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两种导致中国人地中海贫血的新突变基因的鉴定
第一军医大学 硕士学位论文 两种导致中国人地中海贫血的新突变基因的鉴定 姓名：贾世奇 申请学位级别：硕士 专业：医学遗传学 指导教师：徐湘民
英文缩略词袭英文缩写 ｂｐｃｍ℃ＤＮＡ ｄＮＴＰＥＢ嚣转ｉ麓Ｇ ａａｐ―ＰＣＲ Ｈｂ ｋｂ Ｌ．ｉＭ．ｍｉｎ ＭＣＨ氛瑗Ｃ珏ＣＭＣＶｍｇ ｍｌｍｍＭｎｇｎｌ中文全称 ｂａｓｅ ｐａｉｒ 碱基对 ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ 厘米 摄氏发 ｄｅｇｒｅｅ（ｓ）ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ 脱氧援耱孩酸 ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｅｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ 脱氧三磷酸核糖核 酸 ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ 溴化乙键 乙二黢器｜乙酸 ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ 克，徽力加速度 ｇｒａｍ，ｇｒａｖｉｔｙ 跨越断裂点ＰＣＲ ｇａｐ ｐｏｌｙｍｅｍｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ 血红鬣自 ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｋｉｌｏｂａｓｅ 子碱慕辩 ｌｉｔｅｒ 舞 ｍｕｎｉｔｅ 分钟 ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ 平均纽细胞血红鬣 白量 ｍ凇ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ平缘缎缓施盘筑鬣 ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ 白浓殿 ｍｅａｎ ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ ｖａｌｕｍｅ 平均数细胞体积 毫克 ｍｉｌｌｉｇｒａｍ ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ 毫舞 ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ 微升 毫摩尔没升 ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒｐｅｒ ｌｉｔｅｒｎａｎｏｇｒａｍ荚文全称纳克ｍｉｃｌｅｏｔｉｄｅｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙＯＤｐＣＲｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｏｗｅｒ ｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎｒｅｄｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｒｅｃｅｒｓｅｐａＲＢＣ黼ｌ∞Ｗｒｐｍ ｌｔＮＡｄｏｔ ｂｌｏｔｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅｉｎｄｅｘ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｃｉｃ ａｃｉｄ核营酸 竞密嶷 聚合酶链反应 ｐｎ值 一红细胞 反自袋杂交 ｗｉｄｔｈ红细稳分布宽凄指 数 每分钟转速 核糖缓羧２攮背景和目的要地中海贫傲（地贫）趋～种珠蛋白链合成比例失獭的单基因 遗侮癍，豢受镶臻蛋鑫豹不弼分隽程遮贫帮ｔ３遗贫嚣大炎。均呈 常染色体隐性遗传，伐地贫主要由发生于１６号染色体短臂末端旺 珠缀白基因簇内包含ｎ基因猩内的缺失引超，少数由点突变引起， §趣贫主要由发生予位于ｌｌ－譬染色俸短爨蛇１３基因内的点突变ｇ｝ 麓。世界范围内遗贫分布予热带、亚热带缝区，并麓缝贫基因类型存在地域差异，如地中海沿岸国家ａ地贫以ｏ ７／ｔｍ、一ＭＥｏ／眦为主，丽东南亚圊家以一ｓＥ“，（蛾、一证３１７／帆、，∥２庙啦为主。农我国，地贫多发生予长江激蠢逸送，楚荚鞋广东、广器、海豢麓疑发，毡邀贫基因型以缺必型突变一ｓＥ６／眠．Ｃｔ３。，呱。舻。恤为主，点突变毡ｃｓａ／嗽ＯＣＱ８ａ触也比较常见，Ｂ地贫突变类烈以ＣＤ４１／４２（．ＴＣＴＴ）、ＩＶＳ－２．６５４（Ｃ－》Ｔ）、一２８（Ａ峥Ｇ）、ＣＤ７１／７２（＋Ａ）、１３５：ＣＤ２６（Ｇ÷∞、ＣＤｌ７《Ａ斗秘激为常觅。丽辩一些罕觅翡突变基茵魏伐邀贫基因 ．带’１／ａａ、１３地贫慕因ＣＤ３７ ＴＧＧ＂－）ＴＧＡ不断被报道，遮魑罕见突变 錾因类型是对常见突变的充实和必要补充，对于了解一个地区的 遮贫基毽突交漤，建立可蹙戆途贫基因诊獗菝拳其鸯熬要意义。 时罕见突变基图的鉴定，不断完善对地贫基因谱的认识将是一项 长期而连续的工作，需要机遇、职业敏感和不懈的努力。 导致地贫的罕见突变基强螅鉴定主要蠢２个来源。一是来源 予绉床瘸久，二是来源予大入群速贫基闲筛查。最：ｉ篷，在我饲避 行的广东省５个中心城市ａ、Ｄ地贫流彳亍痫调查和四会市ａ、Ｂ地 贫现场调查的撼础上，获得糟干具有ａ或Ｂ地贫临床液型但采用镑黠中国入露凳圭｜羹贫类墼戆簇霞诊凝寒发现突变豹撵本，我销辩这些样本进行了突变的鉴定和ｍＲＮＡ表达水平的研究。 设计和方法 采蔼整群攘样懿方法，对５６０５镶黪巍祥本霸７７９２镤婚硷祥零逡行盘滚学表囊分聿厅结会审强入中鬻羹豹瓠８建贫鏊霾簿查毂 流行病学调查繁础上，获得衄液学表型呈小细胞低色素，ＨｂＡ２增 高（Ｂ地贫）或降低（“地贫）而没有已知地贫基因型改变的样本， 包括４例珏地贫德确诊样本ｊ｝珏５侧Ｂ地贫德确诊样本。对于程地贫德确诊样本，采取瓯、Ｃ‘２纂霆溺痔簿森泰絮豹点突变，采翅铮对罕见缺失类趔的ｇａｐ．ＰＣＲｑ≮０ｕｔｈｅｍ ｂｌｏｔ和跨断裂点测序的方法 筛焱大片段缺必和确定精确的断裂位点。对于Ｂ地贫待确诊样本， 采惩§臻蛋鑫麓因全长溅净戆方法，筛焱泰知焘突变。逶逑上述 方法鉴定的新的突变基因采用ＲＴ－ＰＣＲ方法研究突变对珠蛋自基因功能的影响。缝暴帮谗谂 获得了一种新的缺失¨＋ｌｋｂ包括ｎ１、￡ｔ２基因在内的Ｇｔ地贫基 因和一种在中阐人群中首次发现的位于６珠蛋白基因启动子区一９０ 位瞧Ｃ＇－）Ｔ突变基医，并在ＧｅｎｅＢａｎｋ淫冕晕，注煺号分别为： ＡＹ３４２３９２、ＡＹ２６０７４０。ＲＴ－ＰＣＲ显示携带铰失１ｌ。ｌｋｂ豹镊突变辇因的患者其Ｃｔ藏因ｍＲＮＡ淡达水平与基网型为～８“／眦患者相当，而明显低于正常对照组；携带，９０突变的Ｂ地贫患者其ｐ珠蛋白基 瓣ｍＲＮＡ表这拳平饔显簿稳。魏羚，我们ｊ丕获终了氆ｌ鞣蛋鑫基嚣 密码子１１８饿斗ＴｃＡ插入突交，并注册（ＧｅｎｅＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＡＹ２６１６７８）；程中国大陆首次发现了一。ｎ协‰地贫类型。这些突变簇因瓣发现丰察了地中海贫斑的基因类淤，加深了对中国人群中 魏贫类墅豹试识，为墓嚣诊辑提供了必鬟豹分子墓镶，目对为串 融人群地贫基因的分子进化机制的研究提供了参考。 关键诿ＤＮＡ测序毡遮中海贫盘毅突变基因Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ ＲＴ－ＰＣＲ§遣孛海贫搬凝突变基毽 基因诊断４Ａ器ＳＴ嚣ＡＣ薯Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｕｎｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｈａｉｎｓ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｌ／ｌＯｎ ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｏｐｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｍｉｔｒｏｐｉｃａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ．Ｉｔ ｉｓａａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅｉｎｈｅｌｉｔａｎｃｅ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄｉｓ ｄｅｆｉｎｅｄｂｙ ａｌｐｈａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ａｌｐｈａｏｒｂｅｔａ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ ｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｒｅａｓｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｏｆｔｈｅ ｗｏｒｌｄ．ａｒｅＩｎ ｃｈｉｎａ，ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆａｌｐｈａｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ～８ＥＡ／Ｕａ、．ｃｔ３．７／ａａ、ａｎｄ．∥一／ａｃｔ，ｗｈｉｃｈｃａｕｓｅｄ ｂｙｄｅｌｅｔｉｏｎ，ａｎｄ∥８０ｔ／ｅ．ａ、≯８ａ／ｅａ，ｗｈｉｃｈｃｏｍｍｏｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆｃａｕｓｅｄ ｂＹ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ。Ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔａｒｅｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａＣＤ４１／４２（?ＴＣＴＴ）、ＩＶＳ一２―６５４（Ｃ－－＞Ｔ）、一２８（Ａ砷Ｇ）、ＣＤ７１／７２（＋Ａ）、旷：ＣＤ２６（Ｇ－－＞Ａ）、ＣＤｌ７（ＡｊＴ），ｗｈｉｃｈｓｏｍｅａｌｅａｌｌ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｏｆｆｅｒ ｕｐ ９０％ｏｆ ｔｈｅａｒｅａｌｌ ｂｅｔａ ｔｈａｔａｓｓｅｍｉａ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｈｉｎａ．Ｈｏｗｅｖｅｒ ｔｈｅｒｅ ｓｔｉｌｌ ｎｏｖｅｌｏｒｒａｒｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｃｃｕｒｒｅｄｉｎａｌｐｈａｏｒｂｅｔａｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｂｅｉｎｇｆｏｕｎｄｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ．ｓｕｃｈ ａｓ一一’７／ｍ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅａｌｐｈａ ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ＣＤ３７ ＴＧＧ－）ＴＧＡ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｓｅ ｎｏｖａｏｒ ｌ＿＿ｒｅｆｏｕｎｄｉｎ ｂｅｔａ ｇｌｏｂｉｎｍｎｔａｔｉｏｎｓａｌｅｏｆ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｉｍｐｏｒｔａｎｃｅａｆｏｒ ｍａｐｐｉｎｇｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｏｆｃｅｒｔａｉｎ ａｒｅａｓ，ｗｈｉｃｈ ｂｅｎｅｆｉｔ ｔｏｏｒ ｔａｌｅｇｅｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ａＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｓｌｏｎｇ―ｔｅｒｍａｎｄｓｅｒｉａｔｅ ｗｏｒｋ，ｗｈｉｃｈ ｎｅｅｄｓ ｃｈａｎｃｅ，Ｉｃｅｅｎｎｅｓｓ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ａｎｄｈａｒｄ ｗｏｒｋ．Ｔｅｓｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈｔｈａｌａｓｓｅｍｉａＲｅｃｅｎｔｌｙ，ｔｒａｉｔａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｏｐｌｅ ｉｎｏｒ ｒａｒｅｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓａｌｅｔｗｏ ｗａｙｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｗｅｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓｃａｕｓｉｎｇｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．ｐｅｒｆｏｒｍａｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａａｎｄｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎ ＥＶｅ ｃｉｔｉｅｓ ｂｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄａｌｏｃａｌｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｈｕｉ ｃｉｔｙ ｂｙ５ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｗｏｒｋｓ．ｗｅ ｇｏｔ ｓｏｍｅｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｌｌａｌｐｈａｏｒｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｔｒａｉｔ ｂｕｔｎｏｋｎｏｗｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｅｅｎ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅｓｅａｓｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅｎ ｗｅ ｕｓｅｄ ＤＮＡ ｍａｐｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｓｕｃｈｇａｐ?ＰＣＲ ａｎｄｓｏｕｔｈｅｍ ｂｌｏｔ，ｎｏｖｅｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｉｓ ｕｓｅｄｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ａｆｔｅｒ ｔｈｅｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄｍｅｔｈｏｄ：ｃｌｎｓｔｅｒＡｂｏｕｔ ５６０６ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇｓａｍｐｌｉｎｇ ｉｓ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ７７９２ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｌｌｅｃｔｐｅｒｉｐｈｅｍｌｓａｍｐｌｅｓ． ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓｓｔｕｄｙ．Ｗｅ ｐｅｒｆｏｒｍ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｔｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｂｌｏｏｄａｎｄ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｂｙｇａｐ―ＰＣＲａｎｄ ＲＤＢ ａｉｍｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｏｕｔｈ ｃｈｉｎａ．Ｔｈｅｓａｍｐｌｅ ｗｈｉｃｈ ｈａｅｍａｔｏｌｏ＃ｃａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄ２ｉｓ ａｂｎｏｒｍａｌ ｂｕｔ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｓ‘ｎｏｒｍａｌ’ｉｓ ｔｅｓｔｅｄ ｆｕｒｔｈｅｒ．Ｔｈａｔ ｉｓ，ｃｏｒｄｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓａｒｅｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ 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ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｉｓ―ｍｕ／眦ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｉｎｌａｎｄ ｏｆ Ｃｈｉｎａ．Ｏｕｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔ ｔｏ ｔｈｅ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎ Ｃｈｉｎａａｌｅａｎｄｉｎ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ．Ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙｔｈｅ ｂａｓｅｓ ｏｆｇｅｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅｔｈｅｙａｒｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐｅｏｐｌｅ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｎｏｖｅｌ ａｌｐｈａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＢｌｏｔＲＴ－ＰＣＲＧｅｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ７第一部分：一种新的导致ｑ地中海贫血的突变基因的鉴定引言Ⅱ珠蛋白基因簇位于１６ｐ１３．３，从１６号染色体末端到近端，基因簇内基因排列顺序为，ＨＳ－－４０、‘、、ｌ，‘ｌ、Ｖａ２、¨ｌ、０１２、ａｌ和０－基因。这些基因起源于同一原始基因，并且在进化过程中还存在 以交换固定和基因转换为机制的协同进化，因此，各基因尤其是 人类珠蛋白‘与ｖ‘－之间，０，２与ａ１之间高度同源。ｃ【珠蛋白基因簇 中的这些同源性是同源重组、导致ｎ珠蛋白基因簇发生缺失，引 起０【地贫的主要分子基础【”。ｎ珠蛋白基因簇内存在众多的Ａｌｕ、随机重复序列，在这些序列中也发现存在同源重组，导致ＤＮＡ序列缺失的现象，此外，非同源重组导致的缺失也常见于ａ地贫。 ０【地贫主要分布在地中海沿岸国家和相同纬度的世界其他热 带、亚热带地区。ａ地贫主要由发生于０‘珠蛋白基因簇内的大片段 缺失引起，少数是由于发生于毗或ｎ，基因内的点突变引起。目前 全世界已经报道的ｃｃ地贫基因单倍型有１００余种，其中缺失型ｏｒ， 地贫基因已有３５种，但地贫基因型分布存在地域和种族差异，各 个地区有其常见的突变谱。在中国人中至少发现有４中扩地贫基 因和９中Ⅱ＋地贫基因，最常见的ａｏ地贫突变基因为．＿ｓｒＡ／其次为 一７ＨＡＩ／和．－Ｆ“／。常见的ａ＋地贫基因为一矿‘７／、．一２／和０ｃｃ８“、仪Ｑ８Ⅱ／其 中后两种由点突变引起。在我国南方一８Ｅｘ／、．ａ３’７／、．∥２／为最常见 的Ⅱ地贫基因类型，占所有引起地贫的突变基因的９０％以上［２】。 其中～ｓＥＡ／是由于发生于珠蛋白基因簇内的非同源重组事件引起 的，缺失了包括Ⅱｌ、０１２基因在内的约为２０ｋｂＤＮＡ片段，上游断裂 点位于２６２５９位（ＮＧ ０００００６），下游断裂点位于４５３９位（ＮＴ０３７８８７）。．０３．７／是发生于Ⅱｌ、０１２基因内的同源重组事件引起的，缺失了约３．７ｋｂ片段。而―旺４ ２／Ｎ是由于发生在‰“基因下游和馓莲嚣下游抟裹发弱源序裂波熬霹滚熏缀莓ｌ起瓣，缺必‘ｒ包含戳 藏因的约４．２ｋｂ的片段。由予．矿。，和－ａ＊２／Ｎ种缺失发生在高度同源 的序列内，精确的缺失发擞位点难以定位。中国人中一些罕见的 弓ｌ起疆地贫的突变类型也稳报道［３，９－１１］。 不同基因辍的￡ｃ地贫患者，有不弱瀚稿床表现，伐趣贫韵病理 生理基础为伐珠蛋白基因的缺失（少数鼹点突变）造成的Ｃｔ珠蛋 囱链合成减少，导致Ｂ珠鼗自链合成现对过剩、血缎爨自合成量 躐少造成熬巍滚系统疾瘸。§珠蛋鑫链合藏现霹蓬裁憝毡逮贫主蘩 的发病因素和致死因素。在胎儿期合成栩对过剩的Ｙ珠鬣白形成难 溶于水的同聚体，即Ｈｂ Ｂａｒｔ’ｓ，在成人相对过剩的Ｂ珠蛋白形成 滚滚于塞同聚髂ＨｂＨｂ Ｈ。ＨｂＢａｒｔ’ｓ和Ｈｂ Ｈ不姥发挥携带氧斡功熊，箍盈破坏细胞骥弓｜起细稳不稳定帮溶盘。另一方萄，｝孙Ｂａｒｔ’ｓ釉 Ｈ提供了临床可检测的寝型用于ｎ地贫诊断。ｄ地贫具有多种 不同的临床表现，包括静此型携带者（．Ｄ【‘地贫）、标凇型地贫（∥ 戆贫）、ＨｂＨ瘸、ＩＩｂ Ｂａｒｔ＇ｓ容耱黪，对波予ｊ瑟舞俸基黧缀中一个鼙 倍体“珠蛋臼基因簇或，和两个单倍体ｃ‘珠蛋白基因簇缺失和／或突 变失活一个、两个、三个、四个旺珠蛋白基因。构成皿红蛋白４ 聚体蛉程珠鬣自由壤和锄麓因共同编秘，僵２个基因斡贡献不同。 娩基因静转漩活性是程ｉ蓥掰豹３倍，翻译活洼相议，掰浚地基爨 表达的Ⅱ珠激白链是ａ。的２―３倍。所以发生在啦熬因的缺失或 突变引起的地赞表型比发嫩在瑾，基因的相同的缺失或突变严重［４Ｊ。 爱运，我们在广东省５各中心辘市辑、§逶贫流毒亍瘾谲查豹鏊 础上，鉴定了一例新的Ⅱ地贫缺失基因，即．１１．１／ｃａ，为世界上首次 报道。我们通过ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定了这种缺失的范围，缺失了包括 霸、毡２基嚣农内蕊１１。ｌｋｂ片段。ＤＮＡ攫ｌ彦精礁定位该蚨失发生程 （ＣＡ）ｎ重复净列内，为丽源蘸组事件导致的歃失。对先证者家系送 行了遗传调凌，ｇａｐ－ＰＣＲ诊断确证了避种新的缺必基因。通过 ＲＴ－ＰＣＲ半定爨，对这种新的缺失基因在ｍＲＮＡ水平的表达进行了分拆。９实验材料一．样本 先证者：女婴，父母祖籍均为广东五华县。在广东省ｑ地贫 分子流行病调查中发现Ｈｂ Ｂａｒｔ’ｓ（１．７０％），排除了中国人中常见的 ０【珠蛋白基因缺失和点突变类型，遂分析其父母双方的家系，发现 其母亲家系成员中红细胞有小细胞低色素改变、ＨｂＡ２降低，因此 将其母亲家系所有成员作为进一步分析对象。二．试剂 （一）基因组ＤＮＡ抽提试剂 １．ＳＴＥ缓冲液（１０ｍＭＴｒｉｓ－－ＨＣＬ，ｐＨ８．０；ｌｍＭ１００ｍＭ ＮａＣｌ）ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０２．１０％ＳＤＳ（十二烷基硫酸钠）：Ｓｉｇｍａ公司。在９００ｍｌ水中溶解 １００９电泳级ＳＤＳ，６８＂Ｃ＇７鼎浴助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的ｐＨ 至７．２，加水定容至１Ｌ，分装备用。３．蛋白酶Ｋ：Ｍｅｒｋａ公司４．无菌超纯水：ＭｉｌｉｐｏｒｅＰＦ一２纯水仪自制，高压灭菌。５．饱和酚：上海生工生物工程公司，Ｔｒｉｓ饱和（ｐＨ＞＝８．Ｏ）。 ６．氯仿／异戊醇：ｌ：２４（ｖ：Ｖ）自制。７．３Ｍ醋酸钠（ｐＨ５．２）：汕头市化工厂；无水乙醇：汕头市化工厂 ８．ＴＥ缓冲液（１０ｒａＭＴｒｉｓ－－ＨＣｌ，ｐＨ ８．Ｏ；ｌｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．Ｏ）９．．５Ｍ ＥＤＴＡＯＨ ８．Ｏ）：Ｓｉｇｍａ公司，在８００ｒａｌ水中加入１８６．１９ＥＤＴＡＮａ２?２Ｈ２０，磁力搅拌器上剧烈搅拌助溶，１０Ｍ ＮａｏＨ调节 ｐＨ到８．０，高压灭菌备用。（二）ＰＣＲ试剂１．引物合成：上海博亚生物技术有限公司合成。 ２．ＴａｋａＬａＬＡＴａｑ酶：宝生物工程（大连）有限公司。３。ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ：ＧＣｂｕｆｆｅｒＩ、Ⅱ，宝生物＿Ｉ程（大连）有限公司。 ４．矿物油：Ｓｉｇｎｍ公司 ５．ｄＮＴＰ：宝生物工程（大涟）有限公司 （三）电浓试裁 ｉ。琼脂糖：北京鼎国生物技术发展中心 ２．２０ｘＴＢＥ缓冲液：Ｔｒｉｓ碱１０８９（Ｒｏｃｈｅ分装，北京鼎国生物技 术发屡中心），硼酸５５９（浊头市化工厂），４ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．∞， 定容至ｌＬ。 ３．６×电泳上样缓冲液：Ｏ．２５％溴酚兰，Ｏ．２５％二甲笨晴兰，４０％ （Ｗ／Ｖ）蔗糖溶予水中。 （西）ＳＯＵＴＨＥＲＮＢＬＯＴ试裁 １．２０ｘＳＳＣ：１Ｌ中含１７５．３９ ＮａＣｌ，８８．２９柠檬酸钠，ＮａＯＨ／ＨＣｌ调 ｐＨ＝７．０。高服灭菌备用。 ２。交性滚；１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ ＮａＯＨ。 ３．中和液：１．５Ｍ ＮａＣｌ，ｔＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｒｏｅｈｅ公司），调ｐＨ＝８．０。４．２０％ＳＤＳ；ｌＯＯｇＳＤＳ（ｓｉｇｍａ公司）粉加入５００趣纯水中，调ｐＨ＝８。０，０．４５ｍｍ滤膜过滤蚕麾。 ５．１ＭＮａ２ＨＰ０４：取３５８９Ｎａ２ＨＰ０４溶予ｉＬ超缝承中，诵ｐ珏＝７．２，商压灭菌备用。 ６．杂交液：０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰ０４，７％ＳＤＳ，ｐＨ＝７－８。７。洗貘滚１：２０ｎ心ｔ ＮａｚＨＰ０４，５％ＳＤＳｅ８．洗膜液２：２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４，１％ＳＤＳ。 ９．限制性内切酶：ＢｇＬ－ＩＩ、Ａｃｅ６５．Ｉ、Ｄｍ－Ｉ（ｐｒｏｍｅｇａ公司）。 １０．Ｃｔ．３２ｐ．ｄＣＴＰ：５０ｕＣｉ／次，购自北京福瑞公司。 ｌｉ．夔瓤季｜物菰运试麓盒：Ｐｒｉｍｅｒ－ａ（ｅａｔ．巩ｎ １００，Ｐｍｍｅｇａ公词１Ｇｅｎｅ ＬａｂｅｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍ１２．尼龙膜：ＨｙＢａｎｄ－Ｎ＋１５ｘ２０ｅｍ，（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｍｍｃｉａ）１３。ｘ．片：ＦＵＪｌＭＴＤＩＣＡＬＸ－ＲＡＹＦＩＬＭ １００ＮＩＦ ２０．３ｘ２５．《８ｘｌｏ）ｅ１４．不同规格徽擅取液器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管、枪头，ＰＣＲ 热循环仪（ＭＷＧ）、琼脂糖凝胶电泳装置（北京六一厂）、电热恒温 水浴箱（ＨＺＳ－Ｈ水裕振荡器，晗尔滨东联嘏予技术开发公司１、离心 飘（ＴＧＬ－１６Ｈ ＨＥＭＡ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、杂交纹（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｍｏｄｅｌ １０００）、暗盒。 １５．ＤＮＡ纯化试剂盒，ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ （玉）ＲＤＢ试翻 １．２０ｘＳＳＣ：取分析纯ＮａＣＩ １７５．３９，二水柠檬酸钠８８９，加水８００ｍｌ 溶解，调ｐＨ７．０，加水定容黛１，０００ｍｌ。分装后高压灭菌。２。２×ＳＳＣ．０。１％ＳＤＳ：２０×ＳＳＣ １００ｍｌ，１０％ＳＤＳ １０ｒａｌ，蕊窳至１０００ｍｌ。ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）。３．Ｏ．５ｘＳＳＣ．０．１％ＳＤＳ：４。Ｉｍｏｌ／Ｌ柠檬羧镳：取分辑缝二东柠檬酸镳１４７９，热窳至４００ｍｌ， 浓盐酸调ｐＨ麓５．０，使用时稀释成ｏ．１ｍｏ搬。。５．２ｍｇ／ｍｌ ＴＭＢ：ＴＭＢ０．５９，加９５％乙醇溶解，定容楚２５０ｍｌ，拣经瓶存于干燥器中。 ６．ＲＤＢ膜条：本室自利 （六）测序：由上海博亚公词ｍｏｄｅｌ ３７７测序仪完成 ＜七）ＲＴ。ＰＣＲ试裁 １．ｍＲＮＡ提取试剂： １。１０％十二烷基肌氨酸钠：称取５９十二烷基肌氨酸钠溶于三蒸 零中，３７℃溅夜楚瑾（热入Ｏ。１％ＤＥＰＣ），裹压灭蓉，餐矮。２．２Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ＝４．Ｏ）：称取三水ＮａＡｃ ２７．２９溶于４０ｍｌ无ＲＮＡ酶水至１００ｍｌ，高压灭菌。３．５０ｍＭ ＮａＡｃ（Ｐｈ＝５。２）：称取取三浓ＮａＡｅ ３．４９滚予１５０ｍｌ无ＲＮＡ酶水中，埭醋酸＿｛｜２ｌ整ｐＨ至５．２，加入无ＲＮＡ酶水定窖至５００ｍｌ，商压灭菌，备用。１２４．无ＲＮＡ酶水的配制（１０００ｍ１）：１０００ｍｌ五蒸水中加入ｌｍｌ ＤＥＰＣ，３７静置１２～１６小对，麓篷灭菌，备用。 ５。ｏ．７５Ｍ柠檬酸铺：称取二窳柠檬酸镳２２９，溶予８０ｍｌ水中， 用浓盐酸调整ｐＨ歪７．０，加三蒸水至１００ｍｌ，高压灭菌，备用。 ６．水饱和酚（ｐＨ４．Ｏ）取重蒸酚２００ｍｌ，于６５。Ｃ水浴融解后，加 入终浓疫为０，ｌ籍鹣８．羟墓奎宁，等侮积豹５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＡｃ（Ｄ珏５．２），震荡，再加入２ＭＮａＡｃ（ｐＨ ４．ｏ），调熬ｐＨ至４．０，静置，待酚相与水相完企分开后，激除上层水相，加入等体积的经 ＤＥＰＣ处理过的三蒸水，４＂Ｃ傍存备用。 ７。交性缓冲滚：取５０９异硫鬣毅瓤溶于５８．６ｍｌ无ＲＮＡ酶水中， 加入０．７５ｍｏｌ／Ｌ的柠檬酸钠（ｐＨ ７．Ｏ）和５．２８ｍｌ １０％十二烷基肌 氨酸钠于６５＂Ｃ溶解后，加入Ｏ．７２ｍｌ ６一求基忍醇，存放于４ ｏＣ。冬麓。２．特昴性扩增ｑ珠谖白基因和Ｂ珠蛋白基因的引物由上海博亚生 物技术公司合成。Ｏｎｅ．Ｓｔｅｐ ＲＴ―ＰＣＲｋｉｔ赡自宝生物（大连）有黢蠹强公司。三．仪器 ｌ。台式高速离心机：ＴＧＬ一１６Ｈ测，珠海黑马暇学仪器有限公司。 ２。紫乡｝分光竞度诗：ＵＶｌ６０１黧，霹本ＳＨＩＮＬｃｋＤＺＵ公司。 ３．紫外透射分析仪：ＷＰ一９３―７烈，永嘉上塘教学仪器厂。 ４，水浴振荡器：ＴＧＺ．８２型，哈尔滨市东联嘏子技术开发肖限公霹。５．基因扩增仪；ＰＥ．４８０型，美阐Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＴＭ公司。 ６．超净工作台：苏州净化设备厂。 ７．筑承砉趸：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ ｐｌｕｓ鍪，潼瀵Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公甏产瑟。 ８．电子天平：ＡＡ一１６０型，美国ＤｅｎｖｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ产品。 ９．酸度计：ｐＨＳ．２５型，上海雷磁仪器厂ｌＯ．凝胶成像系统；Ｓｙｎｇｅｎｅ ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ型，英国ＳＹＮＯＰＴＩＣＳ公镯产蘸。ｌ１．滚筒式分子杂交坟：美翻Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司。１２．暗盒霹．软传、数据库 弓Ｉ物设计：ＯＬＩＧ０６．０、ＰＲＩＭＥＲ５，０、 ＤＮＡ序列对比：ＤＮＡＭＡＮ、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ 基阕组ＤＮＡ序列资源：ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅｂａｎｋ１４爽验方法一．先证者及其家系血液学分析 家系血液学分辑中红绑腿捂标采用搬绷腿自动分轿仪（ＭｏｄｅｌＳｙｓｍｅｘＦ一８２０，酲本Ｓｙｓｍｅｘ公司）检溺；盘荭蛋自魂泳及定量分析采用快速自动电泳分析系统（ＲＦＰ，美国Ｈｅｌｅｎａ公司）检测。 二。ＤＮＡ提取及浓度帮纯殿测定 先证者和家系成员样龋为乡｝周静脉斑。用前文所述酚，氯仿擒 提法从外周血囱细胞中提取撼因组ＤＮＡ。并用紫外分光光度计在 ２６０ｎｍ、２８０ｒｉｍ处钡４定ＤＮＡ浓度和判定冀纯度。 三．基因突变分析（一）点突变分析ｌ＋ＲＤＢ杂交：中国人群中萨”‰，萨黼’ａ，娃ｃＤ５‰，找铷Ⅻ８２程（毋ｓ毡）耜≯。ｎ…‘８ｐｆｉｎｇｃ【（０ｃｃ８Ⅱ）５种非缺失血．地贫突变类型筛查采用本塞建立的反向点杂交（ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔｂｌｏｔ，ＲＤＢ）技术。２。伐ｌ、逝基霆全长测序： ａ１基因浆用引物Ｃ１，５’ＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＧＴＣＣＴＧ３’（ｎｔ３７３４１―３７３６０，ＮＧ＿０００００６）、Ｃ２，５’ＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧＴＴＴＣＴＧＡ３’（ｎｔ３８４１２―３８４３１，ＮＧ ０００００６），扩增，毗基因袋阕弓ｌ物ｃｌ， ｓ’ＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＧＴＣＣＴＧ３’（ｎｔ３３５３７―３３５５６，ＮＧ ０００００６）、Ｃ３，５’ＣＣＡＴＴＧＴＴＧＧＣＡＣＡＴＴＣＣＧＧ３’（ｎｔ３４６０２―３４６２１，ＮＧ＿０００００６）扩增。ＰＣＲ扩增产物直接测序，由上海博亚生物技术有限公司ＭＯＤＥＬ ３７７测痔饺完成。（二）缺必分析１，Ｇａｐ－ＰＣＲ：按文簸５５】竣诗多重ＰＣＲ扩瓒孛国入巾鬻瑟豹镬爨爱鑫基霆袋必一８“／０毗、．矿’７触、．扩２／０ｃｃ【，按文献【６】设计引物扩增中国人中罕 见的ａ珠蛋白基因缺失一ＴＨ“１№、～Ｆ１Ｌ慨。２，Ｓｏｕｔｈｃｒｎ１．ｂｌｏｔ分缀设计‘、ＤＳ．０探针，选择适当的内切酶： 根据待分析片段的序列要求选择探针位置和适当的限制性内切酶，并分析探针的特异性。 ∈探针设计和内切酶妇选择见文献【７ｌ。探针序列见下圈。＜探针 在程墓因簇内蠢２个阐源缝合区，帮≤葶羹旱≤蒸困内。净列臻影都分为扩增探赞熬萼｜锈位置、穿剜：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｈｔｌ４１９３―１４９４０，Ｙ‘ｎｔ２４７８３－２５５３０（ＮＧ ０００００６）删黪譬麟麟；ｉ溱勰粼黼燃《㈧灞ＡＡＡＧＧＴＴＴｃＴＡＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＣＴＧＴ ＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＧＴＴＣＴＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴＣＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＡＴＣＣＣＡＴＣＴＧＧＧＡＴＣ ＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧ ＡＴＧ巍ＧＣＣＴＧＣＧＧＴＣＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＧＣＴＧ ＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧＣＴ ＡＧＡＡＧＧＧＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣ ＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡ ＣＣＡＧＧＣＧＴＧＣ ＧＡＡＣＣＣＧＴＣＧ ＧＣＣＴＣＴＡＧＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＧＧ薅ＣＡａｅＣ ＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧ ＴＴＴＧＧＧｅ｜ＡＣＣ ＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＧＧＣ巍 ＡＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧ ＧＣＡＣＣＣＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧ张ＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧ ＴＧＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡ ＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣ ＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣ ＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧ ＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧ ＣＧＧＣ￡ＣＣＣＧＣＡＣＣ鬻ＡｃＴＴｅｅＡＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＧＴＣＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＡＧＡＧ ＴＧＳＧＡＧＣＴＣＡ ＧＣＡＧＡＣＣＡＡＧＡＧＴＴＧＣＧＣＧＣ ＡＡＧＡＧＣＡＴＣＧＧＴＧＧｅＧＧＧＡＧ ＡＧＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＣＣＣＣＧＴＣＣＣ ＣＧＣＡＣＴＴＣＧＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧ ＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＣＣＡｅＣｅＧＧＧＴＣＣＧＣＧＣ ＣＧＡＣＧＣＧＧＴＧＧＣ巍ＣＧＧＣＴＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴ《糍溅瀚燃躺黼濑燃粼黢濑Ｅｎｄｏｚｙｍｅ：Ａｃｃ６５－Ｉ纛ＢｇＬ―ＩＩＤＳ一０探钟潆列和选用的限制性内切酶：序列秘影部分为引物 位真、序列：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：（ｎｔ３６１９７～３６６４０，ＡＥ００６４６２） 《辫攥怒隧黪ｉ糕戮戳燃麟糕龚ＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴ ＧＧＡＴＣＣＡＣＧＴＡＴＣＣＴＴＧＧＧＧ ＴＡＧＣＴＣＧＡＧＴ ＣＡＧＴＣＴＣＡＣＣＴＣＴＡＧＴＴＴＣＴＴＣＡＡＴＣＡＴＣＣ ＴＧＴＧＴＧＣＴＣＣＣＡ（ＡＧＣＡＣＡＧＴＴＧＧＡＧＣＣＣＡ ＴＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣ ＧＧＡＧＧＣＴＣＡＧ ＡＧＧＴＧＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴ ＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧ ＡＣＣＣＴＣＣＴＧＧ ＣＧＣＡＴＣＣＴＣＣ ＧＧＧＣＴＣＡＧＣＣ ＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＴＣＧＣＧＣＡＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧ ＧＡＴＴＡＣＡＴＣＴ ＣＴＧＧＡＧＡＴＧＴ ＣＡＣＴＴＧＧＴＡＣ ＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧｅ＇ＡＧＣＡＡＧＣＡＣＧＣＴＣＴＣＡＧＡＣ ＧＧＡＧＣＡＴＣＡＣ ＧＧＡＧＧＴＴＧＧＡ ＡＧＡＡＣＣＴＡＣＣ ＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡ ＡＧＡＧＣＣＡＧＡＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＣ ＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡ ＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡ ＣＣＴＧＧＣＴＣＡＡ ＧＡＴＣＣＡＡＧＧＧ ＧＡＣＴＣＡＴＧＣＣｃＡ囔燃黼瞩ｉ隅黼霸麟戮囊ｌ戮黼Ｅｎｄｏｚｖｍｅ：ＤｒａＩ２．按前述方法抽提待诊断样本基因组ＤＮＡ。３．ＤＮＡ定量采用紫外分光光度法测ｇＤＮＡ样本的浓度：ＤＮＡ样本稀释２０倍， 测２６０ｎｍ和２８０ｎｍ的吸光值（ＯＤ值）。２６０ｒｉｍ的ＯＤ值即为ＤＮＡ的浓度。取１５ｕｇ ｇＤＮＡ用于酶切。４．酶切加入ＢｇＬ―ＩＩ、Ａｅｃ６５．Ｉ（或Ｄｒａ．Ｉ）限制性内切酶及相应缓冲液在３７。Ｃ完全消化３－６小时（按试剂盒说明），将ＤＮＡ切割成相应的短片段５．电泳酶切完全的ＤＮＡ产物进行琼脂糖凝胶电泳（Ｏ．７％胶，０．５＊ＴＡＥ电泳缓冲液，电压１５Ｖ，电流９―１０ｍＡ，电泳２０小时）６．变性、中和转移变性液变性４５ｍｉｎｘ２次。中和液中和３０ ｍｉｎｘ２次７．将琼脂糖上的ＤＮＡ以同一位置印迹转移至带正电的尼龙膜上， 转移装置放置顺序从下到上为：玻板、吸水滤纸、凝胶（倒放）、 尼龙膜、滤纸３张、足够量的吸水纸、玻板、重物５００克，转移 约３０小时；转移液为２０ｘＳＳＣ。转移前尼龙膜先用超纯水逐步浸 湿５ｍｉｎ，在２０ｘＳＳＣ中浸泡至少３０ｒａｉｎ。转移后尼龙膜要在６×ＳＳＣ 中漂洗５ｍｉｎ。转移装置各层间不得留有气泡。８．标记探针取正常个体熬因组ＤＮＡ，应用上述特异性引物进行ＰＣＲ扩 增≮、ＤＳ一０捺铮窿列。ＰＣＲ产物经２％琼ｌ鬟糖电泳、协骏缝证后 进行放射性标记。 两种方法均可用来标记： Ａ，按ｐｒｏｍｅｇａ标记试弃４盒方黛进行，模板ＤＮＡ约１５－－２５ｎｇ（短 片颟搽铮１５ｎｇ，栎记９枣辩，长靖獗搽赞约２０－－２５ｎｇ糠谗３夸薅＞； Ｂ．ＰＣＲ标记：２＊ＧＣｂｕｆｆｅｒ－ＩＩ２５ｕｌ；１．５ｍＭｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＧＴＰ，３ｕｌ（ｅａｃｈ ｌｕｌ）；ｌｏｃＦ（１０ｐｍｏｌ／ｕ１）２ｕｌ；ｌｏｅＲ（１０ｐｍｏｌ／ｕ１）３ｕｌ；Ｔａｑ Ｌａ（５ｕ／ｕ１１ ０．５ｕｌ；ＤＮＡ（ＰＣＲ鳃促蜃定量为１ ５ｎｇ／ｕｌ，稀释２００倍使 耀）２ｕｌ；ｄｄＨ２０９，５ｕｌ；ａｌｐｈａ－３２ＰｄＣＴＰ５ｕｌ（澌１．５ｒａＭｄＣＴＰ按ｌ：９０稀释，取１ｍ）．循环祭件：９５＊（２ ３ｒａｉｎ，（９７＂Ｃｌｍｉｎｌ５ｓｅｃ．７２＂０４５ｓｅｃ，６０＂Ｃｌｍｉｎ）×２５；７２℃３ｒａｉｎ，１５℃ｓｔｏｒｅ．在ＭＷＧ ＰＣＲ仪上逡葶亍。９．烤膜 预杂交８０℃烤２小时，密封保存备用，或直接用予杂交ｌｏ，６ｘＳＳＣ浸湿懋露膜，薅涅静弼龙簇教在杂交袋孛，热入预燕豹杂 交液，封口，于６５℃预热的杂交箱中预杂交１５ｒａｉｎ。１１．杂交掺爨颈杂交滚，将在漾农审焱潢懿杂交滚秘标记好懿援锋一因趣 入杂交袋，封翻，杂交２４小时。１２．洗膜淡膜液１洗膜４５ｒａｉｎ×２次；洗膜液２洗膜４５ｒａｉｎ×２次。噱予３０ｍｉｎ。１３．压冀将尼龙膜夹于两层保鲜膜间，于暗室中聪片。压片１５～４８小时。１４．显影．７０℃显影１５小簿３．跨越断裂点ＰＣＲ：根据Ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｌｏｔ绪果设计跨越断裂点引物， 扩增突变基因，３’（ｎｔ２２４７１―２２４９１。ＡＥ００６４６２）ＦＰ：５’ＴＡＣＣＣＡＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＴＧＲＰ：５’ＡＴＡＡＣＣ＇ＩＴＴＡＴＣＴＣ￡ＣＡＣＡＴＧＴＡＧＣ３’（ｎｔ３５８３７―３５８６１，ＡＥ００６４６２）ＰＣＲ产赘壹接溺渗。 ４．设计针对该缺失片段的ＰＣＲ诊断体系：设计引物，ｇｚＦ５’ＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡ３’（ｎｔ３１２３８―３１２５７，ＮＱｏｏｏ００６），ｇｚＲ５’ＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＣ３’（ｎｔ４２９４１―４２９６２，ＮＧ ０００００６ １，ｇｚＣＲ ５’ＡＣＡＧＣＡＣＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＧＡ３’（ｎｔ３２４２４―３２４４３．ＮＧ一０００００６），蒸审ｇｚＦ帮ｇｚＲ跨越鞭爱点，正常襻本申扩圭ｌ；片 段太大（约１２ｋｂ）故正常样本无扩增片段，缺失１ｌ。ｌｋｂ患者扩增片段为５８４ｂｐ。ｇｚＦ与ｇｚＣＲ扩增对照片段长度为１．２ｋｂ。四．ＲＮＡ提取及浓魔和纯度测定 Ｉ＋ＲＮＡ提取：１．将２ｍｌ ＥＤＴＡ抗凝的外周静脉蠹匪缓後加入至Ｉ装有４ｍｌ’辩巴细胞分离液的１０ｍｌ离心管中。 ２．静置２分钟，２０００ｒｐｍ离心２０分钟。 ３．将有核细胞小心移入１．５ｍｌ离心臀中。 ４。燕入Ｏ。９％生璞薤痰ｌｍｌ，轻弹餐麓，使缝瑰悬浮。 ５．Ｏ．５ｍｔ加入细腿裂解缓冲液，吹灯混匀，使细胞充分裂解。加入５０Ｉ＿ｔｌ ２Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ ４．Ｏ），Ｏ．５ｍｌ水饱和酚（ｐＨ ４．０）：１００肛１ 氯仿。混匀。６．冰浴２０分钟。１２０００ｒｐｍ离心１５分钟，将上清移入掰１．５ｍｌ亵心营孛。７．加入Ｏ。５ｍｌ水饱和酚（ｐＨ ４。Ｏ），１００｝ｔ１氯仿，１２０００ｒｐｍ离心 ２０分钟。 ８．将上清移入１．５ｍｌ离心管，加入２倍体积无水乙醇，．２０＂Ｃ静置４小时。９，１２０００ｒｐｍ离一豁１５分麓，弃土渍。ｌＯ。ｌｍｌ１７５％乙醇清洗两次。空气干燥。１．加入适量ＤＥＰＣ处理灭菌超纯水。２．ＲＮＡ浓度、纯度和究熬性测定： ＤＥＰＣ处理的灭黼趣纯水将５ｍ ＲＮＡ样品稀释到１００Ｉ＿ｔｌ，紫 外分光光度计测定ＯＤ２ｃ，ｏ和ＯＤ２８０，计算ＲＮＡ浓度和０１）２６０／ＯＤ２８０￡＆值，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比傻＞ｌ。８，ＲＮＡ纯度较好。ＲＮＡ浓度（蟛牡１）＝ＯＤ２６０ｘ２０ｘ４０／１０００’取５ｂｔｌ ８０Ｖ电泳熬滋ＲＮＡ的完整性。４五．转家水平分析 ｊ．引物设计 滚题改进叁Ｓｈｅｎｇ－ｆｕｎｇ Ｌｉ珏翻豹多重ＲＴ－ＰＣＲ俸系进行捡测瓠 §一珠骚龟基因转录求学。弓ｌ魏序确为：Ｂ１，５’一ＧＣ猃ＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＡＴｅ卜３’（ｎｔ７０４０５―７０４２４，ＮＧ＿０００００７）和Ｂ２．５’一ＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣ一３’（ｎｔ７１７５３．７１７６７，ＮＧ０００００７），引物跨越ｐ基因２个内含予，扩增ｐ，基因ｍＲＮＡ，扩增片段为３８３ｂｐ：及Ａ１，５＇－ＣＴＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＧＴＣ－３’（锇，ｎｔ３３７８９－３３８０８／ａｌｎｔ３７５９３―３７６１２，ＮＧ０００００６））ｇｌＡ２，５’一日ＧｅｅＧ粥ＧｅＣｅＴＴＡＡＣ一３’（馓，ｎＧ４０５８―３４０７４／岱１，ｎｔ３７８６２―３７８７８，ＮＧ＿０００００６），弓ｌ物跨越ｎ１慨基因１个内含予，扩增０【．基因ｍＲＮＡ，扩增片段为１６９ｂｐ。２．ＰＣＲ循环线性关系的选择 淑０．４ｕｇ总ＲＮＡ为摸叛（５０ｕａ反应毒摹系），平行３营，按下述４， ５，６步懿条箨遂霞ＰＣＲ、逛溶帮获瘦努攒。程锤环鼗为１８，２ｌ， ２３，２５，２７，２９，３ｌ，３３，３６，３９时各臀分别取５ｕｌ ＰＣＲ产物。 将取得的ＰＣＲ产物在同一块琼脂糖凝胶上电泳。灰度扫描后，以 循环数为横坐标，３管平均灰度值值为纵坐标绘制ＰＣＲ循环曲线。 ３．选择样本 １３镄正常样本（袭黧菱鬻，｛｛｝豫孛国久警怒靛程．、务羹煞蠡慕因溅），１０例一８鼍钒样本（经基因诊断确诊），４例一Ⅲ／ｏｃｔ缺必榉本。４．ＲＴ。ＰＣＲ条件ＰＣＲ组分：１０＂ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ５．０ｕｌ １０，０ｕｌ ５．０ｕｌ １．０ｕｌ １．Ｏｕｌ １．０ｕｌ １．５ｕｌ ｌ。５ｕｌ １．０ｕｌ１．０ｕｌＭｇＣｌ（２５ｍＭ） ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）Ｒｌｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０ｕ／ｕ１）ＡＭＶ ＲｉｌｌｔｓｅＸＬ（ＳｕＭ）ＡＭＶ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｔａｑ ＥＡｌ－ｐｒｉｍｅｒ（２０ｕＭ）Ａ２－ｐｒｉｍｅｒ（２０ｕＭ） Ｂ１－ｐｒｉｍｅｒ（２０ｕＭ）Ｂ２－ｐｒｉｍｅｒ（２０ｕＭ）ｔｏｔｌｅ ＲＮＡ０．４ｕｇｄｄＨ２０Ｕｐｔｏ５０ｕ１．热覆嚣条耱：２５ ｃｙｃｌｅｓ９４℃：９４℃５，电泳 １％琼脂糖（含０．５ｕｇ／ｍｌ ＥＢ），０．５ｘＴＢＥ，４～５Ｖ／ｅｍ电泳３０分钟ａ ‘．灰度扫描 臻走薅舞：１．０～２．０移。 灰度分析方法：ｌｏｗｅｓｔ选择ａｌｌｐｅａｋｓ ｓａｍｅ ｓｌｏｐｅｗｉｄｔｈ选项。熊他选项根据电泳图调藏。２１结果与分析一．表型结果 先证者及其母亲家系图见图１．１，家系成员衄液学表型资料见 表１。先证者、先证者母亲、先证者姨妈、先证者外婆红细胞呈小 细胞低色素改变（ＭＣＨ、ＭＣＶ较正常人降低），Ｈｂ含量降低， ＨｂＡ２降低，为ａ地贫标准型患者表现。ｎＦｉｇ １－１Ｆａｍｉｌｙ ｐｅｄｉｇｒｅｅ．Ｔｈｅ ｐｒｏｂａｎｄ ｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ８／ｒｏｗＴａｂ．Ｉ．ＩＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｉ ｄａｔｅ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｂａｎｄ ａｎｄ ｈｅｒ ｆａｍｉｌｙＩ １ Ｆ／４９ １１８ ５．６３ ６４．５ ２１．０ ９７．８ ２．２０ １２ １１１ ｔｉ ２ Ｆ／２７ １２６ ６．２３ ６２．１ ２０．２ ９７．０２ ２．９８ ０一１１ＩＩ ３１１４Ⅱ５ Ｆ／３５ １１８ ５．８７ ６３．０ ２０．１ ９６．９８ ３．１２ ０１Ｈ１ Ｆ／１ １１２ ６．０９ ５６ ２ １８．４ ９００３ ２．１８ ７．７９Ｉｌｌ２Ｓｅｘ／ａｇｅ（Ｙ） Ｈｂ（ｇ／Ｌ） ＲＢＣ（ｘ １０１２） ＭＣＶ（ｆＬ） ＭＣＨ（Ｐｇ） ＨｂＡｆ％１ ＨｂＡ２（％）Ｍ／５４１５０ ４．９６ ８５．７ ３０．２ ９７ ５ ２．５０ ０Ｍ１３３１７３ ５．７０ ８８．１ ３０．４ ９３．１１ ３．２７ ３．６２Ｆ／２５１３５ ４ ５ｌＭ／２２１３５ ４．５７ ８２．３ ２９．５ ９５．６５ ３．２８ ０Ｍ／５１４ｌ ５ ０２ ７８ ５ ２８．１ ９７．３５ ２．６５ ０８７．８ ２９．９９６．６３ ３．３７ ０ＩｔｂＦ（％）０Ｇｃｎｄ呻ｅ一１１ １／ｃｔｃｔａ刖∞Ⅱｎ，吣１／∞㈣∞／嘎旺一Ⅲ衄一…／ｃｔｃｔ鼬ａ二．基因型鉴定 通过ｇａｐ．ＰＣＲ和ＲＤＢ，排除了～ｓＥ“旭ｑ、－ｄ?７旭ａ、～一‘２／ａ‰毡ｃ…８豳‰（≯‰等毯逮贫缺失弱杰突变。逶遘锄、馓簇透溅摩蒴｝除了发生予娃熬霹痘动子区帮编璐嚣来知点突变翡可熊。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ一７ＨＡｋ叭一－Ｆ１。触仪，０ｃｃ０３‰、∥Ｄ３１旺、萨０５‰、旺Ｑｕｏｎｇ ｓｚｅ伐（ｃｔＱｓａ）和ｂｌｏｔ鼹经典的染色体ｍａｐｐｉｎｇ技术，用于大片段染色Ｉ体缺失的分析具有不可替代的作用。‘，探针配伍Ｂｇｌ ＩＩ、Ａｃｃ６５是诊断Ⅱ地贫最具价值的配伍，这种配伍不仅可以同时捡测 一ｓＥ‘勉攫、．０’７／ｃｕｚｆｔ《ｌｑ￡４。恕氆３耱常见予中霪Ａ孛鳃缺失，逐可以对 发生在理珠蛋鑫蒸瑗簇内影瘸到上述２稀酶酶留位点戆泰籀突变 提示缺失信息。我们首先采用（－探针献伍Ｂｇｌ ＩＩ、Ａｃｃ６５ Ｉ，对未 知基因型的样本遴行首轮筛查，然后根据提供的信息设计相应的 探针进行基因型鉴定。通过０探针配傲Ｂｇｌ ＩＩ、Ａｃｃ６５ Ｉ的诊断和 随后设计鲍ＤＳ．０搽钟配伍Ｄｒａ Ｉ进行的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分奄蓐，鉴定 了先涯者窝萁鸯装为疑失７大约１｜～１２ｋｂ黪一穆薪静找缝翁浃失 类型。基因组ＤＮＡ限制性内镯酶酶切瀚谱见图１．２ Ａ、Ｂ（Ｓｅｅ ｐａｇｅ ３９），显示基因组ＤＮＡ酶切后电泳图谱为均匀分布的ＤＮＡ片段表明酶切完全。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析图谱见图１－３Ａ、Ｂ（Ｓｅｅｐａｇｅ ３９）。０探针杂交显示先证考帮其母亲有一条约８．４ｋｂ的异常祭带，不同予左镧获失（ｏｏ触伐）特毒戆７，９ｋｂ祭黪。蔽据放瓣显影强疫判叛 ８。４ｋｂ的条带楚密０探锋与戳基毽杂交产生豹，结合搽钟经置和酶切位点及酶切片段判断缺失片段的上游断裂点位于甲‘基因下 游，下游断裂点位置有若干种Ｗ能性，一是位于ＢｇｌＩＩ３６１６５（ＮＧ ９００００６）酶切位点上游，缺失片段大小为３．７ｋｂ．又因为缺失导致蟪贫所以缺失必需毽含全部或部分砚基因，但邋＿ｊ遣像予镪 基因辫近致瑟鸯鸯熊往雩｛物未扩逢滋颥翅豹冀段。第二耪可雏毪 是下游断裂点位于Ｂｇｌ ＩＩ酶切位点４３５４１（ＮＧ ０００００６）与Ａｃｃ６５－Ｉ 酶切位点４２４５８（ＮＧ ０００００６）之间溅Ａｃｃ６５．Ｉ酶切僦点４２４５８（ＮＧ８９ｌ０００００６）上游，缺失片段大小分别为１１．１ｋｂ或１０ｋｂ，通过Ｉｌ单酶切配像》探针和Ｂｇｌ ｌＩ、Ａｃｃ６５ ｌ双酶切配缀≮一探针的ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ院较分析获褥的异常片段，它们的电泳位置麓本稆简 初步判断两者皆为８．４ｋｂ，但不能排除相懿ｌｋｂ（７．３ｋｂ与８．４ｋｂ） 静片段在Ｏ．７鳝臻耱糖凝黢龟泳鼹滚区努懿清况（资料来蘧示）， 第三种可能性是下游断点位于更远，缺失踅大的片段。熬于以上 考薅饶麦考患设诗赞慰１１．１ｋｂ或１０。ｌｋｂ靛失豹ＤＳ．０撵锋。ＤＳ。０ 探钟杂交照示先证者和其母亲存在～条异常的２．９ｋｂ条带，证实缺 失炎望｝德会上述第＝秘可貔蛙。逶ｊ建２次Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分檬绥暴熬 综合可以褥到片段缺失的大致断裂点，见豳１－４（Ｓｅｅ ｐａｇｅ ４０）。上 游叛裂点缎子Ｄｒａ－ｌ酶切键点３１３４４（ＮＧ０００００ ６）移Ｂｇｌ―Ｉｔ酶切位点３６１６５（ＮＧ０００００ ６）之间。下游断点位于Ｂ９１．ＩＩ的酶切位点４３５４１（ＮＧ０００００ ６ ＡＮＤ ＬＯＣ３５０３５７）上游。根据ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ结暴跨越断裂点设计ＰＣＲ引物ＦＰ，ＲＰ，序列见上述，扩增片段为２．２ｋｂ， ＰＣＲ产物纛接测序，测序圈断裂点部分见图１．５（Ｓｅｅ３１６９５―３１７２４（ＮＧ ０００００６），ｐａｇｅ ４０）。通过与ＧｅｎｅｂａｒｔｋＤＮＡ潜列对魄，得知该缺失５’断点位予 ３’断点位于４２８４６．４２８６７（ＮＧ０００００６）。５’、３’断点均是位于（ＣＡ）ｎ重复序掰中，所以这种缺失基因怒由于发生在（ＣＡ）ｎ重复序列中的同源藿组而导致的。 袋失片段静精确长发为１ ｌ，１３５ｂｐ。 家系成员通过ｇａｐ－ＰＣＲ进行诊断。引烧ｇｚＦ，ｇｚＲ，ｇｚＣＲ见 上述方法，其中ｇｚＦ和ｇｚＲ跨越断裘点，正常对照无扩增片段， 缺失１１．１ｋｂ患者扩增片段为５８４ｂｐ，ｇｚＦ与ｇｚＣＲ扩增对照片段长 度为１．２ｋｂ。ｇａｐ―ＰＣＲ诊断彪图１－６（Ｓｅｅ ｐａｇｅ ４１），先证者，先谣 者母亲，先证者姨妈，先证者外婆有５８４ｂｐ特异扩增带，诊断为一Ｈ‘／ａａ基闵壅。 三，转录水平分极取２ｕｌ溶于ＤＥＰＣ处联永鲍ｍＲＮＡ，于１％璩脂糖凝胶电泳， 检测ｍＲＮＡ的完熬性，结果见图ｌ一７（Ｓｅｅ ｐａｇｅ ４１）。 ＰＣＲ循环线憔关系的选择：ＰＣＲ结果和灰度ｊ薯籀蓝线结果最 图１－８（Ｓｅｅｐａｇｅ４２），显永在１８个循环时无可以梭测到的ＰＣＲ产物，在２１个循环时只有Ｂ链可以检测到，在２３～２７个循环时旺 镳移§链熬ＰＣＲ产物稳可稔测蛩著量位予撂数理｝长蠲。在２９～３９ 个循环时 处于平台期，ＰＣＲ产物量恒定。所以选择２ｓ个循环为ＲＴ－ＰＣＲ的循环次数。常榉本，一５鼍础本和＿１１，１／ａａ样本电泳缩果觅国ｌ母（Ｓｅｅｎ＝１３，９５％ｃＩ：１．４４２７。１．７５２７）Ⅱ基因ｍＲＮＡ表达水平。Ｔａｂ。１―２ｇｅｎｏｔｙｐｅ按翦述方法在转录水平分辑一ｎｏ触ａ痰铡表达水平瓣改变。正ｐａｇｅ４３），灰度扫描６ｍ比值结果见表２。绕计结果显示．１１．１／ａａ病例（２。４３２５±－０．６６８６，ｎ－－４）与－．ＳＥＡ］ｏｌｌ２病例（２．５１４０＿＋０．６８４７，ｎ＝ｌ啦９５％ＣＩ：２．０２４２，３。００３８）找蓥毽ｍＲＮＡ表达娟当，爨予委誊久（１．５９７７＿＋０。２５６５，Ｂ触ｍＲＮＡｒａｔｉｏｏｆｎｏｍｍｌ，一ＳｅＡ／ｂａａｎｄ～“ｌ舡陋脚陆睡限陋鼬融融融脚№淤ａｖｅｒａｇｅＮｅｍｍｌ Ｊ褂血伐一“缸Ⅸ啪挑删！ｍｌ２ｌ３ ６卵ｌ ３ ∞ｍ勰强∞ｌ臌捌埘ｍ∞鹕船３以斟２肼埘｜垦｜鲁磷ｓ｛研２，＿ 劢且砖键论我们在广东销５个中心城市Ⅱ地贫分予流行病调查中发现了 一例携带新缺失溅地贫基因的患者，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和跨越断裂 点ＤＮＡ测序的方法精确测定了这秘缺失纂霹的甄裂点移缺失片段 大小，证实这种缺失基困为～释薪魏程璁餐基霞，是蠢予发生在 （ＣＡ）ｎ重复序列的同源重组导致缺失了包括０【１、啦在内的１ｌ，１３５ｂｐ 片段。我们把这种地贫基因携带者的基因裂命名为一“一ｌａａ。通过 家系盎滚学表型分辑发现这耱袄失来源予惫涯者母亲家系，运用 针对．Ｉｉ．Ｉ，豹ｇａｐ。ＰＣＲ分析了先证者母亲象系，证实了．ｉ１．Ｉ／魄贫基 因遗传的家系来源。我们对．ＩＩ，Ｉｌａａ基因型患者的０【基阏表达水平进行了ＩｎＲＮＡ水平的分析，发现一“‘１，㈣患者ａ基因袭达水平与一３”勉程患者稳獭。我们在５６０５份调查样本中得到４７８条含ｃ【地贫基因的染色体。一１１１／占所调查“地贫基因的１／４７８。在以一８ＥＡ／，，一３．７／，一－４。２／为ａ地贫主要缺失类型的中犀广东雀，这一薪的突变频率是比较低螅。我们 在熬群｛癃群、系统筛查耱鏊磷上蔽集样本，使我稍鼹够既较客蕊 准确的反映广东省地贫基因炎型分布，同时也能够发现频率较低 的、在临床就诊中难以发现的新的地贫基因类型。虽然对地贫分 子遗传学的磺变已经寿三卡多年懿历史，猩缝贫毫发媳区熟邀孛 海沿岸各国、东南亚国家和我国南方各省已经有详尽鹣魄贫基因 类溅和分布频率的报道，但备国学者仍然不断有在他们所在国度 人群中发现耨突变的报道［９，１０，１Ｌ１２，１３１，我们相信在未来的类似分子 滚行痣谣查孛爨然会骞一些擎羹懿逮贫蒸藏羧发理。 我们在中翻人中首次发现并鉴定了．１１．１／地贫基因，丰富了对 地贫基因缺失类型的认识，进一步阐明了中国人群地贫基因的类 型，具有一定的理论价值。我们的发现，为临床遗传瓷询和地贫豹分子诊蘩提供了必要懿分子蓉礁。赞恕一ｎ‘ｌａａ设计豹ｇａｐ－ＰＣＲ诊断体系，成功诊断了先证者家系成员，这一诊断体系完全可以 用于临床患者的快速诊断。妫外，在中豳人中发现这一全新的地 贫麓因，为人嚣基因多样链翻分子进化磷炎提供了霹供逡择的素材。参考文献１?Ｈｉｇｇｓ ＤＲ，ＴｈｅｉｎＳＬ，Ｗｅｏｄ ＷＧ髓∞ＢｉｏｌｏｇｙＪＢ ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｔｈｅｏｆ ｔｈｅ ｔｔｍｌａｓｓｅｍｉａｓ．Ｉｎ：ｔｈＷｅａｔｈｅｒａＵ ＤＪ，ＣｌｅｇｇＴｈａｌａｓｓｅｍｉａ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．４ｅｄ．ＵＳＡ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．２００１；ｐ６５－２３７． ２?ＸｕＸＭ，Ｚｈｏｕ ＹＱ，Ｌｕｏ ＧＸｅｔ ａｔｉｂｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆａｌｐｈａ ａｎｄｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓａｅｒｅｉａ ｉｎＧｕｅｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｈｅａｌｔｈｂｕｒｄｅｎ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ＪＣｌｉｎ Ｐａｔｈ０１．２００４ ３，Ｚｈａｏ ＪＢ，Ｚｈａｏ Ｌ，ＦｅｉＭａｙ；５７（５）：５１７―５２２．ＹＪ，Ｌｉｎ淞，Ｈｕｉｓｍｍ－ＩａＴＨ．Ａ ｎｏｖｅｌ ａｌｐｈａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ，２（－ｚ．７－ｋｂ）ｏｂｓｅｒｖｅｄ１９９１：３８：２４８－９，ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｈｂ珏ｄｉＳｅａｓｅ．Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ４＋Ｌｉｅｂｈａｂｅｒ ＳＡ，Ｃａｓｈ ＦＥ，Ｂａｌｌａｓ ＳＫ．Ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ２－ｌｏｃｕｓ ｉｎ Ｂｉｏｔ Ｃｈｅｍ．１９８６ ＮＯＶｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ１５；２６１（３∞：１５３２７－３３５．Ｓａｍｕｅｌ Ｓ．Ｃｈｏｎｇ，Ｃｏｒｉｎｎｅ Ｄ．Ｂｏｅｈｍ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｒ．Ｈｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ Ｓｉｎｇｌｅ ｔｕｂｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ－ＰＣＲｓｃｒｅｅｎｆｏｒｃｏｌｒｅ．ｒｌｏｎｄｅｌｅｔｉｏｎａｌｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ’ｏｆａｌｐｈａｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．ｂｌｏｏｄ２０００；９５３６０－３６２。６．Ｌｉｕ ＹＴ．Ｏｌｄ Ｊｌｖｌ，Ｍｉｌｅｓ Ｋ ｅｔ ａｔ Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆａｌｐｈａ－ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａ／ｐｈａ－ｇｌｏｂｉｎｇｅｎｅｔｒｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙｍｕｌ却ｊ％ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｓ。ＢｒＪ Ｈａｅｍａｔ０１．２０００ Ｆｅｂ；１０８（２）：２９５―９．７．ＬｅｂＲＶ，Ｓａ／ｋｉ瓯Ｓｗｍａｓｏｎ鹣Ｍｏｎ扭ｎｏ馘气Ｅｄｉｃｈ辩氐Ｇｏｌｂｕｓａｎａｌｙｓｉｓ．ＨｕｍＧｅｎｅｔ １９９０；８５：２９３?９．ＭＳ＋Ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｄｕａｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｂｙ ｐｏｌｙｌｎｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ８－Ｌｉｎ ＳＦ，Ｌｉｕ ＴＣ，Ｃｈｅｎ ＴＰ，Ｃｈｉｏｕ ＳＳ，ＬｉｕＨＷ，Ｃｈａｎｇ ＪＧ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆｒａｔｉｏｓ．Ｂｒ ｄｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ ｂｙ ｎｏｎ－ｉｓｏｔｏｐｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎＨａｅｍａｔｏｌ １９９４：８７：１３３－８ ９．Ｋｏｏｆ螂ａｎｄ洳ｍＲＮＡＴＭ，Ｃｈｅｎ ＴＡ，Ｈｓｉｅｈ ＭＩ，ｅｔ ａ１．Ａｌｐｈａ＊ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａｉｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒｍａｊｏｒａｂｏｒｉｇｉｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９３；９２：７９―８０，１０．ＷａｙｅＪＳ，Ｅｎｇ Ｂ，ＣｈｕｉａＤＨ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ａｌｌ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｚｅｔａ－ａｌｐｈａ ｇｌｏｂｉｎｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ １ｌ。Ｃｈｅｎ ＦＥ，ＯｏｉＣｈｉｎｅｓｅ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ．ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌ １９９２：８０：３７８－８０Ｃ Ｈａ ＳＹ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ＨｄｉｓｅａｓｅｉｎＣｈｉｎｅｓｅｐａｔｉｅｎｔｓ。ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２０００；３４３：５４４―５０。２７１２．Ｈａｒｔｅｖｅｌｄ ＣＬ。ｖａｎ ＤｅｌｆｔＰ，Ｗｉｊｅｍｌａｎｓ Ｐｗｅｔａｌ Ａ ｎｏｖｅｌ ７．９ ｋｂ ｄｃｌｅｆｉｏｎｃａｕｓｉｎｇ ａｌｐｈａ＋－ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ ｉｎ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ｉｎｄｉａｎ ｏｒｉｇｉｎ．ＢｒＪＨａｅｍａｔｏＬ ２００３ Ｊａｎ；１２０（２）：３６４―６。１３ Ｃｈａｎ ＡＹ，／ｖｉａ ＥＳ．Ａｕ ＷＹ甜ａ／Ｄｅｔｃｃｆｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｙｐｅａｓｍａｌｌ！ｎｏｖｅｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅＩＩ―ａｌｐｈａ（３．７）ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｂｙ ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，２００２ Ａｕｇ；２６（３）：３ｌ １－６．第二部分：一种在中阔人中罕见的导致Ｂ地中海贫血的 突变基因静鉴定引言人类§漾蛋垒基嚣锭予筹１１号綮莛露短譬上，类§基匿露§基因成簇存在，共同构成ｐ珠蛋白基阂簇。ｐ珠激自基因簇飘５，到３’依次为ＬＣＲ调控鼷、、｜，ｐ２、￡、（叶、Ａ了、、｜，ｐ１、６、Ｄ基因，ｐ珠蛋白基因簇内各基因移在时空表达次序，卵黄囊造血期主要表 运￡薹霾，狳蒡手遥盘期，Ｙ基因菇主羹表达豹类§蒸因，夤懿逡瘟 开始后，ｐ旗因表达开始上升７基因淡达逐渐降低，到出生后３～６ 个月，Ｙ基因表达降低到低水平表达，主要表达ｐ糕因。所以严霞 戆§逮贫惑，Ｌ在妊辰期莠无螨庶疰状，往往在出擞３～６个月囊才 表现严重瘢状。 ｐ地贫是由于ｐ珠礞白合成量降低，导致Ⅱ珠鬣白现对过剩和 血红蛋白纛减少引起的级细胞稳定性降低，携氧功能降低的单撼 毽逮蕊癔。§臻蛋白蓥瓣楚壶３个舞驻子帮２个痰禽子秘残，大终 １～２ｋｂ长度比较紧凑的藻因，ｐ地贫主要由发生予ｐ基因的点突 变引起，少数由缺失引怒。Ｂ基因的点突变分影响转录的突变、影 嗨转录后修褥粒突变、影响秘译鳃突变３类。影响转录的突变发 生于§基溺上游启动予区，降低ｍＲＮＡ鲍合成萋。发生子§鏊霹 ３’末端加尾信号处的突变影响最终ｍＲＮＡ的合成攘，也属于影响 转录的突爱，这类突变一般引起Ｂ＋地贫。影响转淤后修饰的突变 是发生予§整嚣载突变影穗了蔻蒋ｍＲＮＡ戆正露耱犊或者楚藤壹 了ｍＲＮＡ的翻译。影响剪接的突变包括３类，一旋是发生于剪接 供体ＧＴ域照体ＡＧ的突变，突变去除了剪接位点，引起前体ＲＮＡ在该位点不能正零剪接，弓ｌ起∥地爨。第二类发嫩予ＧＴ或ＡＧ 序襄辫遴，降绦了在正常剪接谴煮的剪接效率。繁三类影嫡剪接的突变发缴于隐匿的剪接位点处，激活了隐匿的翦接位点，产生供体或受体位点，引起辩常剪接，邋种突变一般产生旷地贫。影响翻译的突变包括无义突变、错译突变和移码突变，产嫩无功能 或菇碧酶珠蛋鑫ｆ”。§臻蛋皇不怒区域功能不惩，第二终照子编码 斑甄索结合域和１７，ｌ§２缩合城，第三癸显子编码毡１１３ｌ结含域，ｂｏｂｆ 效威区和２，３．ＤＰＧ结合功能城现对弥散。发生于不同外鼹子区域 的突变对珠蛋白功能的影响不阍【ｌ】。 ‘§缝贫鬏据稳廉表疆可分麓重涯瑟遣赘、孛矮鍪§螽鏊贫、轻鍪 ｐ地贫。重证地贫表现严重，浠要长期输疯。分子基础为２倍体染色体上２个Ｂ基因均发生突变导致功能丧失，没有ＨｂＡ产生。中闻蘩缝贫表现为明显的贫盎健不霈要长期输艇，分子基硪可以是２个§基因均发生突交，其中一个是∥突变舅一个是§＋突变，或２个ｐ基因均为ｐ＋突变，或２个Ｄ基因突变会并ａ基因突变，有时 ９地贫杂合子表溅较重者也被归入中间型地贫的范畴。轻型Ｂ地贫 套圈嚣豹枣缨魏｛蕊色素表瑗，褒凌轻度贫纛或不表瑗瓮斑，麦逮 贫杂合子，其中一个ｐ基因发生突变，另～个ｐ基因正常。ｐ地贫 基因突变类型和临床表现严徽程度之间关系复杂，同一突变在不 圈遗传背景人群中临床表现不隧。如发生予窟动子区的．２９突变， 在熬人中表墅羹予阖一突变凌中国人中豹稳床表鍪，哥簸是遗传 背景不同造成的ｖ基因表达潜能不同造成的。 Ｂ地贫的世界分布与ｎ地贫基本相同，猩热带亚热带地区如地 中海漤嫠藿家，溺终度耍潮、薅渊、美溯嚣豢。叠缝贫蒸因类型存 在谶域差异。目前全世界发现的地贫突变熬颡超过２００种，但对 于一个特定的地区，往往５种左右的突变必型占该地区Ｂ地贫患 者綦困类型鲍９０％以上。在中阑南方最为常见鲍５神Ｂ地贫为ＣＤｓ４ｌ，４２（－ＴＣＴＦ），ＩＶＳ．２―６５４（Ｃ＞Ｄ，．２８（Ａ》国，ＣＤｌ７（Ａ＞｜两，翻ＣＤ７１．７２（＋Ａ）。此外在中国南方还发现ＣＤ２７／２８（＋Ｃ）、ＣＤ４３（Ｇ－）Ｔ）、．２９（Ａ专Ｇ）、１３８：ＣＤ２６（Ｇ－－）Ａ）等Ｂ地贫突变糖因【２１。 我弼在对广东塞羁会枣艨佟瓣程、§＝｝｜蠡黎菸分子淡努瘸学调查中发现了一例薪的６地贫突交病例，为－９０（ｃ―Ｔ）突变，在中国入 群中尚属首次报道。Ｂ珠蛋自旗因上游启动子区在．１０５位和．９０位 各禽有一保守的ＣＡＣＣＣ序列等，红系特器转录因子（Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ３０ＫｒＢｐｐｅｌ．１ｉｋｅｆａｃｔｏｒ，ＥＫＬＦ）与之结合，对Ｂ珠蛋白基因的转渌起正 囱镶控静作用。ＥＫＬＦ通过其锌撂绪梅与成入的Ｂ珠蛋盎感动予区 戆９个璇基结合，双瑟起弱瑟§豫豢彝鏊霞豹转录正淘溺控豹幸筝 用，ＣＡＣＣＣ保守挎列内的单个碱基突变将导致ＥＫＬＦ与ＣＡＣＣＣ 结合的亲和力下降，尤以近端ＣＡＣＣＣ（－－９０位）序列突变影响显 藩，导致Ｂ珠蛋自熬因转录水平的下降。到目前为止，在ＣＡＣＣＣ 盒中出现的突变类溅基有有９秘，他们是：．９Ｚ（Ｃ－－Ｔ），一９０（Ｃ－。Ｄ， 一８８（Ｃ－＊Ａ），一８８凹一习，一８７（ｅ―Ａ），一８７≮一Ｇ），－８７（Ｃ―Ｄ，一８６零一Ａ） 翻．８６（Ｃ―Ｇ）［３１。我们对发现于中国人中的．９０（Ｃ－＋Ｔ）突变斑诞者家 蕊进行了表型和撼阑型的分析，并对突嶷基因表达水平猩ｍＲＮＡ 水平进行了分析。实验材料一．样本先证者，女性，２６岁，双亲的祖籍均为广东省四会市人。在 婚前检查中发现其具有Ｂ．地贫的血液学表型，经包含中国人常见 １１种突变的ＲＤＢ诊断未发现己知类型的Ｂ．地贫突变，遂将其及其 家系成员作为进一步分析对象。 二．试剂 （一）基因组ＤＮＡ抽提试剂：见第一部分（二）ＰＣＲ试剂：见第一部分 （三）电泳试剂：见第一部分（四）ＲＤＢ试剂：见第一部分（五）ＲＴ―ＰＣＲ试剂：见第一部分（六）测序：由博亚生物技术有限公司完成三．仪器：同第一部分四．软件：同第一部分实验方法～．血液学表型分析取先证者及其豢庭成员外周静默暾，红缨胞指标累愆搬缀胞 爨韵分辑致（Ｍｏｄｅｌ Ｓｙｓｍｅｘ Ｆ．８２０，强零Ｓｙｓｍｅｘ公司）援溺；盘 红蛋白电泳及定鬃分析采用快速自动嘏泳分析系统（ＲＦＰ，美国 Ｈｅｌｅｎａ公司）检测。 二．基因组ＤＮＡ提取＃ 取先证者，鳃谴者父母，先证者蛩弼及先证者丈夫共５人外 躅羚辣盘，按第一郄分奔绥靛方法爨淑嫠嚣缰ＤＮＡ，算竣测ＤＮＡ纯度和定量。三．基因型分析 １．中国人群中常见６．地贫突变筛查中匿人群中常见的Ｂ地贫突变筛森采用本室建立的反向点杂 交（ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔ ｂｌｏｔ，ＲＤＢ）蔽零【４】。霹戳蘑辩捡溅孛滏久中誊冤 豹１１秘点突变。２．Ｂ珠蛋白基因全长测序：设计引物，ＦＰ５’ＡＡＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣ３’（７０１４５―７０１７０，Ｎ６ ｏｏｏ００７），ＲＰ５＇ＡＴＧＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＴＣＣＣＴ３’（７１９４４?７１９７７，ＮＧ＿０００００７），扩增片段为包括ｔ３臻强自基因窟动予隧．１６４使和８珠蛋自麓瓣终止 蜜码予嚣１９５ｂｐ凌肉豹ｌ，８ｋｂ片段。ＰＣＲ产貔壹接嚣枣，浚诗舅终 ２对测序引物，测４个反应，每个爱藏都有重叠序列。 四．基因表达水平分析 １．ＲＮＡ提取：按第一部分介绍的方法提取先证者，先诋者父母， 先证者哥哥及先诞畿丈夫共５人外周腹网织红细胞ＲＮＡ ２。按蔻述方法遴蟹ＲＮＡ定量帮筑凌、完整蛙分援。 ３。ＲＴ－－ＰＣＲ分褥纂嚣表达水平： ＲＴ－－ＰＣＲ方法、引物同第一部分，反应条件参照第一部分，略有改动。样本选择：１３例Ｂ地贫携带者、ｌＯ例正常样本、３例－９０突变携带者。结果与分析一．表型结果 觚液学表型分析结果见表２．１，先证者、先证者母亲和先诋辫 哥哥绂缨您呈小缀胞低像素改变（ＭＣＶ、ＭＣＨ降低），ＨｂＡ２增 离（ＨｂＡ２＞３．５）。夏乡｝宠谖磐丈夫恣毒枣缨蕤镪毽素改变，毽ＨｂＡ２ 降低，－陌疑为程逸贫患者。Ｔａｂ ２－１ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｄａｔｅ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆｔｈｅ ｐｒｏｂａｎｄ ａｎｄ ｈｅｒ ｆａｍｉｌｙ二．蒸因型结果濑过反向点杂交（ＲＤＢ）排除了中国人中常见的１１种Ｂ地贫点突变，对该家系成员邋过ｇａｐ．ＰＣＲ诊断中豳人中常见的一＿Ｓ叶， 一３．７／，。Ｊ－２施遣贫突变，邋过Ｒ王＞Ｂ翻捡测诊凝粼ｏｓ／，。【联Ｑ专等发缎子域蒸嚣感突变。发褒炎诞者丈夫静基嚣羹麓～８琶Ａ恕程，磊其余毅 使成员朱发现已知的旺戏Ｂ地贫突变。 通过Ｂ基因全长测序和ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｂｌａｓｔ发现此家系中有三个 成员（先证者，先证者母亲和其兄长）均为Ｂ．珠蛋白基因启动予点游运薅ＣＡＣＣＣ鑫豹－９０像ｃ一羊突交戆杂合孑。惫涯者鹣测穿 绐果见图２－ｔ（Ｓｅｅ母：ＡＹ２６０７４０）。ｐａｇｅ４３）。此序列国提交ＧｅｎｅＢａｎｋ ｒ登录三．８珠蛋警蒸因表达承平分拆 取２ｕｌ溶于ＤＥＰＣ处理水的ｍ＿ＲＮＡ。于ｌ％琼脂糖凝胶电泳， 梭测ｍＲＮＡ的完整性，见圈２－２（Ｓｅｅｐａｇｅ４４） 毡Ｉ窝§．璩蟹鑫基因匏摹繁多重ＲＴ－ＰＣＲ产锈毫泳飘燹２。３（Ｓｅｅｐａｇｅ４４）。根据ＲＴ－ＰＣＲ产物的半定量分析结果计算出６旭的比值，终果显示：．９０突变杂合子的ｐ旭的比值（２．２３３士０．０１，ｎ＝３）较正常 入样品的比值（３．７７９士１．１９，娃＝１３，９５％ＣＩ：３．０６０，４．４９９）有明显的 下降，两与零冤兹８逮贫条合子糕晶黪跑值往．ｉ１０圭０．５３，ｎ＝砖， ９５％ＣＩ：１．７３２，２．４８８）无差别，说明．９０突变使Ｂ珠蛋白基因转录水平降低。我们在广东销四会市ｐ蛾贫筛查中发现了新的§蛾贫突变基 因一ｐ一珠蛋白基因启动子区ＣＡＣＣＣ序列．９０位ｃ―Ｔ突变，在中 匿人中尚属首次报道。通过家系分析和ＤＮＡ童接测序确诊先证者、 先淡蠹哥哥、突｛囊者母亲为－９０突变携带豢，毯铜买有酝毽８途贫 典型的临床表现即小细胞低色素、没有明显贫ｍ征（ＭＣＶ６８．２―７３．６ｆＬ；ＭＣＨ ２１．８―３３．０，Ｆｉｂ Ａ２ ５．７。６．４％，Ｈｂ １０５ｍ１４４）。我钠遮过ＲＴ－ＰＣＲ在ｍＲＮＡ承平磅究了突变§豫蛋鑫基嚣表达东平 的变化，发现§珠蛋自ｍＲＮＡ表达较正常个体降低，与其他§遗 贫熬因携带者ｍＲＮＡ表达水平没有明显麓舜。 人类Ｂ．珠蛋白基因启动予区包含多个保守序列，这然序列是 转泶调控鑫予豹结合谴焘，羹中宏动予上游鹣近翡－９０健窝运潺 ．１０５位各有一个ＣＡＣＣＣ序列，该保守序列是红系特异的转录因子 结合位点（ＥｒｙｔｈｒｏｉｄＫｒｉｉｐｐｅｌ。ｌｉｋｅｆａｃｔｏｒ，ＥＫＬＦ）。通过与保守序列缝合，ＥＫＬＦ聪８球蛋白基爨转录起正囱诞控的｛乍用嘲。迄今，全球汪报道的弓淹ｉ ８地贫的．９０键ＣＡＣＣＣ澎猁突交有９种，绝稍是；－９２（Ｃ－－－＋Ｔ），一９０（Ｃ―Ｔ），?８８（ｃ―Ａ），一８８（Ｃ－－＊Ｔ），－８７（ｃ―Ａ），－８７（Ｃ―Ｇ）， －８７（Ｃ―Ｔ），一８６（Ｃ―Ａ）和．８６（Ｃ－－｝Ｇ）１１；Ｉ’现融涛楚，近端（一９０） ＣＡＣＣＣ彦褒突变毙远建（一１０５）突变髻羧ＥＫＬＦ与ＣＡＣＣＣ缝 台力下降更为鼹藩，从而明擞影响Ｂ珠鬣自基因的转滚水平。我 们用ＲＴ―ＰＣＲ对Ｄ．珠蛋白基因．９０Ｃ－）Ｔ突变罄因转录水平进行的分 掇缡果零证了这一点。 ６．珠蛋骞秘谚子区－９０Ｇ川突交首次发现予葡萄碧久［７１，在全球的其他地区尚来见有报道。我们首次农中国人群中发现了这～ 突变，根据我们新近完成的四会市地贫的分子流行病学调查资料 嚣示，在１５２４谂楚程样本中，莰捡灏出ｌ镶－９０突变，占簿壹毒 的５９例８．地贫杂合子的１．７％｛８ｌ’属中国人中的稀少突变。 国南方的Ｂ＋地贫主要分布于广东、广西、海南等地区，目前 已程华南地区（锻摄台湾）发现２５静§．地贫突变，其中鬻觅鲍５秘左右突交约占爨套§一逮爨等位墓霾数９０％。本文发溪夔突交，瓣 予丰富中豳入群中的Ｂ＊溉贫突变谱和指导遗传咨询和临床诊断其有一定的意义。参考文献１．Ｒｏｎａｌｄ Ｈｏｆｆｍａｎ．Ｅｄｗａｒｄ Ｊ．ＢｅＩｌｚＪｒ，Ｓａｎｆｏｒｄ Ｊ．ＳｈａｔｔｉｌｅｔａｌＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ－ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ １， Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ａｓｉａ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ ２００１，ｐ４８５―５０９２．Ｘｕ ＸＭ，Ｚｈｏｕ ＹＱ，Ｌｕｏ ＧＸｅｔａｌＴｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｐ＃ｃｔｒｕｍ ｏｆ ａｌｐｈａ ａｎｄｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ ｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｈｅａｌｔｈ ｂｕｒｄｅｎａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ＪＣｌｉｎ Ｐａｔｈ０１．２００４Ｍａｙ；５７（５）：５１７―５２２．３．Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ ＤＪ．ＣｌｅｇｇＪＢ．２００１．Ｔｈｅ ＴｈａｌａｓｓｅｍｉａＳｙｎｄｒｏｍｅｓ．矿ｅｄ．ｄｏｔ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒＯｘｆｏｒｄ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．ｐ２３７―２３８４．Ｚｈａｎｇ ＪＺ，ＸｕＸＭ，Ｍａ ＷＦｅｔａ１．Ａ ｒａｐｉｄｒｅｖｅＴｓｅａｌｌ １８ ｂｅｔａ ｔｌｍｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｏｉｌ ＰＬＡ． １９９３，８；２１３５．李莉艳莫秋华徐湘民反向点杂交快速诊断非缺失型ｃ【．地 中海贫血中华医学遗传学杂志２００３年０４期６．Ｈａｒｕｈｉｋｏ Ａｓａｎｏ，Ｇｅｏｒｇｅ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ１３－Ｇｌｏｂｉｎ ＰｒｏｍｏｔｅｒｂｙＥｒｙｔｈｒｏｉｄ Ｋｒｉｉｐｐｅｌ―ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，１８：１０２―１０９７．Ｆａｕｓｔｉｎｏ Ｐ，Ｏｓｏｆｉｏ―Ａｌｍｅｉｄａ Ｌ，Ｂａｒｂｏｔ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｅｊｕｎｃｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｓ ａｄｄｔｏ ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃ，ｃｌｉｎｉｃａｌｏｒｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｂｅｔａ―ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｒｔｕｇｕｅｓｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，１９９２，８９：５７３―５７６８．谭金荣，李文军，马建英等四会市Ⅱ和Ｄ地中海贫血的分子流 行病学调查《第一军医大学学报》２００３年７期３８（Ａ） ＭＮ Ｌ Ｐ㈣ＭＮ Ｌ ＰＭＦＭＦ型１２．５ｋｂｔｏ１５ｌ【ｂ １０ｋｂ７．５ｎ２．５ｋｔＦｉｇ １－２ Ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｆｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ．Ａ ｓｈｏｗｓ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈＢｇｌ―ＩＩａｎｄ Ａｃｅ６５一Ｉ，ＢｗｉｔｈＤｒａ－Ｉ．Ｎ、Ｌ、Ｐ、Ｍ、Ｆ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｎｏｒｍａｌ、ｌｅｆｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ、ｐｒｏｂｏｎｄ、ｍｏｔｈｅｒ ｆａｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｂｏｎｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍ ｉｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｂａｎｄｓａａｎｄｍａｒｋｅｒ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｉｇｕｒｅ １―３．ｓｉｚｅ（Ａ）Ｎ Ｌ Ｐ（Ｂ）Ｎ Ｌ ＰＭＦＭＦ１２．Ｉｋｂ 古８．４ｋｂ ７．９ｋｂ４．８ｋ自古２．９蛐３．８ｌ出Ｆｉｇ１－３Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｐｉｃｔｕｒｅｕｓｅｄ‘ａｎｄｍｏｔｈｅｒ ａｎｄ０ｐｒｏｂｅｍａｔｃｈｅｄｗｉｔｈＢｇｌ―ＩＩ／Ａｃｃ６５一Ｉ ａｎｄＤｒａ－Ｉ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｎ、Ｌ、Ｐ、Ｍ、Ｆ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｎｏｒｍａｌ、ｌｅｆｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ、ｐｒｏｂｏｎｄ、 ｓｉｚｅ ｏｆ ｆａｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｂｏｎｄ ｉｓａｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｂａｎｄｓｓｈｏｗｓｂｅｓｆｄｅｔｈｅｐｉｃｔｕｒｅ．Ａｐｍｄｕｃｅｄ ｂｙ＜ｐｒｏｂｅ ｍａｔｃｈｅｄ ｗｉｔｈ Ｂｇｌ－Ⅱ／Ａｃｃ６５－Ｉ．Ｌｅｆｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｈａｓａｂｎｏｒｍａｌ ｂａｎｄ ｏｆ ７．９ｋｂ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｒ ｍｏｔｈｅｒ ｈａｖｅａｎｎｏｒｍａｌｐｅｒｓｏｎｗｈｉｌｅ ｐｒｏｂｅｎｄ ａｎｄａｂｎｏｒｍａｌｂａｎｄ ｏｆ ８．４ｋｂ．Ｂ ｓｈｏｗｓ ｐｉｃｔｕｒｅ ｍａｄｅ ｂｙ ａｎｄ ｈｅｒ ｍｏｔｈｅｒ ｈａｖｅ ａｎｄ ｌｅｆｔａｎ０ ｐｒｏｂｅ ｍａｔｃｈｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｒａ．Ｉ．Ａ１ｓｏ ｔｈｅ ｐｒｏｂｏｎｄ ａｂｎｏｒｍａｌｐｅｒｓｏｎｓ．ｂａｎｄｏｆ２．９ｋｂｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌｄｅｌｅｔｉｏｎｔ Ｐｒｏｂｅ戡弧Ｋ｛ｑｏｑｎ０｝酬‘ｐｒｏｂｅ ３．＆１王ｌｋｂ ＤＳ－０ ｐｒｏｂｅｌ■■■―――■１１。１ｋｂ ｄｅｌｅｔｉｏｎＡｅｅ瞄ｌ（＆４啪ｅｏｉｉ４。８ｂＤＩ柚伍９ｋ均Ｆｉｇ １－４ ｆｉｇｕｒｅ Ｉｎｄｉｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ １１．１ｋｂ ｄｅｌｅｔｉｏｎ．Ｆｒｏｍ ｔｏｐ ｔｏ ｂｏｕｏｍ ｔｈｅ ｓｈｏｗｓ ｔｈｅ ｓｃａｌｅ，ａｌｐｈａ－ｇｌｃｂｉｎ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ，ｐｒｏｂｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅｉｒａⅡｊｏｗ．ｄｅｌｅｔｉｏｎｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，一攀ｄｅｌｅｔｉｏｎｓｃｏｐｅ．３’ｓｐｌｉｔ ｓｉｔｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓｂｙｏｆａｎｄｔｈｅｅｎｚｙｍｅＡｃｃ６５一Ｉ，Ｂｇｌ―ＩＩ，Ｄｒａ－Ｉ ａｎｄ ｐａｒｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔｓ ｓｉｚｅ．Ｒｉｇｈｔ ｐａｒｔｏｆ ｔｈｅｆ碴ｕｒｅｓｈｏｗｓ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ａＵ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅｐｉｇｍｅｎｔｓｍａｔｃｈｅｄｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ５ ｐｒｏｂｅｍａｔｃｈｅｄｗｉｔｈＢ９１．ＩＩ／Ａｃｃ６５一Ｉ ａｎｄ ０ｐｒｏｂｅｗｉｔｈ Ｄｒａ－Ｉ．ｔｈｅｅｑｕａｌ ｔｏ ｔｈｅｎｕｍｂｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｃｋｅｔ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ 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裙、先证者母浆、先证者姨妈、先证者外婆为一¨‘１／ｃｔｃｔ携带者。通 过ＲＴ－ＰＣＲ技术分板了基因溅为＿１１．ｔ／ｃｔｏｔ的患者仪珠蟹岛表达水平麓交镬二，～㈧触意者与．ｊ融勉强患者§叙魄率摇当，鞠嚣离予正鬻人Ｂ／ｄ比率，说明ａ珠蛋白袭达降低。在１３－９０／ＢＮ突变的鉴定中，首先采用ＲＤＢ的方法诊断常见于中黧入中魄１ｌ秘患突变，缝巢为陵性。隧艨采取１３基裁全长测序黪 方法，获褥邋晕中新的突交类整。对先谨糟家系分析的结采证实了 先证者母亲、先证者哥哥也是Ｂ。９０／Ｂ“携带者。同样采＿肆ｌ ｌｉｔ．ＰＣＲ的 方法研究了这种在中国人中发现的新１３地贫突变携带糟１３珠蛋白 裘这拳乎戆变纯。缝采显暴这秘突变璃鬟静降低了§豫蛋自基霆的表达。我们的发现增添了目前世界上地贫濑因的种类，丰富了对中圈人中弘Ｂ地贫基因类型鲍认识