外加入SDS冰袋和冰浴对于大分子转膜(时间长)是必需的
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国产的电泳仪有时候没有专门的恒压或者恒流设置,你这种情况可能是电流设的太小,因此达不到100V的要求.也就是说,当你想100V恒压的时候,实际电流是大于400mA的,而你设定的参数分别是100V和400mA,因而机器默认为恒流.你下次做的时候把电流设高点,比如设定100V和700mA,那样可能会是恒压的状态.不知道这样解释你理解了没有.
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netzhouxun 国产的电泳仪有时候没有专门的恒压或者恒流设置,你这种情况可能是电流设的太小,因此达不到100V的要求.也就是说,当你想100V恒压的时候,实际电流是大于400mA的,而你设定的参数分别是100V和400mA,因而机器默认为恒流.你下次做的时候把电流设高点,比如设定100V和700mA,那样可能会是恒压的状态.不知道这样解释你理解了没有.我的转膜仪电流最高就只能设到400mA
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你的电泳仪电源限制最大400mA,当达到上限时,自动变为恒流状态.
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【专题讨论】大家用半干转时，不同分子量都各用多少时间呢？
小弟实验室是用的Bio-rad的半干转仪，对不同分子量转膜的时间及电流电压设置比较感兴趣，还想请各位指点讨论我们做得最多的是转22kD的蛋白，用的是恒压10V，转膜25min可以成功。请问各位有没有做过其他分子量的蛋白呢？讨论讨论吧，为以后的XDJM们提供点参考：）我一般用恒流转的，跟据我的经验，30kd以下的蛋白是会转过膜的，所以要控制时间,一块1.5mm的胶，100ma，30min以内，30－50kd，100ma,45min50-80kd,100ma,1h80-100kd,150ma,1h&100kd,150ma,1.5h两块胶的话，电流加倍，时间不变昨天做82kD的蛋白，用的是10V，转了35min。用考染染胶30min发现条带非常少，今天做检测没有发光，用丽春红染膜也发现条带非常少，几乎看不清。不知道是不是上样量少（20ug）还是转膜时间过长呢？头痛啊半干转六一的统一是150mA 恒流 10--90
40分钟90--120 50分钟其实一般转45分钟都没问题你最好买点欲染mark试几次就知道了其实你如果不怕费样品你用150mA转10分钟就能发现 30左右的已经上去了转到40分钟左右 30左右的刚转完 全 45分钟
30左右的并没有转过!我们科室为了节约时间,有时候是一块胶转几次(因为一抗不同),样品上的大量一点
大小在30附近的蛋白 每20分钟转一次 一块胶能转至少4张膜呢!谢谢以上各位园友的大力帮助，不知道大家是否都是用半干转还是其他什么方法呢？麻烦一并写清楚，大家才好对号入座，多谢多谢！希望更多的战友加入进来哟jingzikm wrote:半干转六一的统一是150mA 恒流 10--90
40分钟90--120 50分钟其实一般转45分钟都没问题jingzikm园友所说的“一般转45min都没有问题”，意思是大概转这个时间点的话，20－100kD范围内的蛋白都会在膜上么？如果如此的话，那么我想以后的园友大部分能够参考这个时间点了另外，关于设定电流还是电压的问题，我曾经从书上看过最好是设定恒流，因此，我不知道电流设定的规则，望各位高手指点一二这台仪器感觉转膜效率不怎么高，试了很多种条件，恒流从20mA到100mA，不同的时间，感觉丢失比湿转要大，如果是在做不出来可以看看加大上样量看看，仅供参考！谢谢starkstang的建议，很不错的看法哦you can not judge the effect of transfer by prestained marker according to our experiences,in fact, when you put the membran on the gel,it is easy for marker to stain the gel even there is no electricity.Maybe you can stain the gel to know whether you target protein transfer to membrane.请问楼上的意思是用考染染胶和丽春红染膜么？在70－90之间会有很多条带，如何判断自己需要的蛋白已经没有在胶上，而在膜上了呢？
您的位置： &&& 【求助】蛋白分子量相差太大，如何选择湿转的条件？
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【求助】蛋白分子量相差太大，如何选择湿转的条件？
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【求助】蛋白分子量相差太大，如何选择湿转的条件？
我的目的蛋白为120kD,内参为55kD，请问各位前辈，如何选择浓缩胶和分离胶的浓度，用8%可以吗？还有就是湿转的条件是什么？请各位前辈不吝赐教，先谢谢了？
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最好别再一块胶上跑，你可以先跑内参，把内参跑齐了，再跑目的蛋白。
120KD的，分离胶7.5%，8%都可以，湿转：100V，90min；
55KD的可选择10%的分离胶，湿转：100V，60min。
你可以借鉴一下。
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前辈，您能详细讲解吗？您说“可以先跑内参，把内参跑齐了，再跑目的蛋白”的意思是不是内参到达分离胶时，开始在另一块胶上跑目的蛋白？此外，我用的是Bio-rad,湿转条件是100V，90min的话是不是相当于300ma,90min.请多教教我。
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在一块胶上也行吧，浓缩胶5%，分离胶10%。这是我跑的胶上的Marker，分离胶10%。
电转的话也应该可以一起转，用PVDF膜，我曾经在一块膜上同时转过一个80多KD的和一个10几KD的蛋白
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首先可以在10%的SDS-PAGE胶上跑，根据预染蛋白marker的位置，可以判断这两个蛋白的位置。然后，用刀将胶切成两部分，然后分开湿转55 kda的可以湿转200mA，2hrs，这时候120kda的那半胶可以先放在水里就行了，不要让它干了。转完一个之后，再转120kda的这个，200mA，3-4个小时。这两个蛋白的转膜时间可能需要你摸索一下，蛋白的浓度不确定，浓度高的话，时间短一些，也会有部分的转移上去。建议你做转膜的时候，最好做个阴性和阳性的对照。
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我的分离胶是8%,根据分子克隆而来。按书来说，8%的分离胶的线性分离范围为36-94kD。不包括120kD,那我能在同块胶上跑120kD和55kD吗？此外，我把预染蛋白Marker分装了，一部分放-20°C，可以吗？
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两个蛋白一起跑，你可以试试看。我是分开跑的。
内参跑齐，是指内参的量要差不多，洗出来的条带粗细要一致，不然你怎么知道目的蛋白有变化呢。
你是恒流转膜的，转膜时间自己摸一下，因为我一直用的是恒压转。
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谢谢前辈。此外，有关抗体中加入50%的甘油，目的是-20度保存，此时的甘油如何除菌哪？是不是可以不加叠氮钠？还有一个问题碧云天的彩色蛋白预染Marker是不是在-80度反复冻融很快降解哪？我的实验条件是蛋白大小120kD，90kD,Biorad仪器，SDS-PAGE积层胶5%，分离胶8或10%，积层胶电泳40V，分离胶电泳90V。湿转200mA,2hour。转完后，胶考染没有条带，因实验室没有立春红。所以膜没法染。但是转膜后膜上没有Marker，我的Marker被-80度反复冻融过。
2.5%的脱脂奶封闭过夜，一抗是santa cruz进口分装的多抗，1：1000加入2个小时，洗膜5-6次，二抗中衫金桥的，因是别人用剩的，滴度是1:1000,结果是1）杂带多，2）六种组织中有的有带，有的没有。请前辈多多指点。谢谢。
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前辈再次向您请教，HRP标记的二抗（santa cruz）说明是4°保存，我不慎放入-20°3周，如果取出加50%的甘油在分装冻入-20°行吗？还有我使用的是多克隆抗体，5%的牛奶封闭2小时、4小时、过夜，哪种方法好？我做的封闭2小时，杂带多，而封闭过夜，又是白板，哎，老板不给买好点的抗体，太麻烦了。前辈，请多给与指教。
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1.抗体放置问题你查看相关的说明书，你按照说明书放置就可。
2.我封闭用5%脱脂牛奶，室温摇床封闭只有一小时，没必要封闭过夜的。
3.另外，一抗要孵育过夜的，这样与膜上的蛋白结合得会比较好。你的情况好像应该是一抗孵育时间太短，导致条带不均，我是猜测的，没看到你的图。
4.marker，我们实验室一般都是用的Fermentas的,我也是按照说明书存放的，碧云天的marker我没用过。