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NMDA受体与AMPA受体亚单位在培养海马神经元树突上的表达及共定位
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DG6-GFP细胞,小鼠树突状细胞肉瘤低转移细胞（绿色荧光蛋白标记）
DG6-GFP细胞,小鼠树突状细胞肉瘤低转移细胞（绿色荧光蛋白标记）
产品报价：￥1元
更新时间：访问人数： 50次
产地：美国/中国
厂商性质：生产商品牌：美国ATCC
公司名称： 上海康朗生物科技有限公司
型号：1ml/株
联系人：蔡盼
（联系我时，请说明是在中国环保在线上看到的，谢谢！）
该厂商其他产品
DG6-GFP细胞,小鼠树突状细胞肉瘤低转移细胞（绿色荧光蛋白标记） 的诱导细胞提取纯化之后立即冻存。每管含有细胞数大于5*105 cells/ml，此细胞通过vWF/Factor VIII 和CD31 （P-CAM）免疫荧光染色验证，经测试不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。所有细胞入库之前均经过严格的细胞质量检测和鉴定确保细胞到每一位用户手
DG6-GFP细胞,小鼠树突状细胞肉瘤低转移细胞(绿色荧光蛋白标记)&&生长状况：贴壁、悬浮、半贴壁、半悬浮生长传代方法：1-4代物种来源：人、小鼠、大鼠等动物种属细胞活力：87%细胞纯度：93%运输方式：活细胞DG6-GFP细胞,小鼠树突状细胞肉瘤低转移细胞(绿色荧光蛋白标记)&&冷冻保存方法一：冷冻管置于4℃300分钟&(-20℃30分钟*)&-80℃16~18小时(或隔夜)&液氮槽长期储存。&&神经胶质细胞培养：神经细胞（神经元〕不易培养，DG6-GFP细胞,小鼠树突状细胞肉瘤低转移细胞(绿色荧光蛋白标记)&&只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。DG6-GFP细胞,小鼠树突状细胞肉瘤低转移细胞(绿色荧光蛋白标记)&&养方法如下：1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。2、置于30&50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。3、把悬液注入离心管室温中直立5&10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细胞密度。5、DG6-GFP细胞,小鼠树突状细胞肉瘤低转移细胞(绿色荧光蛋白标记)&&接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。kl1411&& &M199H &&& &M199H &&& &Medium 199 with Hanks Salts and L-Glutamine && &500 ml&& &ATCCkl1412&& &DMEM && &DMEM && &DMEM with L-Glutamine and Sodium Pyruvate && &500 ml&& &ATCCkl1413&& &DMEM&& &DMEM&& &DMEM with High-Glucose - L-Glutamine and Sodium Pyruvate&& &500 ml&& &ATCCkl1414&& &DMEM &&& &DMEM &&& &DMEM with High-Glucose - L-Glutamine and Sodium Pyruvate && &1L&& &ATCCkl1415&& &DMEM && &DMEM && &DMEM with L-Glutamine - Sodium Pyruvate and 25 mM HEPES&& &500 ml&& &ATCCkl1416&& &DMEM &&& &DMEM &&& &DMEM with High-Glucose - L-Glutamine - Sodium Pyruvate and 25 mM HEPES&& &500 ml&& &ATCCkl1417&& &DMEM-prf&& &DMEM-prf&& &DMEM with High Glucose - L-Glutamine and Sodium Pyruvate - phenol red-free&& &1L&& &ATCCkl1418&& &Ham's F-10&& &Ham's F-10&& &F-10 with L-Glutamine and 25 mM HEPES && &500 ml&& &ATCCkl1419&& &Ham's F-12&& &Ham's F-12&& &F-12 with L-Glutamine and 25 mM HEPES && &500 ml&& &ATCCkl1420&& &DMEM/F-12&& &DMEM/F-12&& &DMEM/F-12 with L-Glutamine && &500 ml&& &ATCCkl1421&& &DMEM/F-12 && &DMEM/F-12 && &DMEM/F-12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES && &500 ml&& &ATCCkl1422&& &RPMI 1640&& &RPMI 1640&& &RPMI &1640 without L-Glutamine - with 25 mM HEPES && &500 ml&& &ATCCkl1423&& &RPMI 1640&& &RPMI 1640&& &RPMI &1640 with L-Glutamine and 25 mM HEPES&& &500 ml&& &ATCCkl1424&& &IMDM &&& &IMDM &&& &MDM with L-Glutamine and 25 mM HEPES; without alpha-Thioglycerol - 2-mercaptoethanol &&& &500 ml&& &ATCCkl1425kl1426kl1427kl1428kl1429kl1430&& &rhSCF&& &重组人干细胞因子&& &Recombinant Human Stem Cell Factor&& &2&gkl1431&& &rhG-CSF&& &重组人粒细胞集落刺激因子&& &Recombinant Human Granulocyte Colony Stimulating Factor&& &2&gkl1432&& &rhGM-CSF&& &重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子&& &Recombinant Human Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor&& &5&g&kl1433&& &rhM-CSF&& &重组人巨噬细胞集落刺激因子&& &Recombinant Human Macrophage Colony Stimulating Factor&& &2&gkl1434&& &rhTNF-&&& &重组人肿瘤坏死因子-&&& &Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-alpha&& &10&gkl1435&& &rhTNF-&-His&& &重组人肿瘤坏死因子-&,His&& &Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-alpha,His&& &10&gkl1436&& &rhTNF-& Vari&& &重组人肿瘤坏死因子-&Variant && &Recombinant Human Tumor Necrosis Factor- alpha Variant && &10&gkl1437&& &rhBAF&& &重组人B细胞活化因子&& &Recombinant Human B Cell Activating Factor&& &5&g&kl1438&& &rhOSM&& &重组人抑瘤素-M&& &Recombinant Human Oncostatin-M&& &2&gkl1439&& &rhOSM 209a.a.&& &重组人抑瘤素-M209a.a.&& &Recombinant Human Oncostatin-M 209a.a.&& &2&gkl1440&& &rhAK1-3&& &重组人血管抑素K1-3&& &Recombinant Human Angiostatin K1-3&& &10&gkl1441&& &rhEndostatin&& &重组人血管内皮抑素&& &Recombinant Human Endostatin&& &2&gkl1442&& &rhaFGF&& &重组人成纤维细胞生长因子--酸性&& &Recombinant Human Fibroblast Growth Factor- acidic&& &10&gkl1443&& &rhbFGF&& &重组人成纤维细胞生长因子--碱性&& &Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic&& &10&gkl1444&& &rhKGF-1&& &重组人角质细胞生长因子-1&& &Recombinant Human Keratinocye Growth Factor-1&& &2&gkl1445&& &rhFGF-9&& &重组人成纤维细胞生长因子-9&& &Recombinant Human Fibrobalst Growth Factor-9&& &5&g&kl1446&& &rhKGF-2&& &重组人角质细胞生长因子-2&& &"Recombinant Human Keratinocye Growth Factor-2"&& &5&gkl1447&& &rhFGF-19&& &重组人成纤维细胞生长因子-19&& &"Recombinant Human Fibrobalst Growth Factor-19"&& &5&g&kl1448&& &rhFGF-21&& &重组人成纤维细胞生长因子-21&& &"Recombinant Human Fibrobalst Growth Factor-21"&& &5&g&kl1449&& &rhIGF-I&& &重组人IGF-I&& &"Recombinant Human IGF-I"&& &20&gkl1450&& &rHuDES1-3/IGF1&& &重组人 DES1-3/ 胰岛样生长因子 -1&& &"Recombinant Human DES1-3/ Insulin-Like Growth factor 1"&& &20&gkl1451&& &rhIGF-BP3&& &重组人 IGF-BP3&& &"Recombinant Human IGF-BP3"&& &5&gkl1452&& &rhLR3IGF-1&& &重组人长R3胰岛样生长因子-1&& &"Recombinant Human Long R3 Insulin-like Growth factor-1"&& &20&gkl1453&& &rhEGF&& &重组人表皮生长因子&& &"Recombinant Human Epidermal Growth Factor"&& &100&gkl1454&& &rhVEGF165&& &重组人血管内皮生长因子165&& &"Recombinant Human VEGF165"&& &2&gkl1455&& &rhNT-4&& &重组人神经营养因子-4&& &"Recombinant Human Neurotrophin-4"&& &2&gkl1456&& &rhCNTF&& &重组人睫状神经营养因子&& &"Recombinant Human Ciliary Neurotrophic Factor"&& &5&gkl1457&& &rhNRG-1&& &重组人 NRG-1（表皮生长因子样结构域）&& &"Recombinant Human NRG-1(EGF-like domain)"&& &10&gkl1458&& &rhErbB3-f&& &重组人ErbB3片段&& &"Recombinant Human ErbB3 Fragment"&& &5&gkl1459&& &rhBTC&& &重组人乙胞素&& &"Recombinant Human Betacellulin"&& &5&gkl1460&& &rhBMP-2&& &重组人骨形成蛋白-2&& &"Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2"&& &2&gkl1461&& &rhBMP-4&& &重组人骨形成蛋白-4&& &"Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-4"&& &2&gkl1462&& &rhBMP-7&& &重组人骨形成蛋白-7&& &"Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-7"&& &2&gkl1463&& &rhOPG-Fc&& &重组人骨保护素Fc融合蛋白&& &"Recombinant Human Osteoprotegerin/Fc Chimera"&& &10&gkl1464&& &rhNOGGIN&& &重组人NOGGIN蛋白&& &"Recombinant Human NOGGIN"&& &5&gkl1465&& &rhGH&& &重组人生长激素&& &"Recombinant Human Growth Hormone"&& &20&gkl1466kl1467kl1468kl1469&& &rmGM-CSF&& &重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子&& &"Recombinant Murine Granulocyte- Macrophage Colony Stimulating Factor"&& &5&gkl1470&& &rmTNF-&&& &重组鼠肿瘤坏死因子-&&& &"Recombinant Murine Tumor Necrosis Factor-alpha"&& &5&gkl1471&& &rmLIF&& &重组鼠白血病抑制因子&& &"Recombinant Mouse Leukemia inhibitory factor"&& &5&gkl1472&& &rmbFGF&& &重组鼠成纤维细胞生长因子-碱性&& &"Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor-basic"&& &10&gkl1473&& &rmFGF-7/KGF&& &重组鼠成纤维细胞生长因子-7&& &"Recombinant Mouse Fibroblast Growth Factor-7"&& &2&gkl1474&& &rmEGF&& &重组鼠表皮细胞生长因子&& &"Recombinant Murine Epidermal Growth Factor"&& &100&gkl1475&& &rmVEGF120&& &重组鼠血管内皮生长因子120&& &"Recombinant Murine Vascular Endothelial Growth Factor 120"&& &2&gkl1476&& &rmVEGF165&& &重组鼠血管内皮生长因子165&& &"Recombinant Murine Vascular Endothelial Growth Factor 165"&& &2&gkl1477&& &rmNOGGIN&& &重组鼠NOGGIN&& &"Recombinant Murine NOGGIN"&& &5&gkl1478&& &rmCXCL16&& &重组鼠CXCL16&& &"Recombinant Murine CXCL16"&& &5&gkl1479kl1480kl1481kl1482&& &rrGM-CSF&& &重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子&& &"Recombinant Rat Granulocyte- Macrophage Colony Stimulating Factor"&& &5&gkl1483&& &rrTNF-&&& &重组鼠肿瘤坏死因子-&&& &"Recombinant Rat Tumor Necrosis Factor-alpha"&& &5&gkl1484&& &rr bFGF&& &重组鼠成纤维细胞生长因子-碱性&& &"Recombinant Rat Fibroblast Growth Factor-basic"&& &10&gkl1485&& &rrIGF&& &重组鼠IGF-I&& &"Recombinant Rat IGF-I"&& &10&gkl1486&& &rbEGF&& &重组鼠表皮细胞生长因子&& &"Recombinant Rat Epidermal Growth Factor"&& &20&gkl1487kl1488
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官方公共微信来源：《细胞与分子免疫学杂志》2003年第05期 作者：王芳,焦新安,顾健,马莉,Richard Lo-Man,Claude Leclerc,刘秀梵
表达GFP的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌体内感染抗原呈递细胞的动态变化
鼠伤寒沙门氏菌是一种具有侵袭力的肠道杆菌 ,可通过消化道小肠黏膜派伊尔结 (Peyer’spatch ,PP)上的M细胞及树突状细胞 (dendriticcell,DC)进入机体 ,然后被巨噬细胞等吞噬细胞吞噬并在其内繁殖。巨噬细胞和DC是专职抗原呈递细胞 (APC) ,通过它们在体内的迁移 ,细菌可进入许多脏器组织 ,如小肠PP结、肠系膜淋巴结、脾脏及肝脏等 ,同时能激发机体免疫系统产生针对细菌的各种免疫应答。减毒鼠伤寒沙门氏菌虽然对动物和人体的毒力降低了许多 ,但仍具有侵袭力。该菌不仅能在体外感染巨噬细胞和DC ,而且在体内也能感染巨噬细胞和DC等细胞 ,并由这些APC呈递抗原于T细胞而产生细胞免疫应答。鉴于目前关于减毒沙门氏菌在体内感染APC的动态变化报道较少 ,我们报道了用表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4 5 5 0 (pYAGFP)口服和静脉注射BALB/c小鼠后 ,感染APC的实验结果。1　材料和方法1.1　材料　表达GFP的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4 5 5 0(pYAGFP)由本室构建[1] 。 6～ 8wk龄雌性BAL......(本文共计3页)
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细胞与分子免疫学杂志
主办：中国免疫学会;第四军医大学
出版：细胞与分子免疫学杂志杂志编辑部
出版周期：月刊
出版地：陕西省西安市绿色荧光蛋白_GFP_的特性及其在分子生物学研究中的应用_薛启汉-海文库
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绿色荧光蛋白_GFP_的特性及其在分子生物学研究中的应用_薛启汉
52江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.),):52～58绿色荧光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物学研究中的应用薛启汉(江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所,南京210014)　　摘　要　作为1种新型、方便的活性标记,来自水母的绿色荧光蛋白(GFP)正在多种原核和真核生物研究中应用。近来研究表明,GFP具有很多理想的特性,适合用作普遍的报告标记,尤其适合于活体细胞或组织。譬如,GFP在细胞中表达,在蓝光或紫外光照射下可以产生明亮的绿色荧光。而且,GFP在细胞中呈自主性表达,没有细胞或位置表达的专一性,无需外源反应底物,无需进行细胞或组织的固定和渗透处理,使表达检测很方便。由于GFP对光漂白、氧化剂、还原剂以及其它许多化学试剂具有极强的稳定性,因此,可用来监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。关键词　绿色荧光蛋白(GFP);分子生物学中图法分类号　Q71CharacteristicsoftheGreenFluorescentProtein(GFP)andItsApplicationinMolecularBiologyResearchXUEQihan(InstituteofAgrobiologicalGeneticsandPhysiology,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014)　　Abstract　Thegreen-fluorescentprotein(GFP)fromjellyfishAequoreavictoriahasbeenusedasaconvenientnewvitalmarkerinawidespectrumofprokaryotesandeukaryotes.TheGFPgenehasrecentlybeenshowntopossessamunberofdesirabletraitsasauniversalreporterespeciallyinlivingcellsandtissues.Forexample,GFPexpressedincellscanyieldabrightgreenfluorescencewhenthecellsareexcitedbyblueorUVlight.GFPexpressioniscellautonomousandindependentofcelltypeandlocation,whichmakesitsdetectioncovenientwithoutneedofexogenoussubstrates,cellfixationandpermealization.Morever,GFPwithmorestabillitytophotobleaching,oxidation/reduction,andchemicalreagentsetc.canbeusedinmonitoringgeneexpression,signaltransduction,co-transfection,transformation,proteintraffickingandlocalization,protein-proteininteraction,cellseperationandpurification,andcelllineageetc.ThecharacteristicsofGFPanditspotentialapplicationinmolecularbiologyresearchweremainlyreviewedinthispaper.　　Keywords　gremolecularbiology　　生物发光现象,在无脊椎动物中很普遍。它是生物能量的一种转换方式[1,2]。在水母(Jellyfish)中,当能量从Ca++活化的水母蛋白(Aequorin)转移到绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein,简称GFP)可GFP具有相同光谱特性,即吸收蓝光,放射绿光。薛启汉:男,56岁,大学,研究员。:薛启汉:绿色荧光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物学研究中的应用53以用紫外灯、荧光显微镜或荧光活化流体分光光度计进行活体检测[5]。由于GFP稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性,因此它是一种独特的报告蛋白(Reporterprotein),可广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域。90年代后,有关GFP及其利用的研究进展较快,已引起分子生物学家极大的兴趣与关注。述GFP的一些基本特性、研究进展,以及在分子生物学研究中的应用前景。1　GFP的结构、特性与功能1.1　GFP的结构PrasherDC首先克隆了水母Jellyfish(Aequoreavictoria)GFP的cDNA[6]。cDNA克隆的序列分析(图1)表明,GFP编码的238个氨基酸的多肽单体,推导分子量Mr=26888,
与先前用变性电氨基酸序列下方横线部位表示从天然GFP直接测定的序列。ThehorizontallinesunderlinethoseaasequenceddirectlyfromnativeGFP.图1　gfp10DNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列[6]Fig.1　Nucleotidesequenceofthegfp10DNAandthededusedaasequence[6]泳测得的天然GFP分子量(30KDa)接近。根据DNA序列推导的氨基酸序列与大部分天然GFP的多肽片段相同。只有完整的GFP分子才会产生生物荧光,但与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为色基(Chromophore)的部位(图2)。在GFP的初级氨基酸序列上,第65～67个氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成环状六肽三体,以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连。色基形成的机理目前尚不清楚,但在有分子氧存在的条件下,酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸,并环化形成六肽,这可能是形成色基的必然过程[8]。Shimomura最先推导了水母GFP色基结构[9],后来Ward等进行了进一步验证与修改。GFP的cDNA克隆序列分析表明,在2.6kb范围内至少分布有3个启动子,组成色基的Ser-Tyr-Gly三体就[7]HOCHNOCH2OOCHCH3CH3NH22OH2NH2CH2OH2图2　GFP色基的结构及附近序列[6]Fig.2　StructureoftheGFPchromophoreandnearlysequence[6]1.2　GFP的光谱特性GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧()54江苏农业学报　1999年第15卷第1期盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。尽管450～490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测。Chroma技术公司(ChromaTechnologyCorp.Brattlebore,VT05301,USA)已研制出一系列适合[10,11,12]于GFP观察的滤光片组合。利用重组突变和数字联想分光显微镜(DigitalImaging[13,14,15]可以诱发GFP色基突变,Spectroscopy)技术改变GFP光谱特性。HeimR等获得了野生型GFP的一系列随机突变,其激发波长和发射波长都发生了变化(表1)。如获得的蓝色荧光突变,就是原GFP分子中表1　野生型GFP突变的特性[16]Table1　CharacteristicsofmutatedVS.wild-typeGFP[16]绿色荧光蛋白GFP1)野生型Wildtype突变Mutation无None激发光谱发射光谱相对荧光最大值最大值RelativeExcitationEmissionfluorescencemaxima(nm)maxima(nm)(%)396(476))471(396)382458508(503))502(507)448480(=100)未测Nondetermine[16,17]内,仍会发生光漂白现象。GFP在不同物种中稳定性不同,在果蝇和斑纹鱼(Zebrafish)中极稳定;在大肠杆菌中会有光漂白;在线虫中10mM的NaN3将加速光漂白。GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂如5mMNa2S2O4或2mMFeSO4能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂,如2%巯基乙醇、10mMDDT、10mM还原谷胱甘肽、10mM半胱氨酸等并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等,但GFP对某些封片指甲油特别敏感,苯氧丙烷对GFP荧光也有影响。强氧化剂如1%H2O2,或硫氢基试剂如1mMDTNB会造成[20]大多数中等浓度的有机试剂GFP不可逆性破坏。不减弱GFP荧光,但其最大吸收峰值会改变[21]。在高蛋白、高盐条件下,GFP通过疏水反应形成二聚体,使470nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易从细胞中分离并结晶[22]。在离体状态下,GFP蛋白对热(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通蛋白酶(链霉蛋白酶Pronase除外)有较强抗性[23]。GFP荧光在pH值为7～12时稳定,在pH值为5.5～7.0时开始受影响[24]突变体H9Ser-202→PheMutantH9Thr-203→Ile突变体P9Ile-167→ValMutantP9突变体P11Ile-167→ThrMutantP11突变体P4MutantP4突变体WMutantWTyr-66→HisTyr-66→Trp。在纳克级水平,SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中仍能观察到GFP荧光。在高温、极端pH、或胍基氯化物条件下,GFP会变性,荧光消失。一旦复性,荧光会部分恢复[25],但可能需要某些硫醇类化合物的作用。GFP在各种生物活体条件下表现稳定。例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)在生物体内很稳定,用35S-甲硫氨酸分别标记CAT和GFP,并转染玉米叶肉原生质体,用放线菌酮处理原生质体,通过CAT检测,发现5～10Lg/ml放线菌酮可完全抑制CAT在玉米原生质体中的蛋白合成,但通过GFP观察,转染24小时后,仍未发现GFP荧光有明显减弱,仅有部分GFP被放线菌酮降解。说明GFP在植物活体细胞中比CAT还要稳定[27]。此外,尽管GFP的消光系数较低,但和荧光素一样,额定含量可高达80%。在荧光显微镜下,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。[26]括号内数字为实测波长变化范围。Bracketeddataindicatesthevariableextentoftestedexcitationspectra.1)GFP=GreenFluorescentProtein.第66个氨基酸由酪氨酸突变成的组氨酸,但荧光信号减弱了近50%。DelagraveS获得的红色漂移(Red-shifed)突变,与野生型GFP相比,其激发波长向红色方向漂移了近100nm[18]。具有不同光谱特性的GFP突变体的获得,使在同一细胞中同时分析两种不同蛋白或启动子成为可能,可以用于发育细胞学、药物筛选、分析诊断等研究。1.3　GFP的稳定性GFP荧光极其稳定,在荧光显微镜强光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强。特别在450～490nm蓝光波长,[19]薛启汉:绿色荧光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物学研究中的应用55不需要任何外源反应底物,因此GFP是迄今为止唯一一种活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。明GFP作为报告基因,其表达不受生物类型、基因型或细胞组织类型的限制,具有广泛的利用前景。2.2　GFP作为报告蛋白用于基因表达的调控效果研究　　Clontech公司构建了一种叫启动子报告载体(Promoterreportervector)即没有启动子的GFP质粒,专门用来测试各种启动子对GFP表达的效率,以及某些增强子对GFP表达的调控效果。发现用玉米C4PPDK基因5′端的非翻译片段(5′VTR)与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接,GFP在玉米原生质体中的表达效率比对照质粒(只有35S启动子)提高近15倍,因为5′VTR片段中含转录增强子。用拟南芥菜热体克(Heat-shock)基因启动子构建GFP表达载体,用以转化玉米原生质体。发现42℃热激处理中50%原生质体表达GFP荧光;37℃处理的荧光较弱;而常温下培养,则完全观察不到原生质体中的GFP荧光。在高等植物遗传转化的基因表达调控研究中,已有很多报告蛋白被应用,包括LacZ(B-[35](Chloramphenicolgalactosidase)、CATacethytransferase)[36]、Luc(荧光虫Luciferase)[37,38]和GUS(B-glucuronidase)[39]2　GFP在分子生物学研究中的应用2.1　GFP作为报告基因用于转基因研究　　自PrasherDC从水母(A.victoria)中克隆了GFP的cDNA后,GFP能在原核和真核细胞中表达的表达载体相继被构建成功。ChalfieM构建了GFP大肠杆菌表达载体,GFP基因在T7启动子控制下很容易在大肠杆菌中高效表达。从转染的大肠杆菌中分离的GFP蛋白与水母的天然GFP离体光谱特性无差异。利用维管蛋白(B-tubulin)基因mec-7启动子构建表达载体,转染线虫(Caenorhabditiselegans),在幼虫的4种胚性起源触觉受体神经元细胞中,观察到很强、很稳定的GFP荧光,包括部分2龄幼虫、所有4龄幼虫和绝大多数幼小成虫。据报道,GFP基因在酵母(Saccharomycescerevisiae)、果蝇(Drosophilamelanogaster)以及多种哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞系、人体胚性肾细胞系、猿猴Cos-1细胞系以及鼠NIH3T3细胞系等)中表达,都相继成功[20,29,30,31,32]。等。但这些报告蛋白都GFP在高等植物中的利用较晚,表达成功的例子还不多。SheenJ等报道,通过电击法(Electroporation)转染玉米叶肉原生质体,有50%原生质体观察到GFP荧光,集中在细胞质或核周围部。紫外光下液泡显蓝色荧光,蓝光下叶绿体显红色荧光,出现黄色荧光是叶绿体红色荧光与GFP绿色荧光的重叠效果。HuW也报道,用电击法和PEG法同时转化玉米和拟南芥菜(Arabidopsis)原生质体,GFP在玉米原生质体中表达,但PEG介导比电击法转化效率高,而拟南芥菜原生质体中未观察到GFP表达。不过SheenJ等利用基因枪(Microprojectilebombardment)轰击拟南芥菜完整叶片和根组织,观察到活体GFP荧光。NiedzRP等用电击法转化甜橙(Citrussinensis)原生质体,450～490nm蓝光下观察到20%～60%原生质体发生较强绿色荧光[34]。此外,也有GFP在菸草、水稻中表达的报道。GFP在多种原核和真核生物细胞中表达,表明GFP色基形成的翻译后修饰过程并非需要原有水母(.)[33]是酶,其表达产物的检测都需要进行细胞固定、组织切片或蛋白提取等破坏性处理,很难用于活体观察和检测。GFP作为一种活体报告蛋白[40],用于研究基因表达的调控,明显具有其它报告蛋白不可替代的优点。2.3　GFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用　　异质蛋白可以和GFP的N-端或C-端连接组成融合蛋白。GFP融合蛋白既保留了异质蛋白的固有特性,也保留了GFP的正常活性。因此,GFP融合蛋白,实际上可作为一种“荧光标签”用来研究蛋白质在细胞中的定位、转移、相互作用等内容。Clontech公司构建了6种GFP融合蛋白载体。KaimSR利用GFP融合蛋白载体研究细菌致病性,即用GFP融合蛋白载体转化沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium),再侵染人的HEP-2细胞,并用若丹明(rhodamine-phalloidin)染色,在荧光显微镜下观察。若细菌只侵染到细胞表面,只在细胞表面呈现绿色荧光(GFP表达信号);若细菌已侵入细胞内部,56江苏农业学报　1999年第15卷第1期光与细胞若丹明染色的红色荧光的重叠效果。因此,利用GFP融合蛋白为“荧光标签”,可以直接活体观察到细菌蛋白和报告蛋白在细胞中的确切位置,以表明细菌在活体细胞中的侵染状况。同样原理,Youvan构建了菸草花叶病毒和GFP的融合蛋白载体TWV-GFP。BanlcombeDC构建了马铃薯X病毒和GFP的融合蛋白载体PVX-GFP[41]接种菸草(N.clevelandii)1～2天后,在紫外光下可以直接观察到病毒侵染的确切部位。再用首次感染的菸草汁液接种另一种菸草(N.benthamiana),观察到已放大的第二次系统感染的绿色荧光斑点。叶片提取液蛋白电泳凝胶在紫外光下也能见到GFP荧光信号,从感染叶片中回收的病毒经鉴定,确认为PVX-GFP。构建载体时,直接用GFP基因替代病毒外壳蛋白基因,接种后观察到GFP绿色荧光只局限于接种的细胞部位,不扩散。证实了早先的论断,即PVX外壳蛋白对于病毒在寄主细胞内的增殖,以及在细胞间的移动、扩展是不可缺少的条件[42,43,44,45,46,47]。显然,GFP融合蛋白作为一种报告标记,可以为病毒学研究,或以病毒载体为途径研究外源基因在转基因生物细胞中的表达及蛋白质定位,提供理想的工具[48,49,50]达的GFP信息,即可代表某种组织的信息。采用发育专一性启动子构建GFP表达载体,可以将这些具有基因表达特异性的细胞类型分离出来。利用不同表达文库转染原生质体,通过流体参数分析和细胞分类,可以揭示在信号传导途径中所包含的许多反方活化因子(trans-activatingfectors)。GFP在生物学和分子生物学研究中的利用还不仅仅局限于上述几个方面。随着研究的深入开展,其广泛利用的潜力将不断表现出来。3　GFP应用中的问题及注意事项　　野生型GFP的cDNA(gfp10)中GFP编码序列的框架结构会抑制GFP表达。在构建GFP表达载体时可以将其修饰成Kozakconsensus,以提高GFP在真核细胞中的翻译效率[53]。长时间的高强度激发光可能使GFP产生自由基(Freeradicles),对细胞有毒害。可选用450～490nm长波光激发,将其减少到最低程度。GFP表达荧光强度可能会产生变异和不稳定,影响因素之一可能是缺乏分子氧,致使GFP色基形成缓慢。此外,细胞的培养环境往往会影响GFP表达效率,如大肠肝菌在24℃或30℃下培养,GFP表达效率会明显高于37℃培养的菌落。有些研究者在自己的GFP转化体系中未能成功地观测到GFP荧光信号,可能有多种原因,包括表达载体构建不合理、使用的荧光显微镜滤光片组合不合适、GFP在转染细胞中表达量过低,以及样品或塑料容器的自然荧光干扰或激发光受阻等。目前科学家正在致力于构建表达水平更高,特别是适合于高等植物遗传转化的GFP载体。参考文献1　MoriseJG,ShimomuraO,JohnsonFH,etal.IntermolecularenergytransferinthebioluminescentsystemofAequouea.Biochemistry,6～26622　WardWW.Energytransferprocessinbioluminescence.In:SmithKC.ed.PhotochemicalandPhotobiologicalReviews.NewYork:Plenum,～573　WardWW,CormierMJ.Energytransferviaprotein-proteininteractioninRenillabioluminescence.Photobiochem.Photobiol.～3964　WardWW,CodyCW,HartRC,etal.SpectrophotometricidentityoftheenergytransferchromophoresinRenillaandAequoreagr.Photobiochem,。与传统的荧光抗体相比,GFP不仅灵敏度高,不需要反应底物,还可以消除因抗体与非靶位点结合带来的背景荧光的干扰。2.4　GFP报告蛋白用于细胞活体分离与纯化利用细胞表面标记,通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪(FACS),可以分离与纯化特殊类型细胞,对分析cDNA文库、研究基因的细[51,52]胞发育或组织专一性表达十分重要。利用GFP融合蛋白为细胞表面活体荧光标记,通过筛选已经获得GFP表达的大肠杆菌、人体肾细胞和猿猴COS-1细胞特殊类型。SheenJ等在GFP转染玉米原生质体的流体参数分析中发现,转染15～18小时后,对照中只有一类细胞丛,表现较强红色荧光和微弱的绿色荧光,并且细胞间荧光强度相当一致,没有明显差异。而GFP转染的原生质体中出现两类细胞丛,第一类与对照相似,呈现红色荧光,约占细胞总数66.3%;第二类细胞丛呈现绿色荧光,荧光强度是对照的74倍。因此,用流式细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪(EpicsElite,ConlterElectronics,MiamiFL,USA)很容易将两类细胞分离开来。原薛启汉:绿色荧光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物学研究中的应用5　ChalfieM,TuYT,EuskirchenG,etal.Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpression.Science,～8056　PrasherDC,EckenrodeVK,WardWW,etal.Gene,～2337　CodyCW,PrasherDC,WeslerWM,etal.ChemicalstructureofthehexapeptidechromophoreoftheAequoreagreenfluorescentprotein.Biochemistry,2～12188　DelagraveS,YouvanDC.Searchingsequencespacetoengineerproteins:Exponentialensemblemutagenesis.Bio/Technology,8～15529　ShimomuraO.StructureofthechromophoreofAequoreagreenfluorescentprotein.FEBSLetters,～22210DelagraveS.GoldmanER,YouvanDC.Recursiveensemblemutagenesis.ProteinEngineering,～33111HemsleyA,ArnheimN,ToneyMD,etal.Asimplemethodforsitedirectedmutagenesisusingthepolymerasechainreaction.NucleicAcidsResearch,6～655112LnouyeS,TsujiFI.Expressionofthegeneandfluorescencecharacteristicsoftherecombinantprotein.FEBSletters,～28013GoldmanER,YounvanDC.Analgorithmicallyoptimizedcombinatoriallibrayscreenedbydigitalimagingspectroscopy.Bio/Technology,7～156114YouvanDC,GoldmanER,DelagraveS,etal.Digitalimagingspectroscopyformassivelyparallelscreeningofmutants.MethodsinEnzymology,～74815YouvanDC.Imagingsequencespace.Nature,～8016HeimR,PrasherDC,TsienRY.Wavelengthmutationsandposttranslationalautoxidationofgreenfluorescentprotein.ProcNatlAcadSciUSA,01～1250417HeimR,CubittAB,TsienRY.Improvedgreenfluorescence.Nature,～66418DelagraveS,HawtinRE,SiivaCM,etal.Red-shiftedexcitationmutantsofthegreenfluorescentprotein.Bio/Technology,～15419WangS,HazelriggT.ImplicationsforbcdmRNAlocalizationfromspatialdistributionofexuproteininDrosophilaoogenesis.Nature,～40320InouyeS,TsujiFI.EvidenceforredoxformoftheAequoreagreenfluorescentprotein.FEBSLetters,～21421RobartFD,WardWW.SolventperturbationsofAequoreagreenfluorescentprotein.PhotochemPhotobiol,s22PerozzoMA,WardKB,ThompsonRB,etal.X-raydiffractionandtimeresolvedfluorescenceanalysisofAequoreagreen-fluorescentproteincrystals.JBiolChem,3～771623WardWW.Propertiesofthecoelenterategreen-fluorescentproteins.In:DelucaM,McElroyWD.eds.Bioluminescence:PrimarystructureoftheAequoreavictoriagreen-fluorescentprotein.57applications.NewYork:AcademicPressinc,224BokmanSH,～138025WardWW,BokmanSH.ReversibledenaturationofAequoreagreenfluorescentprotein:physicalseparationandcharacterizationoftherenaturedprotein.Biochemistry,5～454026SurpinMA,WardWW.ReversibledenaturationofAequoreagreen-fluorescentprotein-thiolrequirement.PhotochemPhotobiol,49:WPM-B227SheenJ,HwangS,NiwaY,etal.Green-fluorescentproteinasanewvitalmarkerinplantcells.ThePlantJoumal,～78428FlachJ,BossieM,VogelJ,etal.AyeastRNA-bindingproteinshuttlesbetweenthenucleusandthecytoplasm.MolCellBiol,9～840729KainSR,AdamsM,KondepudiA,etal.Greenfluorescentproteinasareporterofgeneexpressionandproteinlocalization.Biotechniques,～65530MossJB,RosenthalN.Analysisofgeneexpressionpatternsintheembryonicmousemyotomewiththegreenfluorescentprotein.JCellBiochem,9(abstract)31RosarioR,BriniM,PizzoP,etal.Chimericgreenfluorescentproteinasatoolforvisualizingsubcellularorganellesinlivingcells.CurrBiol,～64232StearnsT.Thegreenrevolution.CurrBiol,～26433HuW,ChengCL.ExpressionofAequore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