小型猪在毒理学研究中的应用
由于解剖和生理学特性与人类相似 ,猪已成为生物医学研究中独特的模型动物。在心血管系统、消化系统、泌尿系统、皮肤、整形外科以及异种脏器移植研究中广泛应用。自从 194 9年第一个小型猪———明尼苏达小型猪 (Minnesotaminipig)培育成功后 ,猪作为实验动物开始引入药理和毒理学研究领域。目前 ,国际上已培育出许多遗传稳定的小型猪品系 ,随着在毒理学研究中应用数量的增加 ,背景资料也愈加丰富。1　一般毒理学研究对新的化学药物的一般毒理学研究 ,国际性的指导原则要求选用两种动物 ,一种为啮齿类 ,另一种为非啮齿类。狗和猴是非啮齿类中的常用动物。由于猪在代谢和一些药物的代谢动力学方面比狗和猴更接近人类 ,因此 ,很多学者认为小型猪可作为非啮齿类的又一个选择。Brandt等[1] 对 15 35 8只SPF哥廷根小型猪(G ttingenminipig)的体重遗传表型进行了分析 ,结果表明 ,经 30余年的人工培育 ,哥廷根小...&
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在药物和化学物安全性研究中,通常使用啮齿类和非啮齿类动物,而非啮齿类动物常选择犬和灵长类。猪解剖学和生理学的某些特性与人非常接近,已经广泛应用于医学研究中,但在毒理学研究中很少使用。自从1949年第一个小型猪———明尼苏达小型猪(Minnesota minipig)培育成功后,小型猪作为实验动物开始引入药理和毒理学研究领域。目前国内外已培育出很多遗传稳定的品系。小型猪具有基因纯和度相对较高、遗传稳定性强、体型小和便于饲养等优点。已有证据显示,小型猪对很多化学物都很敏感,对某些特殊药物的反应性比传统的非啮齿类动物可能更具有优势。因此,愈来愈引起毒理学家和管理机构的关注。本文扼要综述了小型猪在毒理学研究和安全性评价中的应用现况。1小型猪在毒理学研究中的应用1.1吸入毒理学迄今,有关小型猪吸入毒性的研究资料还很有限。Koch等[1]最先提出用小型猪研究吸入毒性,他们通过静脉注射和经鼻吸入两种方法,比较了维拉帕米的药物代谢动力学。另一个...&
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由于小型猪的生理学和解剖学与人类有很大的相似性 ,因而广泛应用于下列生物医学和其他领域的科学研究。①心血管 :解剖学 ,室性功能 ,冠状动脉分布 ,电生理学 ,诱发动脉粥样坏死。②皮肤 :色素沉着 ,色素缺乏 ,无毛症、过敏反应 ,阳光爆晒和愈合过程中皮肤通透性反应。③胃肠道 :消化过程与人极为相似 ,可用于研究药物在口腔内的动力学变化。④肾脏 :在形态上与人极为相似 ,小猪胎肾和新生肾的成熟特性和新生儿相似。⑤免疫系统 :研究猪淋巴细胞抗原 (SLA抗原 )在调节细胞免疫反应和移植排斥反应中的作用。⑥牙 :乳牙和恒牙的长出情况和X线衍射。⑦营养 :生理性和杂食性的相似性 ,有助于营养学的研究。⑧围产期 :慢性胎儿导管研究。胰脏功能研究 ,胎儿激素研究。心跳速率研究 ,新生儿心血管功能研究 ,败血性休克和静脉内营养过剩研究。在其他研究领域内 ,小型猪作为实验动物其用途与日俱增。SPF小型猪在国外早已进行培育和饲养。用什么样设施设...&
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1997年Pateince等[1] 首次发现猪内源性反转录病毒 (porcineendogenousretrovirus ,PERV)在体外可以感染人的多种细胞 ,这一发现引起了人们对异种移植安全性的广泛关注 ,人们担心带有PERV的猪的细胞或器官一旦植入高度免疫抑制的人体内会否突破种间屏障造成人源大流行[2 ,3 ] 。因此 ,猪内源性病毒的研究与检测是猪→人异种器官移植、人用猪源生物制品等生物安全性的基础 ,也是进行高等级医学实验的前提。我国有着异常丰富的猪种资源 ,特别是各种小型猪更是适合医学实验研究和人类异种移植的首选供体。根据高等级实验用猪的要求和我国猪病毒学发展的现状 ,我们对中国实验小型猪中PERV的存在与表达情况进行了系统的检测 ,这对进一步开发利用及保护良种资源具有重要的意义。1　材料与方法1 1　实验材料中国实验小型猪 (解放军总医院实验动物中心提供 ) ;EDTA、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶购自华美生物工...&
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流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus,JEV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)成员,乙型脑炎病毒基因为单股正链RNA,病毒颗粒呈球形,有包膜,直径40~60nm,病毒粒子呈20面体对称[1-4]。由乙型脑炎病毒引起的流行性脑炎简称乙脑,乙脑是一种人畜共患的自然疫源性疾病,是以中枢神经系统损害为主的急性传染病,带毒猪是本病的主要传染源[4,5]。因此防治乙脑不仅可以减少养猪业的损失,并通过猪的免疫预防,可控制本病在猪及人群中的流行。我国于1949年在北京首次分离到乙脑病毒,随后在其他地区也相继分离到该病毒[6]。乙脑主要流行于亚洲国家及地区,近年来流行区域不断扩大,已经扩展到澳大利亚,韩国、泰国、印度尼西亚的爪哇、俄罗斯西伯利亚的滨海地区等相继有乙脑的报道。我国除新疆、西藏、青海省外,其余各省均有发病流行,是严重危害公众健康的重要传染病,乙脑已成为世界关注...&
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小型猪麻醉的传统方法为腹腔注射20 mg/kg氯胺酮、0.025 mg/kg阿托品[1]。有人对麻醉方法进行改进,肌内注射氯胺酮复合戊巴比妥钠[2]。或用陆眠宁复合氯胺酮进行基础麻醉或诱导麻醉,效果良好[3]。首都医科大学平谷教学医院曾用陆眠宁复合咪达唑仑,完成诱导麻醉[4]。但以上方法使用较为狭小的笼具去限制动物的活动,致使生性胆小的小型猪在实验前就出现躁狂、应激,影响麻醉药品的使用剂量及实验数据采集。图1自制麻醉吹管泰达国际心血管病医院(以下简称泰心医院)动物实验中心也曾借鉴其他科研单位的动物笼具设计,利用可移动挡板,限制动物的活动,完成皮下、腹腔或肌内注射麻醉。但多数动物会出现惊恐、神情紧张的表现,以及笼内疾走、冲撞笼壁、试图外逃等强烈的应激行为。既影响麻醉效果,又影响相关的检查项目。如,动物应激后血糖会升高,心率加快甚至出现心律失常,影响18F-FDG心肌代谢显像。泰心医院动物实验中心在年,利用自制麻醉...&
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。我国高原地区急性重型高原病并发多脏器功能障碍综合征(multiorgan dysfunction syndrome,MODS)的发病率较高[1,2]。高原地区发生MODS(H-MODS)后虽然在本质上与平原MODS没有差别,但从平原进驻高原后随着海拔高度的上升,以缺氧的环境因素逐渐成为主要影响因素。从而不同程度地改变了MODS的发病过程、临床特征和预后,使其治疗方案也随之发生了显著变化[3]。而H-MODS在治疗中的不确定因素比平原地区更多、变数更大,使得难以全面细致观察H-MODS患者病情变化的全过程。H-MODS动物模型是研究其发病机制和临床防治的基础,但目前研究所使用的实验动物均为低海拔或中度海拔生长培育的[4-7],不具有高原生物学特性。在建立高原疾病模型时,不同海拔地区的动物对所建模型的质量是否存在差异未见报道。而在研究中低海拔地区生长的实验动物自身会出现不同程度的高原反应,受高原环境的外在因素的影响很大,这就难免使...&
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Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology
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第十二章 体外实验与生物技术在毒理学中的应用
第十二章体外试验与生物新技术 在毒理学中的应用第一节 体外试验毒性试验的目的在于获取一定的数据，为社会需要的外源化学物的安全使用做出判断。 过去利用整体实验动物模型或称体内试验(in vivo test)模型所提供的资料，判断外源化学物 及其制品和混合物等对人类健康是否具有损害作用。体外试验模型(in vitro test)在上述过程 中也起着重要的作用，尤其是机理研究方面。但是，在毒理学研究中整体试验研究的观点仍 占主导地位。目前，此种观点已发生变化，因为：①全世界每年约有千种以上的新化合物作 为商品进入人类的环境。 而且在现有的化合物中， 还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。 在此种情况下， 利用经典的整体动物试验取得完整的毒理学资料极为困难。 解决此种问题的 重要方向是体外试验。 ②现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费， 而 体外试验则可节省时间和经费。③动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而 且应当尽量减少痛苦地处理动物。 ④更重要的是由于生物技术的巨大进步， 不仅表现在细胞 组织及器官培养领域， 而且在生物分子技术方面， 也为毒性试验和研究提供了新的方法和工 具。所以体外试验在毒理学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。但也需 指出，体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才 能为毒理学研究提供坚实的科学基础。 一、概述 (一) 分类 毒性试验的目的是提供一些适当的资料， 以便确定有关化学物的毒理学性质。 在有些情 况下， 是要决定一种化学物在所预期的条件下使用是否安全， 如新药物开发即需要这一评价。 在有些情况下， 例如新工业品或日用化学品的开发， 必须决定一种新化学物的接触安全限量。 了解体外毒性试验在上述毒理学决策过程中有何意义， 对于评价体外毒性试验在毒理学中的 地位极有帮助。可依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为 3 类：①筛选试验。它仅 提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。②附加 试验。它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有 它是不够充分的。③替代试验。它是在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物 试验，以提供更多的信息。 (二) 基本原理 体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏 感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。如将敏感细胞或某分子靶部位例如 酶，在体外条件下，维持其正常的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，即将毒理学中 毒物中毒的启动阶段， 在体外条件下， 观察其对外源化合物的反应和外源化学物对它的作用。 基于上述原理， 体外试验模型取材范围很宽， 可取哺乳动物的离体脏器灌流、 脏器切片温育、 细胞培养、亚细胞器组份以及提纯的某些酶分子或 DNA 分子等等。 (三) 体外试验的优缺点308体外毒性试验的优点可归纳在表 12―1。 表 12-1能控制环境因素 可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响 每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等 试验间的误差较少 可同时和／或反复多次取样 可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培养等 较为快速和经济 需要较小量的受试化合物 产生较小量的有毒废物 可以利用人体细胞 减少整体动物的使用体外毒性试验系统的优点其中特别值得一提的优点是体外试验的简便和易于利用人体细胞。 体外毒性试验结果可 迅速得出， 将减少了解新化学物毒理学资料所需的时间， 最终可以缩短从新化学物的合成到 产品进人市场的时间过程。此外，对鉴定毒理学资料有问题的新化学物，可及时终止开发， 减少由资源到产品的投入。 在毒理学整体试验中禁止直接进行人体试验。 但毒理学试验的目 的是关心人类健康， 目前主要是将动物试验结果外推至人类， 物种间差异为其不确定因素之 一。在体外试验中，利用人体细胞组织进行试验，可较好地解决物种差异的问题。 体外毒性试验系统的利用在目前尚有不足之处： ①体外到体内外推的问题。 体外试验是 依据毒性作用的始发阶段及继续发生的分子与细胞反应， 其与整体系统有差异， 如何将产生 体外毒性的体外浓度与相应体内剂量联系的问题是最终未解决的难题。 它需要更好的工具― ―预测性毒物代谢动力学来解决， 其关键在于发展有生理学基础的毒物代谢动力学模型。 另 一方面， 体外毒性试验中缺乏毒理学反应的调控因素， 如细胞与组织的修复过程和免疫系统 的不同类型细胞间的相互影响等。 假如有了更全面的毒理学过程的基础知识， 可设计更符合 整体动物模型的体外系统。 但现阶段毒理学作为一个学科的发展尚缺少许多重要的资料。 ② 体外毒性试验难以预测慢性毒性。因为，慢性毒性病理过程的机理所知甚少，缺乏发展体外 试验的理论依据，再者，某些体外系统仍难以达到长期维持生理状态的要求。 二、体外试验系统 (一) 脏器灌流 1. 肝脏灌流 是毒理学中研究外源化合物对肝脏损伤及代谢的常见方法。在灌流液中 加入外源化学物，此外要维持灌流液的 pH 值、氧含量，还要控制适宜的灌流液流速。一般 是以下腔静脉和门静脉为插管灌流通路， 为此应结扎肝动脉、 上腔静脉， 在恒温条件下灌流。 有报道用肝灌流方法研究四氯化碳及其氢取代衍生物三氯甲烷与二氯甲烷对肝脏毒性， 结果 + 发现随着灌流时间延长(在 4h 之内)，灌流液的上清液中 K 、谷丙转氨酶(SCPT)、山梨醇脱 氢酶(SDH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)增加，说明三种化合物对肝细胞均有损伤，而以四氯化碳 为最，且依氯原子被氢取代肝毒减低。需指出肝灌流时间不能过久，以 4h 之内为宜，否则 肝细胞的功能与生存不能维持。3092. 肠灌流 利用某一部分小肠体外灌流可以研究一些化合物的吸收及动力学过程。如 用大鼠，则在麻醉下切腹分离一段小肠，在保持原有血液循环体系下，将肠两端插管，清洗 净肠中内容物，在恒温环境中灌入灌流液。例如有人研究锌的吸收及其影响因素，以大鼠回 肠段为标本，证实锌吸收呈二室模型(肠腔为Ⅰ室、肠粘膜为Ⅱ室)，苯丙氨酸能增加肠腔与 肠粘膜之间锌的交换，且加速向血流的清除过程。 3. 膈肌-膈神经标本 取完整的大鼠膈肌-膈神经置于恒温灌流液中， ，在几小时之内可 维持基本正常的神经肌肉传导。这种标本可用在研究神经毒物对神经传导功能的损伤及强度。 (二) 脏器切片 肝脏、肾脏、脑部及心均可以制备切片。例如，脑片和心肌条等是将组织片置于恒温的 孵育液中进行有关试验研究， 但需注意切片中的细胞需保持完好的细胞基质和细胞之间的交 流。切片厚度一般在 250μ m。不同研究期间有别，如肝切片研究 CytP-450 不应超过 8h， 脑切片一般在 6h 左右。 此系统的优点是保持了细胞之间的结构， 其操作也比脏器灌流容易。 不足之处是切片内的细胞易于缺氧，且受试物也不易均匀到达细胞内。 (三) 原代细胞培养 1. 肝细胞原代培养 肝细胞尚未建成传代的细胞株系，多用原代培养。肝细胞原代培 养期间细胞不分裂、不增殖，但发现基因转录是存在的(培养初期 24h 在 1％或以上)。细胞 原代培养维持生存期 1～2 周，但是 CytP-450 却在 24～28h 活性减少 50％左右。据报道人 肝细胞中 CytP-450 活性稳定性比大鼠强。 利用原代培养的肝细胞可以进行多种毒理学研究。 如研究化学物的肝脏毒性， 一般认为， 用原代肝细胞培养筛检与鉴定是否化学物具有肝脏毒性较为可靠， 与体内试验相符合。 有报 道以肝细胞损伤后某些酶释放为指征，研究 30 个化学物，结果除少数化学物在肝细胞培养 中表现毒性比体内试验低之外， 多数化学物内外毒性符合一致。 在体外试验表现毒性较低的 化学物有环已酰胺(cycloheximiole)、溴苯(bromobenzene)和长春新碱(vincristine)等。 2. 巨噬细胞 豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法获取肺巨噬细胞，小鼠可用腹腔灌洗获得 腹腔巨噬细胞，甚至人也可通过肺灌洗得到。巨噬细胞可以用于多种体外试验，例如利用巨 噬细胞的免疫功能检测外源化学物的免疫毒性， 又如利用巨噬细胞检测以肺脏为毒理学终点 的外源化学物的中毒毒性和机理。关于后者，有人利用豚鼠肺巨噬细胞原代培养纯化后，研 究二氧化硅(silica，SiO2)致矽肺的机理。 3. 淋巴细胞 多用小动脉脾脏分离淋巴细胞或进一步分离 T、 B 淋巴细胞进行免疫毒理 研究。例如研究镉的免疫毒性，证明镉可以抑制淋巴细胞转化和抑制白细胞介素-2 的产生， 且在一定条件下使淋巴细胞内游离钙浓度增加及钙调素(CaM)活性降低，此为镉的免疫毒性 机理研究提供了线索。 4. 脑细胞 分离的新鲜脑细胞有助于研究外源化学物对神经系统损伤的评价与探讨其 机理如用小鼠大脑皮质分离、温育后，研究二价阳离子钙、镁、锌、镉等对皮层神经细胞的 损伤，发现这些离子随着浓度的增加，脑神经细胞的电泳迁移率逐渐减慢。 随着脑细胞技术的发展， 还可在温育体系中存在外源化学物情况下， 用微电极插入脑细 胞，通过电信号的变化，更深入地研究外源化学物对神经细胞的功能损伤。 5. 心肌细胞 心肌细胞用于毒理学研究的报道目前还较少。用新生 1～2 日龄大鼠心室 肌分离心肌细胞，原代培养 4 天后，将微电极(直径&0.5um)插入细胞内，研究镉对心肌的影310响。经记录、分析各心肌细胞动作电位参数，结果镉在 5～20μ mol／L 浓度下，可使心肌 细胞动作电位及最大除极速率显著降低，表明镉对心肌有直接的毒性效应。 此外，将分离的心肌细胞于培养的 24~48h 期间，利用膜片钳的连细胞电压钳法，描记 ＋ 心肌细胞上的 B 型、L 型及 T 型 3 种 Ca2 通道的单通道活动。当在培养液中加入 10μ mol／L 氯化镉之后，B 型通道开放时间缩短 1／3、关闭时间延长 45.1％、通道开放概率下降 55％， L 型通道开放时间缩短 40.7％、关闭时间延长 23.1％、通道开放概率下降 50％，而对 T 型 通道无影响。进一步证实镉对心肌有毒性效应。 (四) 细胞培养 有些脏器细胞建立了传代培养技术， 建成有稳定遗传特征的细胞株系。 有的利用细胞培 养技术建立了特殊的试验方法。 1. 肾细胞 由于肾小管，尤其是肾近曲管是肾脏重要的功能单位，目前已经建立了几 种肾近曲管细胞株系用于毒理学研究。例如 1926 年 Hull 等人选育传代培养的 LLC-PK1 细 胞是来源于 Hampshire 猪。 据报道此株系细胞的各种生物学特征已进行了相当深入的研究(包 括激素应答反应、物质转运特征、细胞的代谢功能和标志等)。此后又建立了从鼬(opossum) 获得的 OK 株系、从兔获得的 RC-SVI 株系。 近年国内利用 300 次传代培养的 LLC―PKl 细胞系对铅的肾毒进行了研究， 包括铅对细 胞的损伤、对细胞膜脂流动性的影响、对细胞膜相变温度的影响、脂质过氧化效应、胞内钙 浓度变化及形态学改变等，这对铅的肾脏毒性机理提供了依据。 2. 胚胎细胞 利用胚胎细胞体外培养，筛检和研究外源化学物的毒性效应。例如我国 用人胚肺纤维母细胞传代培养人胚肺二倍体细胞，已建立了以 2BS 为代表的株系。此株系 在用于筛检致癌物方面做了一些工作。 如人胚肺二倍体细胞在 10-7～10-8mol／L 苯并(a)芘长 达 28～38 代传代培养下， 电镜镜检发现细胞核外形不规则、 核膜深陷、 出现细桥(tiny bridge) 伴分叶核形成、核内胞浆包涵体、核仁巨大或多核等细胞癌变特征。 此外，人胚主动脉平滑肌细胞也可作为标本传代培养研究金属的毒理。 近十年来，毒理学相继引入啮齿类动物的着床前全胚胎培养技术 (pre-implantatation whole embryo culture)、着床后全胚胎培养技术(post-implantation whole embryo culture)，以及 器官培养如腭板培养、胚胎枝芽体外培养等筛检致畸化学物均取得一些成果。 (五) 组织匀浆 取脏器除血污制备组织匀浆， 是用物理学方法使细胞壁破坏， 细胞组成成分与细胞间质 混合形成混悬液。 利用匀浆为标本主要是研究外源化学物对细胞酶系统的毒理作用。 最常使 用的是脑匀浆、肝匀浆，虽然肺、肾、肠等脏器也可制备匀浆，但是因纤维结缔组织或肌细 胞不易破碎影响匀浆的质量。 文献中有机磷化合物对神经系统 Ache 抑制的强度及特征，大量工作是通过以脑匀浆为 标本，主要是以哺乳动物、啮齿类和昆虫的脑完成的。不少外源化学物的代谢和以肝脏为靶 器官的外源化学物的毒性效应特征与机理是通过肝匀浆进行的。 现虽然不少工作已为其它技 术所取代，但是应用匀浆作为过筛与初步研究还是有用的，主要因其制备方法简单、制备周 期很短，且不需复杂的设备。 (六) 亚细胞组分 将细胞中各亚细胞组分分离和纯化， 对于深入研究外源化学物的靶位点、 探讨化学物毒311性效应的机理均十分重要。它较组织匀浆优越，排除了匀浆中其它因素的影响。现代毒理学 中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。 1. 细胞膜 人与动物红细胞分离后低渗溶血，高速低温离心可制得红细胞膜 (或称血 影，ghost)。血影为常用的细胞膜标本。此外肺巨噬细胞、肺细胞、突触小体等均可制备膜 标本(先将细胞匀浆破膜，低温差速离心、梯度离心制备)。使用细胞膜可以进行很多的毒理 试验，尤其是在探讨化学物中毒机理方面。 以红细胞膜为例， 用人工细胞为标本与 0.1mmol／L 铅作用仅 5min， 红细胞膜远紫外色 谱就出现改变，表明膜蛋白的构象发生了变化。 神经末梢断裂脱落的突触体(synaptosome)具有类似完整细胞的功能， 除可利用突触体作 为标本外， 还可进一步制备突触体膜(synaptosome membrane)。 实验表明对硫磷在 5×10-9mol ／L 水平即可抑制突触体的摄钙功能，并引起突触体膜脂流动性下降。 近年来为纯化实验条件， 以利于从分子水平研究外源化学物的毒效应机理， 已将人工膜 引入毒理学研究。所谓人工膜，即是以正常细胞膜的膜脂组分，人工合成后用之在―定介质 中形成人工膜。 2. 微粒体(microsome) 尤其是肝细胞制备的微粒体常作为毒理学研究的标本，这是由 于肝脏代谢酶系主要存在于肝细胞内质网，即肝细胞的亚细胞组分分离后的微粒体中。 有报道 TNT 在无氧而加人 NADPH 环境下与微粒体温育，用 ESR 波谱仪检测出硝基阴 ￣ 离子自由基(Ar-NO2 )；而在有氧环境中能迅速与分子氧反应生成硝基化合物与超氧阴离子(O2 )。 3. 线粒体 (mitochondria) 它是细胞中进行呼吸作用的主要场所。据报道溴氰菊酯 (decamethin)在体外试验中，对线粒体呼吸功能有明显抑制作用。又据报道镉对大鼠肝细胞 线粒体 Ca2+-ATPase 有抑制作用，且使线粒体膜脂流动性下降。 (七) 酶 外源化学物对机体的毒性效应， 往往表现某种或某些酶的活性变化上， 即可以利用标志 酶活性的变化反映化学物所损伤的靶器官。 在体外毒理学中则主要是定量研究外源化学物对靶酶作用的特征、 性质和机理。 此类研 究的基础工作是纯化酶，如获得纯化酶，可在体外精确地控制各种因素，对纯化酶作用的体 征、性质和机理进行研究，如细胞色素 P-450 重组系统。由于酶的提纯技术复杂，故而在一 般毒理学研究中多用脏器匀浆和亚细胞组分作为酶源。 虽然这些酶源标本含有多酶成分， 但 是只要测定酶活性的条件适宜，完全可以得到良好的结果。 有报道金属离子 Cd2+、Hg2+、Pb2+对一些钙调素依赖酶就具有双向效应，即在低浓度时 可以激活这些酶，而高浓度时又可抑制酶的活性。 文献中早已证明有机磷化合物的主要靶酶是 AChE。经酶动力学分析，有机磷化合物与 AChE 底物 ACh 呈竞争性；即有机磷化合物对 AChE 为竞争性的不可逆性抑制物。但是不 同结构的有机磷化合物对 AChE 的亲合力可有很大差别。第二节哺乳动物细胞制备和培养一、概述 到目前为止， 分离的细胞是毒理学中使用最广泛和最深入的体外实验系统。 体外系统分312离的细胞包括悬浮液中的新鲜游离细胞、 原代培养细胞、 细胞株、 细胞系及复合培养的细胞。 在毒理学中以哺乳动物细胞作为实验动物的替代系统日渐广泛，造成这种趋势的原因有三： 一是来自公众要求减少实验中使用动物数量的压力； 二是非整体动物实验可显著地减少常规 整体动物实验所需的高额费用； 三是人们越来越不满意实验动物与人体结果之间相关性的缺 乏。利用细胞，可更严格控制实验条件，有效地研究毒性作用的生化机理。表 12-2 详细列 出细胞在毒理学中应用的优缺点。 表 12-2优点体外系统――细胞在毒理学中应用的优、缺点缺点改善效率，减少费用 使用实验动物较少 仅需少量的受试物 较大程度控制细胞族的性状 直接控制胞外基质、化学物浓度及接触时间 排除可能的混淆因素如激素；神经系统或免疫系统的影响 可从同一实验体系重复取样 缺少整个器官的形态学观察 选择性丧失整体器官特异性功能，如毒性代谢酶的丧失 缺乏可能的调节影响因素如激素，神经系统或免疫系统， 一般为静态系统，将导致营养物质的逐渐减少和代谢终产物的逐渐累积。 多为短期试验，对亚慢性或慢性毒性的评估价值不大表 12-3毒理学研究中常用细胞各种物种的成纤维细胞 淋巴母细胞 腹水瘤细胞 淋巴细胞 角质细胞 肝 细 胞 肝癌细胞 肾脏髓质和皮质细胞 肺的各种类型细胞 培养的背根胶质细胞 培养的睾丸细胞 膀胱细胞 心脏细胞 脊髓微血管细胞 脂肪细胞由于哺乳细胞作为体外实验系统的优越性， 在毒理学中， 已有许多不同类型细胞应用于 毒理学实验。表 12-3 为毒理学实验中常用的细胞类型，其中有些细胞可来源于人体组织。 利用哺乳动物细胞进行毒理学体外实验有两种方法：一是建立正在迅速生长的细胞株， 用以观察受试物对整体细胞的一般毒作用和正在分裂组织的毒作用； 二是利用已高度分化的 细胞， 无论是原代培养或是特定的细胞株， 研究受试物对已分化成熟的细胞或其功能的特殊313毒作用； 二、基本技术 （一） 仪器与设备 1. 培养箱 一般来说，在 5％CO2，95％空气和 99％的相对湿度的条件下，许多细胞可 存活。故细胞培养的关键设备是 CO2 培养箱。其基本要求：①精确地温度控制调节，一般 在土 0.5℃，箱内温度的均衡可依赖风扇；②CO2 浓度调节，利用 CO2 传感器监测箱内 CO2 浓度；使箱内大气为 5％CO2，95％空气；③箱内湿度，可用水盘来维持。有的细胞培养可 以不控制 CO2 分压。例如，原代肝细胞培养，可用 LeibovitzL-5 介质，不需 CO2，而要求敞 开培养瓶，以供给较高的 O2 分压。 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4℃)用于存放培养介质，冷柜 (―20℃)则存放酶， (如胰蛋白酶) 和某些培养介质如谷氨酸和血清。 3. 显微镜 最基本的配置是一台简单的倒置显微镜，用作日常观察培养中的细胞，以 便依据细胞生长状况，进行调整或对污染进行补救或处理。进行进一步的研究，则需要更高 级的显微镜，例如，相差显微镜或荧光显微镜，并附有照相装置或摄影装置。 4. 超净工作台 在没有无菌操作室的条件下；可用超净工作台。它是一无菌操作装置， 主要是利用鼓风机，驱动空气通过高效滤膜净化后，缓缓通过工作台面，使工作部位构成无 菌环境。它具有占地面积小，操作方便等优点，但它尚难绝对除去病毒类微生物，而且灰尘 过多对净化作用不利，故超净工作台最好安置在清洁无尘的房间。 5. 清洗和消毒设置：培养中所用玻璃器皿可用电热干燥箱消毒，要求温度 160℃以上， 最好使用较大规格的干燥箱，如 650×500×500mm。 器皿的清洗可用超声波洗涤器。 吸管的清洗采用虹吸原理制成的冲洗装置。 金属器械如 解剖刀、虹膜剪、镊子、尖镊、止血钳等可用高压蒸汽消毒。 6. 培养器皿 为了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。特制的塑料瓶皿具有 透明、平滑、无毒性、有利于细胞生长的优点。主要的塑料瓶皿有；①多孔培养板，其规格 有 4 孔、6 孔、24 孔及 96 孔，它体积小，适于少量细胞或单个细胞克隆的生长；②培养皿， 规格有直径 30mm、60mm 及 l00mm，与玻璃培养皿相同，尤其有利于集落形成和细胞转化 等试验；③培养瓶，带有螺旋盖塞，规格有 30ml、50ml、l00ml 及 500ml，适于在 CO2 培养 箱中使用；④其它：冻存细胞的塑料安瓿及微量加样器头，后者的规格有 200~1000μ 1 和 1 μ l~100μ l 二种。 玻璃器皿在实验室仍不能完全被塑料制品取代，除培养皿和培养瓶外，主要还有：①吸 管，它包括刻度吸管和移液管，常用规格有 l0ml，5ml 和 lml；②玻璃瓶，用于配制各种培 养液的储贮存液和血清等，可用生理盐水瓶或血浆瓶代替，规格有 500ml、250ml 和 l00ml； ③离心管，规格有 50ml、l0ml 和 5ml，用于细胞洗涤。 7. 液氮贮存器 贮存细胞多用液氮，液氮温度在-196℃，具有经济、省力和能较好保 持细胞生物学特性的优点。液氮贮存器有 25L 和 50L 两种规格，它与液氮运输瓶，或称杜 瓦瓶不同，因液氮贮存器一般每两周需补充一次液氮。如有需要可配置贮存器和运输瓶。 8. 水纯化装置 细胞培养对水的要求较高，通常要求使用三次蒸馏水配制各种培养液。 对玻璃器皿也应用纯水清洗。但是，在细胞培养中，不宜使用去离子纯水，因其不能有效地 去除有机物。314实验室应配备自动加水石英玻璃管加热的蒸馏器，具有蒸馏速度快，使用安全等优点。 外购蒸馏水或去离子， 应在本实验室重蒸后使用。 对水质量应经常检测， 如 pH 和电导系数。 同一实验尽量使用同一水源，避免水质量造成结果的差异。 9. 滤过消毒装置 培养介质不能经高压蒸汽消毒， 而需通过孔径为 0.22μ l 的滤膜过滤 消毒。滤过消毒装置由抽气泵(水流玻璃抽气泵或真空泵)、安全瓶、抽滤瓶和滤器组成。 10. 一般设备 离心机，用于对细胞悬液离心处理，以达到细胞洗涤、调节细胞浓度等。 天平，包括普通台秤、扭力天平和分析天平，用于配制各种培养液、酶消化液及生理盐 水等。 酸度计，用于准确调整各种介质及生理盐水的 pH。 电磁搅拌器，微量加样器等。 (二) 培养用液 指细胞培养中所使用的溶液，如培养液、消化液、pH 调整液、染液及细胞洗涤液等。 培养液的选择取决于细胞生长的要求， 故它是维持细胞生存和生长所需的基本溶液， 它的主 要成分为平衡盐溶液和适应细胞体外培养的各种溶液。 培养液在制备过程中应严格操作，避免混入杂质。应特别注意下列问题：①容器，应仔 细认真清洗，必要时须消毒；②水，三次重蒸蒸馏水；③严格选择品质优良的药品；④制备 好的培养介质要标明名称、配制日期及配制者；⑤贮存与消毒。 1. 平衡盐溶液 常用的有 Hanks 液、Eagle 液及磷酸盐缓冲液 (PBS)等。它具有维持渗 透压、 控制酸碱度平衡的作用及供给细胞生存所需的能量和无机盐的成分。 它是配制各种培 养介质的基础溶液，也是洗涤细胞的溶液。 2. 小牛血清 是细胞培养中最常见的天然培养基，它具有丰富的营养物质，对细胞附 着和保护也有明显的作用。但它有成分较为复杂、个体差异较大、来源也有一定的限制等不 足。弥补个体差异的办法是对血清进行无菌检测和支持生长能力测定后，混合使用。天然培 养基除小牛血清外，还有鸡血浆、鸡胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾胶原等。 3. 合成培养基 系依据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的。如最简单的 MEM Eagle 培养液，包括 12 种必需氨基酸、谷氨酸胺和 8 种维生素。根据需要可添加某些成分， 如碳水化合物(葡萄糖、 核糖、 脱氧核糖及丙酮酸钠等)、 核酸的前体物(嘌呤和嘧啶类化合物) 及氧化还原剂，抗坏血酸、谷胱甘肽等。 如进行无血清培养，除上述营养成分外，还应加入纤维连结素、多聚赖氨酸和胶原等成 分以促进细胞贴壁。有时，还需要加入酶的抑制剂，如大豆胰酶抑制剂。 为了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉素、链霉素及庆 大霉素等。 4. 消化液 进行传代细胞培养时，为了使细胞脱离生长表面和细胞离散成单个细胞， 通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液 (0.25 ％或 0.125 ％ ) 和乙二胺四乙酸二钠 (Na2-EDTA)溶液(0.02％)。 5. 其它 pH 调整液，为了营养成分稳定和延长贮存时间，配制生理盐溶液，和培养液 时，均在临用前加入 NaHCO3 溶液。常用浓度有 3.7％、5.6％和 7.4%。此外，还有 HEPES 溶液， 是一种氢离子缓冲剂， 能较长时间保持恒定的 pH 值范围。 使用终浓度为 10～15mmol315／L。 染色液：常用的有①苏木精-伊红染色液或称 H.E 染色；②Giemsa 染色液。 固定液：常用的有①中性缓冲福尔马林，相当于 10％的福尔马林；②Bouin 氏固定液； ③醋酸甲醇，临用前配制，结合 Giemsa 染色效果较好；④FAA 固定液，由福尔马林、冰醋 酸及 80％酒精组成，用于盖片单层培养的固定。 (三) 消毒技术 在细胞培养中，消毒是最基本的一项工作，它直接影响实验的结果。消毒措施应在细胞 培养的每个环节严格执行。细胞培养的微生物污染，包括细菌、真菌及病毒，它们主要来源 于：操作者的粗心；操作表面或周围的环境；培养液及培养器皿的灭菌不彻底或存放时间过 久等。 对不同的细胞培养所用物品，可采用不同的消毒灭菌的方法。一般有两类：一是物理灭 菌法，即利用紫外线、干热及微孔过滤等；二是化学灭菌法，即利用化学消毒剂。主要消毒 方面法介绍如下： 1. 紫外线 适于消毒空气、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培养板等， 使用方便，效果较好。应注意其可产生臭氧，影响健康。 2. 高压蒸气消毒 它适于金属器械、胶塞、布类及某些培养液。一般要求 15 磅压力下 20min。或者更简单的，煮沸消毒，其不足是湿度大，不易久存。 3. 干热消毒 适于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用贮存。加温应到 160℃， 保持 90-120min。 4. 滤过消毒 适于大多数培养用液。选择孔径为 0.22μ m 的微孔滤膜，过滤除菌效果 较佳。 5. 消毒剂 适于操作者的皮肤、操作表面和台面、桌椅及墙壁等，常用的消毒剂有来 苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸及 70％酒精。 三、培养细胞的鉴定 对培养细胞的鉴定有两个目的：一是观察培养有无变化，以决定是否终止培养，并从冷 冻贮存的样品重新建立新的培养细胞；二是培养条件(如培养液)变化，对培养细胞的影响。 因为培养条件的一致性， 对于实验结果的可信性有极为重要的影响。 对于培养细胞的鉴定包 括污染鉴定、生存指标及细胞性质(如细胞形态、生长特性、染色体数目及结构等)。 (一) 污染鉴定 细胞培养中常见的污染有真菌、 细菌和支原体等， 此外有化学物和非同一种细胞的污染。 受到污染的细胞培养可明显地改变生长特性， 引起 pH 变化和生长迟缓。 污染常常表现为 pH 变化，培养液表面起泡或起膜，培养液中的絮状物及细胞生长表面的斑点，摇动培养器皿可 消失。肉眼见不到的污染可影响细胞的代谢。 1. 鉴定方法 真菌或细菌的污染可用肉眼或低倍光学显微镜观察，支原体仅能用特别 的荧光染料如 Hoechst 33258 染色后在光学显微镜下，或用扫描电子显微镜观察。由于用肉 眼无法发现支原体的污染，在细胞培养过程中应经常定期检查，例如每三个月。最简便和最 可靠的检测支原体的方法是用荧光染料染色在显微镜下观察。 2. 处理 基本的良好消毒技术并不一定能防止污染，还应注意下列方面：消毒步骤(如 高压锅和干热消毒柜)的效果；多层流防护罩的消毒效果；经常检查培养器皿；每个工作者316有自己配制的培养用液， 处理受污染的培养用具和环境。 对于已污染或怀疑污染的培养用具 均可用 2.5％高氯酸处理。用抗生素对预防或去除细菌污染较为有效。对支原体污染，消除 方法较多，如抗生素、加温及动物体内接种等，但都较为繁琐，且效果不甚满意，最好的办 法是弃去，再重新培养。 (二) 生存指标 1. 台盼蓝排斥试验 是判定细胞损伤的快速试验，它还可很方便进行细胞计数。具体 方法如下： ①取少量细胞混悬液，加人等量的 0.5％台盼蓝溶液。 ②放置 1-5min 后，将混合液滴入血细胞计数池内。 ③显微镜下，细胞显蓝色的为死亡细胞，尤其是核深染，而未染的细胞为存活细胞。统 计出细胞总数后，可计算出细胞存活率。 2. 酶漏出的检测 胞浆酶如乳酸脱氢酶(LDH)的漏出检测也与染料排斥试验有同样的 灵敏度，同时，可更精确地进行定量，但操作时间较长。 (1) 仪器：分光光度计，最好配有温育(37℃)的装置。 (2) 试剂： 溶液 0.9％NaCl，0.1％TritorX-100 和 0.1％牛血清白蛋白。 底物 3.5g K2HPO4，0.45gkH2PO4 和 31.0mg 丙酮酸钠溶于 450ml 的蒸馏水。配好后， 可贮存于-20℃的冰箱内。 NADH，称 42mg，溶于 4.5ml 的 1％NaHCO3，临用前配制。 (3) 操作步骤： 离心， 以适当速度使所有细胞沉淀而不引起细胞损伤。 例如肝细胞用 50g ×2min。取出上清，放人干净试管，并保持 0℃以下备用，加入等量的溶液至细胞沉淀，用 漩涡混合器混合。保持在 0℃以下，备用。 取一比色杯，加 3ml 底物，50μ l 的 NADH 和 25~200μ l 的样品(取决于培养细胞的种 类)，迅速混合后，在 340nm 处进行比色。整个过程应在 37℃条件下完成。计算上清或沉淀 (即溶液中细胞)的 LDH 活性，漏出率表示方法为培养液中 LDH 活性占总的 LDH 活性的百 分率。 3. 其它方法 铬的释放，利用 51Cr3+可被活细胞吸收，并还原成 51Cr3+，留在胞内，而 死亡细胞则释放 51Cr3+。用 r-计数器检测无细胞上清液中 51Cr3+的量，即可判断培养细胞的 存活情况。还有贴壁效率和 ATP 含量等指标可鉴定培养细胞的存活情况。 (三) 细胞特性鉴定 在连续培养期间，细胞可能发生某些变化，如细胞与原始细胞的差异逐渐加大。但每一 细胞株具有一系列细胞特性“正常”的参数，可供鉴定评价。例如，形态学参数、生长特性 及染色体分析等皆为细胞特性鉴定的指标，其中形态学与生长特性的测定相对容易进行。 1. 形态学检查 评价细胞正常与否的最简单方法是形态学检查；应在每次传代时用倒 置显微镜进行观察，最好拍照记录细胞的形态。要详细地描述每一细胞系的形态。若因限于 篇幅，不能详述，可掌握两个述语，即“成纤维样”和“上皮样”细胞，即可描述所观察的 细胞。成纤维样细胞系指在单层细胞培养时，细胞的长度要大于其宽度的两倍的细胞，而上 皮样细胞系指呈多角形的细胞。 2. 生长特性的检查 在培养细胞时，其生长特性的检查较易进行，主要通过测定更换317培养液的时间和传代的时间来完成。虽然不同的细胞其传代时间和更换培养液的时间不同， 但对于每一细胞系应该较为固定，因为主要取决于细胞生长速率。 每个细胞系均有其自己的生长循环周期， 这取决于接种进行培养的细胞数目。 一般认为， 在培养中的细胞，是处于不同的生长阶段。进行生长分析，应观察单个细胞的生长速率。在 实际工作中，是测定克隆效率或者接种效率。克隆效率是测定由单个细胞生长的克隆。接种 效率是测定植入小量细胞(2~50 个／cm2)后，等生长至可分辨的小克隆时，经用生理盐水洗 涤，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2)和清水冲洗后，计算克隆数。 接种效率=克隆数目 ? 100% 植入细胞数目一般认为，传代效率小于 30 表示生长不正常。此项指标可用于正常细胞生长的监测， 贮存细胞的复苏及鉴定每一批血清等。 在细胞培养试验中，一般监测指标可采用形态学、生长模式及接种效率即可。 3. 其它检查 除上述指标外，在细胞培养时，可进行染色体分析，包括染色体的数目 和结构以及 DNA、RNA 和蛋白质的含量测定，来判断培养细胞的特性。 七、细胞培养在食品毒理学中应用 利用培养的细胞，可进行多方面的毒理学研究，如表 12-4 中所列。 表 12-4 培养细胞用于毒理学体外实验的实例一般毒性：主要为急性细胞毒性 器官特异性毒性：利用有代表性细胞类型如肝细胞、肾近曲小管细胞、神经细胞及心肌细胞等： 毒作用机理 生物转化、毒性代谢产物的形成 遗传毒性，如程序外 DNA 合成测定 繁殖毒性 联合毒性 不同物种间的比较毒性 光敏毒性以下重点讨论毒理学中应用细胞培养技术时应注意的几个问题。 1. 细胞类型的选择 细胞类型的选择取决于实验的目的。一般性筛选系列化合物的一 般毒性时，应选择生长迅速且易于处理的细胞系。机理研究多不用细胞系，因为培养的细胞 会逐渐丧失许多功能，如细胞色素 P-450 的活性。 细胞培养的优点之一是可选择来源于人体的组织细胞， 可减少试验结果的物种差异。 成 纤维样细胞和上皮样细胞均可选用。常用的细胞系有 CHO、V79、Hela、BHR 及 L929 等。 2. 代谢活化 细胞经 8-24h 培养后，细胞色素 P-450 活性将迅速下降。而在 CHO 细胞 系中，涉及代谢活化的酶活性下降。所以，培养细胞对需代谢活化的化学物不能够敏感。 解决这个问题有两个方法，一是加 S9，二是与原代肝细胞复合培养。S9 需要 NADPH 才具有代谢活化作用，故在培养液中应加有 NADPH 生成系统(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄 糖-6-磷酸和 NADP)。与原代肝细胞进行复合培养时也可采用其它不同的细胞系，如 V79、 中国地鼠肺成纤维细胞和人成纤维细胞。3183. 受试物的给予许多 受试物由于水溶性较低，在加入培养液前，常需溶于有机溶剂 有机溶剂对细胞有损害作用，故应限制有机溶剂浓度在 1％以下。在试验中可设立适当的有 机溶剂对照和培养液对照。例如，需用 S9 混合液；有机溶剂的浓度应限制在 0.1％，因为许 多有机溶剂可抑制酶的活性。不溶性的受试物如，颗粒和油剂在给予培养液时仍存在问题。 一般是混悬于培养液或者先溶于溶剂， 再加人培养液， 但有时会产生不同的毒性结果。 例如， 黄樟醚和降脂乙醚等油性受试物， 假如使用高剂量时将有某些塑料培养皿成分的溶出， 则所 观察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。 4. 设立阳性对照组 实验系统的重现性应该用阳性对照物来检查。阳性对照物指采用 经过研究或公认有特定作用的化学物。例如在代谢活化研究中常选择环磷酰胺为阳性对照 物，在细胞毒性筛检时可选二甲基环己基烃乙基戊二酰亚胺和二硝基苯酚为阳性对照物。 5. 毒性指标的选择 依据不同的试验目的和试验条件，可选择不同的观察指标。下列 指标在毒理学中经常采用： (1) IC50：即经 3 天培养后，引起生长速率减至对照组一半时所需受试物的浓度生长速 率可用蛋白总浓度来表示，可用于细胞毒性的常规筛检。此外，前述评价细胞特性的指标， 如形态学和接种效率等，均可采用。 (2) 细胞膜损伤：可选择台盼蓝摄取、胞浆酶漏出、Ca2+的释放以及钙泵的变化等指标 来评价细胞膜的损伤。 (3) 大分子物质合成与降解的改变：可选用[14C]亮氨酸蛋白试验和[3H]尿嘧啶参入 RNA 试验等指标，以判断受试物对培养细胞的大分子合成与降解的有无作用。 (4) 代谢能力：除可选择 ATP 浓度、NADP／NADPH 比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等 指标外，还有毒物代谢酶的活性、细胞膜脂质过氧化作用及[14C]-葡萄糖氧化代谢成 14CO2 的速率，均可反映出细胞的代谢能力。 (5) 形态学观察：通过光学显微镜和电子显微镜观察，可了解受试物对培养细胞的形态 改变情况。第三节亚细胞组分制备及其检测方法细胞由许多亚细胞组分组成，如核、线粒体、内质网膜、溶酶体及高尔基氏体等，它们 在维持细胞正常生理功能方面起着重要的作用。 故许多外源化学物引起机体的损害作用， 有 可能与亚细胞组分的结构与功能损伤有关。 在毒理学中， 亚细胞组分作为遗传毒性测定中的 代谢活化系统，如 S9 已普遍运用。此外，亚细胞组分主要用于中毒机理的分子水平研究， 因它们是从整体细胞上在自然环境下分离出来的， 使毒理学家在体外条件下， 有可能更深入 了解外源化学物在毒作用部位的作用机理。但它离开子整体细胞，也有其局限性；即它仅提 供有关一些特殊作用能力的特定信息。 对外源化学物毒作用机理研究， 还应结合其它研究如 整体试验、 细胞试验等， 综合作出评价。 现就微粒体和线粒体的制备及其检测方法加以介绍。 一、基本技术 (一) 设备 1. 匀浆器(homogenizer) 常用匀浆器为 Potter 型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管组成。 它是利用两者的间隙将细胞破碎，其间隙一般在 0.15~0.25nm。杵是由马达传动，其速度在3192000rpm 以内，且可调节。它较适合肝细胞、肾细胞及脑细胞的破碎，而对肺、甲状腺等结 缔组织较多的组织效果不佳。匀浆器可从 5ml 至 50ml 大小不等，依实验需要加以选择。使 用本法破碎细胞应注意： ①在低温下操作避免匀浆磨擦生热和室温影响实验结果； ②马达速 度不宜过快，慢速可获更大的扭力矩；③匀浆上下次数，即杵由玻璃套管上部下到底部，再 回到上部，一般肝细胞匀浆上下 8~10 次即可达到破碎目的。 2. 离心机 是亚细胞组分制备的关键设备，一般需要低温高速离心机，最大转速为 18 000～24000rpm，和超速离心机，最大转速为 5rpm。离心机应配备各种类型的 转头，以供亚细胞组分制备时差速离心选用。离心管最好为聚丙烯的，因其透明性较好。 (二) 匀浆介质和缓冲液 最常用的匀浆介质为等渗的蔗糖(0.25mol／L)和氯化钾(0.154mol／L)。蔗糖为经典亚细 胞组分分离研究所选用， 而氯化钾更适合外源化学物代谢酶的研究， 如它可更有效除去微粒 体制备物中的血红蛋白，减少光谱测定的干扰。匀浆介质在使用前应将 pH 调至 7.4 左右。 匀浆缓冲液可含有 5~50mmol／L 的 Tris 或 Hepes。 大多数研究中常用的匀浆缓冲液为含 0.154mol／L KCl 的 50mmol／L Tris?HCI 缓冲 液，pH7.4。此缓冲液在 4℃条件下，至少贮存 12 周不变质。 (三) 生物样品 实验动物如大鼠、小鼠、金黄地鼠应迅速处死，常用的方法是断头处死。应避免使用麻 醉剂，如乙醚、巴比妥类药物，它们将影响毒物代谢酶的活力。对于大实验动物，如狗等， 应在适当的麻醉条件下，放血处死。尽快取出所需脏器，如肝、肾、肺及脑等，置人冰的匀 浆介质中。为了减少实验误差，应参考动物的年龄、性别、品系、健康状况、饮食类型和饲 养环境等因素。此外，为避免昼夜节律影响，每次实验应在相同时间处死动物。为避免肝糖 原影响，大鼠应禁食过夜。 (四) 微粒体酶的诱导方法 1. 苯巴比妥钠 它是常用的诱导剂之一。其方法是以小鼠 80mg／(kg?d)，大鼠 100mg ／(kg?d)，经腹腔注射或与生理盐水混合灌胃，连续 3~5 天即可诱导细胞色素 P-450 的活 力。 还可以将药溶于饮水， 1ng／ml， 大约 7 天后， 可达到诱导效果。 主要诱导细胞色素 P-450。 2. p-萘黄酮(β -naphthoflavone) 它是多环芳烃类的诱导物，可诱导细胞色素 P448，同 类诱导物还有 3- 甲基胆葸 (3-methylcholanthrene) 。 β - 萘黄酮的使用方法是小鼠 40mg ／ (kg?d)，大鼠 80mg／(kg?d)，经腹腔注射，连续 3～4 天，即可达到诱导作用。主要诱导 细胞色素 P448。 3. 多氯联苯 常用多氯联苯诱导物是 Arochlorl254，它是混合型的诱导物，即同时诱导 细胞色素 P-450 和细胞色素 P-448，剂量依多氯联苯种类不同而异，需做预试验来确定。 二、微粒体的制备 微粒体(microsome)是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。由于 微粒体含有混合功能氧化酶， 其在毒理学研究中有着重要地位， 故微粒体是毒理学中较常用 的体外系统。 (一) 肝微粒体制备 1. 以断头方法处死动物，迅速取出肝脏，用预冷生理盐水或匀浆介质洗净血污，剪去 粘连的组织，用滤纸轻轻吸干表面水分，称重。3202. 将肝转入小烧杯，用剪刀剪碎肝脏，加入适当匀浆介质，一般为 3ml／g 肝脏。放人 Potter 匀浆器中，上、下 8 次，制成肝匀浆。 3. 按示意图操作离心。肝匀桨 离心，10000g 20 min上清液 离心，10500g 1h沉淀沉淀 （微粒体）上清液弃去在第一次离心去除线粒体、 核等物质时， 离心管上层漂浮有脂质层， 应用吸管将其除去， 再收集上清液。在第二次超速离心后，如为了减少血红蛋白的影响，可加匀浆介质将沉淀重 新悬浮，将所制备的微粒体再洗涤一次。沉淀即微粒体，悬浮于 10mmol／L Hepes?HCl 缓 冲液，pH7.6，内含 0.154mol／L KCl，l mmol／LEDTA 和 20％甘油，贮存于-20～70℃或是 液氮中。应强调的是贮存方式和时间对微粒体酶的活性或特征会有不同程度的影响。 4. 其它方法 除超速离心法制备微粒体外，还有凝胶过滤、钙沉淀法和等电点沉淀法 也可以制得微粒体。 凝胶过滤法不适于做多个样品。 钙沉淀法适于没有超速离心机的实验室 使用。其方法是在去线粒体的上清液中加入钙离子，使其终浓度为 8mmol／L CaCl2，此时， 内质网部分产生钙依赖性聚集，在较低的离心条件，g，20min 即可将其沉淀。 不足之处是钙离子可影响某些酶的活性以及造成核糖体的丢失。等电点沉淀法是利用 pH 改 变，使微粒体沉淀出来，弃去线粒体的上清液用醋酸缓冲液把 pH 调至 5.5 时，在较低离心 条件下，10000g l0min，即可制得微粒体。其优点也是不需超速离心机，不足之处是酸性 条件下，可使某些酶和 CytP-450 失活。 (二) 肝外组织微粒体的制备 肝微粒体制备过程中的一般性规则对于肝外组织同样适用。对于较软的脏器，如肾脏、睾丸 和脑与肝微粒体制备的操作变动不大。 对于结缔组织较多的肺、 皮肤等脏器和对于小肠微粒体的 制备较为麻烦。因为，小肠仅上皮细胞含有外源化学物的代谢酶，在小肠的不同区域其酶活性也 不一样，以及肠内的蛋白酶可迅速降解代谢酶。其解决的办法有：①小肠上皮细胞可由打开的小 肠内面刮取或用机械振荡来与小肠结缔组织分离； ②加入胰蛋白酶的抑制剂使蛋白酶活性降低或 加入甘油或二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)保护酶活性；③加肝素防止凝集和蛋白聚集。 肝外组织的细胞色素 P-450 的含量和有关酶活性远较肝组织低。应注意所有操作应在 0~4℃下进行，对于组织应尽量除去血红蛋白，较好的方法是脏器的原位灌流。 三、混合功能氧化酶系的测定方法 MFO 催化的反应类型繁多，且底物特异性不强，故有多种方法用于 MFO 测定，可分 为直接法和代谢法。直接法是直接测定 MFO 的各组成成分，如细胞色素 P-450 含量等。代 谢法是通过测定 MFO 催化反应中的底物消耗量或产物生成量，间接了解 MFO 活力。由于321MFO 作用的复杂性以及成分的多样性，通常认为使用单一方法进行 MFO 的评价不够全面 和可靠，因此，在毒理学中是采用多种检测分析方法，从不同角度进行 MFO 作用的评定。 (一) 直接法 1. 细胞色素 P-450 含量测定 细胞色素 P-450 是 MFO 的主要成分，起到终末氧化酶的 作用。其最大特点是还原型 CytP-450 与一氧化碳结合后，在 450nm 处有最大吸收光谱，因 此被称为 CytP-450。利用其在 450nm 的最大吸收光谱，可测得样品中 CytP-450 的含量。 (1) 仪器：双光束可记录的分光光度计。因为微粒体样品是浊状样品，需双光束分光光 度计，在 450nm 和 490nm 处进行差示光谱分析。 (2) 试剂：0.2mol／L 磷酸缓冲液 pH7.4；一氧化碳(气体)；连二亚硫酸钠 (3) 步骤： ①将微粒体制备物用 0.2mol／L 磷酸缓冲液 pH7.4 适当稀释； ②加小量固体的连二亚硫酸钠，(sodium dithionite，Na2S2O4)迅速混匀； ③分装人两个比色杯中，用一氧化碳气体向比色杯轻轻吹泡 l min，开始在 450nm 和 490nm 波长处测定其光密度值。 (4) 计算： CytP-450 含量(nmol／mgPr)=? A(450 ? 490)nm 1000 ? ? 稀释倍数 C? r 91式中：Δ A 为 450nm 处光密度值与 490nm 光密应值之差 91 为 CytP450 的消光系数，单位：cm2／mmol r 为比色杯光径长度，单位：cm C 为微粒体制备物的蛋白浓度，单位：mg／ml (5) 注意事项： 一氧化碳吹泡保持气泡单个放出为宜， 太快会将样品吹走。 此法可快速测定 样品的总细胞色素 P450 含量，即各种细胞色素 P450 同工酶(或称亚型)的总和。本法对肝微粒 体制备物较为适合， 而对肝外组织， 因影响因素如血红蛋白及本身含量不高， 不宜用本法测定。 2. NADHP-细胞色素 P-450 还原酶测定 NADHP-细胞色素 P-450 还原酶在 MFO 作用中 起提供电子的作用。在实验工作中，它的活力较难测定，且需要特殊仪器。因此，通用细胞 色素 C 作为人工电子受体，来测定这种微粒体黄素蛋白酶。其原理是氧化型细胞色素 C 被 转变成还原型细胞色素 C 时，在 550nm 处有典型的最大吸收峰。 如上所述，直接法可判断外源化学物对 MFO 催化是否具有诱导作用或抑制作用。它能 评定 CytP-450 总含量，但不能确定某一 CytP-450 亚型的改变，也就是说不能测定 MFO 催 化某一特定反应活动的影响。 (二) 代谢法 代谢法可分为 NADPH 消耗量测定、氧耗测定和 MFO 催化代谢产物生成量测定。 1. NADPH 消耗量测定 NADPH 参与 MFO 的催化作用过程， 故通过测定 NADPH 的氧 化，即 NADPH 消耗量，可间接了解 MFO 活力。本法是利用双光束分光光度计测定 340nm 处光密度的变化量。其反应体系多为 0.05mol／L Tris?HCI 缓冲液，其中含 0.15mol／L KCl 和 10mmol／L MgCl2，pH 为 7.4；微粒体蛋白含量为 0.2~0.5mg / NADPH 含量为 0.12～ 0.16mmol／L。本法是测定反应体系中 NADPH 总消耗量，但在微粒体制备物中，不仅 MFO 催化反应需要消耗 NADPH; 而且它不可能区分细胞色素 P-450 各种同工酶的作用，所以用322该法来评价 MFO 活力，在准确性和专一性等方面均有不足。但在重组酶系中，即由各种纯 化的 MFO 组分在体外条件下组成的反应体系，例如，由细胞色素 P450 的某亚型、NADPH ―细胞色素 P-450 还原酶和磷脂组成的细胞色素 P-450 重组系统， 可避免准确性和专一性不 足的缺点。本法测定简便易行，不失为 MFO 重组体系中较好的测定方法。 2. 氧耗测定法 采用氧电极法测定反应体系中的氧耗量，通过化学计量法间接了解 MFO 活力的反应体系中，NADPH 需要保持恒定的水平，故常用 NADPH 生成系统，如葡萄 糖-6-磷酸／葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或异柠檬酸／异柠檬酸脱氢酶等来满足需要。本法也有与 NADPH 消耗量测定类似的缺点，即微粒体制备物中有较多的酶系在催化过程中均有氧的消 耗。例如，在微粒体制备过程中，难免有触酶(catalase)的污染，触酶催化过氧化氢产生水和 氧。此外，也可能有脂质过氧化作用发生，所以，氧耗测定法对评价微粒体制备物 MFO 活 力的应用受到一定的限制。 3. MFO 催化代谢产物的测定 通过直接测定特定底物的消耗进行 MFO 活力评定存在 一定的困难，因为其大多数底物的米氏常数(km)为 0.5～5.0mmol／L，而 MFO 的比活性仅 为 1.0~15.0nmol 产物生成量 min-1?mg-1 蛋白。可见两者差异较大，即其底物转变量小于 1％， 与测量方法本身的误差相近，难于进行统计学分析。故评定 MFO 活力时，多改用其代谢产 物生成量的测定。由于其底物特异性不强，催化反应类型较多，目前已建立多种产物的检测 方法。依据测定技术，代谢产物测定方法又可分为可见紫外分光光度法、荧光分光光度法、 氚标记放射测定和色谱分析等。 (1) 可见紫外分光光度法：利用分光光度法评定 MFO 活力，应用最广泛的方法之一是 甲醛生成量的测定，原理是依据 MFO 所催化的 N-和 O-脱烷基反应，许多底物如苄甲苯丙 胺与氨基比林(N-脱甲基)和可待因(N-脱甲基和 O-脱甲基)等经过脱甲基作用后，皆有甲醛生 成。故可用甲醛的生成量表示 MFO 活力。甲醛的测定是利用 Hantzsch 反应，用乙酰丙酮和 铵离子捕捉甲醛，形成有色的衍生物。本法简便，易于掌握，是测定 MFO 的 N-和 O-脱烷 基作用常用的方法之一，广泛用于肝脏微粒体制备物 MFO 的活力评定。对于肝外组织，因 甲醛生成速率为 2~3nmol?min-l?m1-1，即肝外组织 MFO 活力较低，其灵敏度有限。但可 加入氨基脲(1 mmol／L)，增加对甲醛的捕捉能力，以提高其灵敏度，扩大本法的应用范围。 此外，放射测定法可使甲醛测定的灵敏度提高，但需要 N-甲基-14C 标记的底物。由于 14 C 标记底物不易取得，且 14C 废弃的处理较为复杂和需特殊的设备及技术人员，故本法在 一般实验室不易开展。 利用可见紫外光光度法，还可测定 MFO 催化代谢的其他反应。例如，通过苯胺和环己 巴比妥测定羟化作用；偶氮化合物和硝基化合物测定还原作用；对硝基茴香醚测定 O-脱烷 化作用等。这些方法简便易行，适合大多数实验室，但灵敏度不高，对于 MFO 活力较低的 肝外组织不宜采用。 (2) 荧光分光光度法：原理是利用 MFO 催化反应产物的荧光强度，测定 MFO 的活力。 本法比较灵敏，一般高于可见紫外分光光度法 2～3 个数量级，可测出 1～30pmol 产物生成 量／(min?mg 蛋白)，适用于肝外组织和培养细胞的 MFO 活力的评定。 直接荧光法常用的底物有 7 ―二氧基香豆素 (7-ethoxycoumarin) 和 7- 二氧基试卤灵 (7-ethoxyresomfin)。经过 O―脱烷基作用，生成具有高强度荧光的酚类产物 7-羟基香豆素和 7-羟基试卤灵。测定随时间增强的荧光，可反映 MFO 的活力。测定 7-二氧基香豆素的激发323(excitation)和发射(emission)波长分别为 380nm 和 452nm， 而 7-二氧基试卤灵的分别为 525nm 和 582nm。由于本法灵敏度较高，将出现较高的对照值，即本底较高。解决方法是加抽提步 骤，即有 0.5m1 4mol／L HCl 终止反应后，用 6ml 氯仿抽提，测定 4ml 氯仿与 4ml 甘氨酸氢氧化钠缓冲液中的 7-羟基香豆素。 芳烃羧化酶活力测定也是用荧光法，其原理是以苯并 (a)芘为底物，与待测微粒体温育 一定的时间。反应结束后，用己烷抽提荧光产物 3.9―羟基苯并(a)芘和剩余底物，然后将氢 氧化钠加入抽提液中， 使荧光产物形成水溶性中的酚盐， 易与底物分离， 可测定产物的荧光强度。 (3) 氚标记放射性测定：利用氚标记的有机化合物在 MFO 催化的羟化过程中，由碳-氢 键上脱落的质子(proton)来评定 MFO 活力。本法常用于甾体和芳香族化合物羟化反应的测 定。本法灵敏度较高，但由于需要高比活的氚标记底物、昂贵的液体闪烁计数仪和受过训练 的专业人员等，限制了推广使用。 (4) 色谱分析法：利用层析技术分离 MFO 催化反应中的各种产物，然后进行定性或定 量测定。纸层析、薄层层析、气相色谱及高效液相色谱等层析技术均可采用，其中以气相色 谱和高效液相色谱应用最广。例如，多环芳烃、甾体化合物和苄丙酮香豆素(warfarin)等代谢 产物，可用气相色谱或高效液相色谱分离，再用标准品或比色等方法对产物进行测定，以产 物生成量的多少评定 MFO 的活力。 色谱分析法虽然较前述其他方法需要较长的时间和更多的费用， 但可对某些外源化学物 经 MFO 催化的整个生物转化过程及其关键产物有全面了解。例如，利用高效液相色谱阐明 苯并(a)芘的全部代谢过程和终致癌物。 四、线粒体的制备 (一) 大鼠肝脏线粒体的制备 所有操作应在低温条件下进行。全部器械如匀浆器、烧杯、离心管等，以及缓冲液应放 4℃冰箱内预冷。将大鼠(体重 200-250g)断头处死，放尽血液。迅速取出肝脏(约 10g 重)，剪 去结缔组织和血管，放人烧杯内，用预冷的缓冲液清洗 2～3 次，尽可能洗去血液。肝脏用 滤纸擦干后，称重。将肝脏转入 50ml 烧杯内，有剪刀剪成小的组织块，再用预冷的缓冲液 洗 2～3 次，转入匀浆器内。匀浆速度为 1100rpm，用连续较长的时间依次逐渐将杵伸到玻 管的底部。当杵没有额外阻力能进入玻管底物(大约需 6 次上下)时，再做 4 次上下即完成匀 浆步骤。此步骤应注意温度在 0-4℃，以及由玻管底物抽起杵时，缓慢拉起避免产生真空效 应，引起线粒体的机械损伤。 进行差速离心，按下列步骤进行：肝匀桨 离心，460g 10 min上清液 离心，12500g 10 min沉淀(包括细胞核，红细胞 及大的细胞碎片)沉淀 （含有线粒体） 324上清液 弃去经 12500g 离心的沉淀，从外观上可分为三个不同区带：底层为白色或红色，内有残留 的细胞碎片和红细胞；中层为深棕色，是大量完整的线粒体和一些溶酶体；上层为绒毛状， 有光泽，带粉红色，为一些破的线粒体和微粒体。小心去除上层沉淀，收集含有线粒体的中 层沉淀；加适量的缓冲液，再离心 12 500g 10min，收集沉淀。加 2―3ml 缓冲液重新悬浮， 即为线粒体的制备物，其蛋白浓度约为 30mg／ml。 操作要点是熟练，整个制备过程应在 1h 内完成。 (二) 亚线粒体颗粒的制备 其原理是利用超声波作用， 破坏线粒体外膜， 再经超速离心获得仅有内膜的亚线粒颗粒。 它含有全部氧化磷酸化的酶类，对于观察呼吸链氧化反应、ATPase 活性及其它部分的反应 是十分有用的。 1. 缓冲液为 0.25mol／L 蔗糖，含有 1mmol／L EDTA，10mmol／L Tris?HCl 缓冲液， pH7.5。 2. 操作步骤 ①用 10000g×l0min，离心沉淀线粒体。 ②用缓冲液重新悬浮沉淀， 其浓度约为 20mg／ml， 用超声波处理 15s， 间隙 15s， 共 l min， 超声源为一台 60W 功率的超声发生器。 ③经超声处理的线粒体制备物，用缓冲液稀释 2 倍，以 29 000g×l5min，以沉降完整的 线粒体和较大部分的线粒体。 ④将上清移至另一离心管内，以 100000g×30min 离心，沉降亚线粒体颗粒，其沉淀为 红色，外观与松香类似。用等体积的缓冲液再洗一次。 用缓冲液重新悬浮沉淀，使终浓度为 20mg 蛋白／ml，即为亚线粒体制备物。 ⑤注意事项：在超声处理过程中，保持线粒体制备物温度不要升高，维持在 4℃以下。 五、线粒体功能的测定 制备线粒体的质量将受可能的其它亚细胞器如溶酶体和过氧化体的污染和／或线粒体 功能完整性的影响。后者是主要因素，它仅能通过测定各种代谢的功能来评定。 线粒体所执行的各种功能取决于氧化磷酸化过程。 (一) 线粒体呼吸功能的测定 线粒体的氧化磷酸化系统由两个不同但又紧密联系的多酶系统组成，即呼吸链和 ATP 酶／合成酶的两个系统。 呼吸功能通常是利用氧电极测定反应体系的氧分压变化来了解线粒 体的呼吸状况。 1. 试剂 (1) 测定大鼠肝线粒体呼吸的缓冲液为 0.25mol／L 蔗糖， 5 mmol／LKH2PO4， 10 mmol／L KCl，5 mmol／L FeCl2 溶于 10mmol／L Tris?HCl 缓冲液，pH7.4。 (2) 底物：所有三羧酸循环(TEA)的中间产物，如 3―羟基丁酸、谷氨酸、脯氨酸和脂肪 酸均可以。 推荐丙酮酸+苹果酸， 谷氨酸+苹果酸以及 3―羟基丁酸+琥珀酸， 其加入量为 10~20 μ l，终浓度高达 5~l0 mmol／L。 2. 电极调试 (1) 打开电极、磁力搅拌器、纸记录仪和恒温水浴器的开关，使它们平衡至少 30min。 (2) 按使用说明安装氧电极，检查银和铂电极应有光泽，以及聚四氟乙烯膜完好无损。325(3) 取 2ml 呼吸缓冲液，在 30℃预热数分钟，并完全用空气饱和后，放人反应室，开 始搅拌并记录，速度为 1cm／min。 (4) 稳定 1~2min 后，将记录仪调至 95％位置。此为“空气线” ，即是用空气完全饱和的 缓冲液。再过 5min，记录仪不应漂移，如还在漂移，说明电极有问题。 (5) 关掉搅拌器，记录笔瞬间向下偏移，再打开搅拌器，笔应回到“空气线” 。说明电 极有污染，可用浸水棉签清洗。 (6) 在确定电极反应正常后，加入少量连二亚硫酸钠固体，使记录笔迅速下移。数分钟 后，记录笔稳定在较低的位置。此时，缓冲液为无氧状态，笔处的位置为“氮气线” 。通常， 氮气线是位于记录仪调试时的记录零点，此时电极电压为零“氮气线”与“空气线”位置之 差表示缓冲液的氧浓度。 3. 线粒体呼吸的测定 (1 ) 加 1.9ml 呼吸缓冲液的 0.1ml 线粒体制备物，约含蛋白 4mg，进入电极室，注意排 除空气，调正电极位置。封闭电极室后，使线粒体唯一的氧源是呼吸缓冲液中的溶解气体。 (2) 在不改变缓冲液氧浓度的情况下，向电极室加人不同的试剂，其理想办法是用微 量注射器， 并且每次加入量不超过 20μ l。 加试剂时， 应小心缓慢， 不要引起记录笔的 “跳 动” 。 (3) 加入不同代谢物后， 线粒体的代谢状况见表 12-5。 表中所示， 加人代谢物浓度不一， 会引起呼吸速率的改变，其速率限制因素也不一。实验中主要观察状态 3、状态 4，以计算 呼吸调控比(respiratory control ratio，RCR)。 (4) RCR 的计算： 记录内源性呼吸 2min，即状态 1;加底物 S 或 P+M，激发呼吸，使线粒体进入状态 4； 记录 2-3min 后，加入已知量的 ADP，激发线粒体呼吸进入状态 3。当 ADP 消耗完后， 呼吸又回到状态 4。计算 RCR 的状态 4 应是加 ADP 后出现的状态 4，因为起始的状态 4 总 是要比加 ADP 后出现的状态 4 慢。 状态 3 或 4 的呼吸速率计算：已知呼吸缓冲液的氧浓度为 420ng atom O／min，总氧含 量为 840ng atom，记录范围即空气线至氮气线为 95％，故将总氧含量垂直分为 95 等分，每 一垂直等分为 8.8ngatom O。通过记录笔的移动，纵轴为氧耗，横轴为时间，可求出呼吸速 率。 一般琥珀酸为底物， 状态 3 的呼吸速率为 94ng atom O／(mg 蛋白? min)， 状态 4 为 23ng atom O／(mg 蛋白? min)； 而丙酮酸加苹果酸为底物， 状态 3 的呼吸速率为 5lng atom O／(mg 蛋白?min)，状态 4 为 l0ng atom O／(mg 蛋白?min)。故琥珀酸的 PCR 为 4，丙酮酸加苹果 酸约为 RCR 为 5。如果 RCR&3，可认为制备的线粒体失败。 4. ADP／O 比值测定 在生物化学上，P／O 比指磷酸化与呼吸之间的化学计算关系， 常用 Warburg 压力计来测定。此外，依据 P／O 比也等于 ADP／O 比，利用线粒体呼吸测定 试验可求出 ADP／O 比。ADP 的加入量是已知，加入后线粒体的氧耗量，可通过图 W-X 中 的 X 求得。故可计算出 ADP／O 比。ADP／O 比值取决于线粒体的制备情况，ADP 加入量 及 O2 浓度测定的精确性，它是判断线粒体功能是否完好的指标之一。 (二) 线粒体呼吸的抑制作用研究 研究线粒体呼吸的抑制作用， 在了解线粒体氧化磷酸化作用中起着重要的作用。 外源化 学物抑制线粒体的氧化磷酸化过程， 将它们的抑制作用研究与已知抑制剂作用比较， 可探讨326外源化学物作用线粒体氧化磷酸化的机理。 1. 分类 常见线粒体抑制剂的分类见表 12-6。 表 12-5代谢物浓度 状态 O2 1 2 3 4 5 高 高 高 高 无 ADP 低 高 高 低 高 底物 低 无 高 高 高 慢 慢 快 慢 无 ADP 水平 底物水平 呼 吸 链 ADP 水平 氧 水 平 呼吸速率 速率限制因素线粒体的代谢状况表 12-6类 型线粒体抑制剂的分类代表性抑制剂呼吸链抑制 部位 I 部位Ⅱ 部位Ⅲ 解偶联剂 ATP 酶／合成酶抑制 底物转运 离子转运 鱼藤酮 抗霉素 A 氟化钾 CCCP 或 DNP 寡霉素 丁基丙二酸(二羧酸转运) 钙红(Ca2+转运)表 12-7 ATP 合成测定的加样方案测定项目 空 对 测 白 照 定 缓冲液 1ml 1ml 1ml 糖激酶 20μ l 20μ l 20μ l 线粒体制备物 50μ l 50μ l 50μ l H2O 30μ l 30μ l 底 物 ― 10μ l2. 经典抑制作用 经典抑制作用见图 12-6。 对 A-E 模式的解释如下： (A) 鱼藤酮(Rot)可抑制 NADH 连接底物的线粒体呼吸。 加入底物琥珀酸(S)可刺激呼吸， 是因为琥珀酸可绕过鱼藤酮的抑制阻碍进入呼吸链。再加抗霉素 A(Anti―A)可阻断琥珀酸 以后的呼吸链。加入四甲基―对苯胺二胺／抗坏血酸(TMPD／ascorb-)，它们是人工的电子 供体， 故可将电子输入抗霉素 A， 刺激线粒体呼吸， 如加氰化钾(CN-)可阻断由 TMPD／ascorb 刺激的呼吸。 (B) 曲线的上半部分是典型的状态 3 向状态 4 过渡的轨迹。当加入苍术苷(AF4)，不影327响状态 4。ADP 作为阻断 ADP／ATP 易位子的抑制剂也无作用。然而，加人一解偶联剂， 仍可像正常一样，刺激线粒体呼吸，表明假如有抑制剂已经作用于呼吸链，则解偶联剂不可 能刺激线粒体的呼吸。 (C) 用寡霉素(Oligo)可出现同 B 一样的轨迹，它的作用机理可能是对 ATP 酶／合成酶 复合物起抑制作用， 表明两种不同类型的抑制剂可产生对呼吸的相同作用。 需用其它实验加 以区别。 (O／E)这两种曲线，均表现 Ca2+可刺激线粒体的呼吸，而钙组(R．R)可抑制 Ca2+刺激 的呼吸。因为它是一种 Ca2+转运的特殊抑制剂。 由前述可知， 用氧电极研究可获得许多有关外源化学物对线粒体作用的资料。 本研究应 注意的是：①加人多种抑制剂，应保证两次实验之间，彻底清洗电极室；②对于不溶于水的 受试物，应设立溶剂对照，观察溶剂是否对线粒体有作用。在每次实验结束，均应用乙醇洗 去受试物的任何轨迹，再进行下次实验。 (三) ATP 合成的测定 测定线粒体氧化磷酸化除氧化电极外，还有另一种方法，即测定 ATP 合成量。常用的 方法是用葡萄糖／己糖激酶捕捉系统，其中由 ATP 不断产生 ADP，使线粒体维持状态，通 过 Pi 的消失测定 ATP 的形成。本法简便易行，又不需特殊的仪器。此外，由于线粒体制备 物可保持良好的偶联状态，一般为 2～3h，可进行许多测定，尤其是抑制作用的研究。再者， ATP 合成的测定，不同于偶联的氧消耗，受线粒体制备的质量影响较小。 1. 试剂 (1) ATP 合成缓冲液： l0mmol／L Tris?HCl 缓冲液， pH7.5， 内含 0.25mol／L 蔗糖， 22mmol ／L 葡萄糖，5mmol／L 磷酸二氢钾，2mmol／L MgCl2，2mmol／L ADP 等。 (2) 己糖激酶，用 0.25mol／L 蔗糖，10mmol／LTris?HCI 缓冲液，pH7.5 配成 20 单位 ／20μ l 的溶液。 (3) 磷酸测定： 10％三氯醋酸(TCA)， Pi 储备液， 3mmol／L KH2PO4， 用 0.1mol／L H2SO4 为溶剂；ANSA 试剂，10.5g 氨基萘磺酸和 30gNaHSO3?7H20 溶于 250ml 蒸馏水。避光， 冷藏保存。 2. 方法 关键是反应混合物要不断充气。一般用恒温水浴摇床即可满足要求，其速度 为 90 转／min。用闪烁瓶或小的细颈瓶作反应容具。 (1) 如表所示步骤加入各试剂后，在 30℃恒温水浴温育 5min，加入琥珀酸或丙酮酸+苹 果酸为底物，继续温育。 表 12-8 AW 合成测定的加样方案测定项目 空 对 测 白 照 定 缓冲液 1ml 1ml 1ml 糖激酶 20μ l 20μ l 20μ l 线粒体制备物 50μ l 50μ l 50μ l H2O 30μ l 30μ l 底物 ― 10μ l(2) 10min 后终止反应， 取 20μ l 进一小塑料管， 再加 200μ l 10％TCA， 混匀， 离心 5min． (3) 取 100μ l 上清液加人一试管中，再加 3ml 蒸馏水，0.3ml 钼酸铵，充分混匀，加3280.2mlANSA 试剂，混匀，10min 后，在 750nm 处测定其光密度，通过标准曲线(0～0.8μ mol ／LPi)，计算出 Pi 的含量。 在对照或测定管与空白管中 Pi 含量的差值， 即为 Pi 转变或 ATP 的量。 结果表示: nmolATP ／(mg 蛋白?min)。对于肝脏线粒体底物琥珀酸或丙酮酸加苹果酸的正常值分别为 300 和 100nmolATP／(mg 蛋白?min)。第四节生物膜的制备与其性质的研究方法一、大鼠肝细胞膜的制备 其基本原理是将肝组织在含有 Ca2+离子的低渗碳酸氢钠缓冲液中温和匀浆， 使细胞膜保 持较大的膜片；其次，应用低速离心使细胞膜片与细胞核一起从匀浆中分离，再利用细胞膜 与细胞核之间的密度差异，用密度梯度离心将细胞膜从低速离心获得的粗核部分中分离出 来。 (一) 试剂 含有 1． 0mmol／L NaHCO3 的缓冲液， pH7.5； 0.5mmol／L CaCl2 的 1.0mmoL／L NaHCO3 缓冲液；蔗糖溶液浓度分别为 70％，45％，41％和 37％，0.85％NaCl 溶液。 (二) 仪器设备 制备型超速离心机，Potter 匀浆器 (三) 操作步骤 将大鼠禁食 12-24h 后，断头处死，尽量放干净血液，迅速取出肝脏，随即用预冷的生 理盐水洗涤数次， 尽量除去残留的血液。 称重、 剪碎， 于 1.0mmol／L 碳酸氢钠缓冲液 pH7.5， 内含 0.5mmol／LCaCl2(简称缓冲液 A)内进行匀浆，肝匀浆浓度为 10％。然后，用缓冲液 A 将匀浆稀释 10 倍，搅拌、静置。经双层尼龙布过滤后，按图所示操作(0-4℃下进行)。 在差速离心分离所得的沉淀中，加入 70％(W／W)的蔗糖溶液，把比重调至 1.22，转移 至超速离心管中。在其上依次铺加 45％(W／W)、41％(W／W)和 37％(W／W)的蔗糖溶液， 形成不连续的蔗糖密度梯度。在超速离心 100000g，120min。超速离心结束后，收集 41％与 37％蔗糖溶液界面的致密沉淀。用 1.0mmol／L 碳酸氢钠缓冲液，pH7.5，洗涤，以除去蔗 糖，即获得肝细胞膜制备物。 (四) 鉴定 应用最广泛的是利用膜上酶的活力， 作为标志来鉴定膜的分离情况。 肝细胞膜的标志酶 + + 有 5’-核苷酶、Na 、K ―ATPase 等，测定方便，无需大型仪器。但它的不足之处是这些酶 在质膜上并不总是均匀的，据之作出判断有一定的局限性。还有膜上的其它蛋白如膜抗原、 激素受体及外源凝集素受体等可供利用鉴定膜的分离情况。 此外， 还可用放射性核素化学物、 荧光试剂和顺磁试剂等对肝细胞进行共价标记， 以跟踪肝细胞膜在分离时的去向。 但在使用 时尚有一些问题， 如共价标记有时会改变膜的天然性质， 小分子标记物可进入细胞内或吞噬 入细胞等。 二、红细胞膜的制备 红细胞取材方便，结构简单，均一性好。人红细胞去除血红蛋白后即得血影，即红细胞 膜。研究红细胞膜时有三种模式系统可供选择：洗涤过的完整红细胞膜再封血影(resealed329ghost)及封闭的红细胞膜囊泡。 (一) 红细胞膜 常用的制备方法是在低渗条件下胀破红细胞，离心 20000g。洗涤去除血红蛋白，即获 红细胞膜。此种膜最接近整体系统(in vivo)，但它不能控制细胞质内的环境；在应用上有一 定的局限性。此外，低渗制备的红细胞膜虽然去除了细胞内质，但膜的封闭性差；有许多泄 漏的空穴。 (二) 再封血影 近年来发现在一定条件下，胀破了的红细胞可以重新封闭，对 K+等离子不通透，给研 究红细胞膜提供了一模式。其制备的方法有： 1. 血影的低渗液中加入浓盐溶液，成为等渗溶液，置于 37％温育 20min，期间可缓慢 地搅拌 3 次，可得一定比例的再封血影。 2. 将低渗胀破的红细胞在 0℃条件下，过 Bio-gdA 柱，柱上的 1／3pH 为 7.6，以利膜 与血红蛋白分离，下 2／3pH 为 6.0，有利于随后红细胞空泡的重新封闭，当膜从柱上流出 后即用 3Mol／L KCl。调节为等渗液，即 150mmol／L KCI 浓度。在 37℃温育 l h，即获得 重新封闭血影。 (三) 封闭的红细胞膜囊泡 有时为了深入研究，将膜的内、外层翻过来。 1. 正常定向囊泡的制备 在制备好的血彰液混悬内加入 0.1mmol／LMgSO4 溶液， 使细 胞产生胞吐作用(exocytosris)，用滴管轻轻吹打，即获正常定向的囊泡，即与红细胞膜内外 侧相同的囊泡。 2. 内翻泡(inside-outvesicles) 在制备好的血影液混悬内，加入 0.5nmol／L 磷酸钠缓冲 液，pH8.0，在低温条件下 1h。细胞在此条件下，产生吞服作用(endoeytosis)，膜上出现许 多小囊泡，用滴管吸或用注射器上下吸打，即获内翻泡。它是双分子层结构；其内、外层正 好与血影膜相反。 三、脂质体的制备 脂质体(1iposome)是双层脂质包围一些水溶液的小滴，呈球形。它是最常用的人工膜之 一。现在有条件将脂质体制备成单层，直径为 25-30nm 左右，它是较为理想的生物膜模拟 系统。 (一) 大脂质体制备 将适量的磷脂溶于氯仿等有机溶剂， 置于旋转蒸发仪上蒸发至干， 使玻璃壁上附有一层 极薄的磷脂膜，然后加水溶液，并振摇，即可形成直径 lnm 左右的多层大脂质体。 (二) 单层脂质体的制备 1. 最简单的方法是将上述大脂质体用超声波处理，可获直径为 20-50nm 的脂质体。其 不足之处是超声波可影响有些分子的结构与功能。 2. 微量注射法 将磷脂的乙醇溶液在一定压力下经小号注射器针头，注入缓冲液中， 得到各种大小的脂质体，此法简单、容易重复和大量制备。 3. 去垢剂法 卵磷脂经胆酸钠溶解后， 过 SephadexG-50 柱， 除去胆酸， 可获直径为 30nm 的脂质体。 如需获得大小均―的脂质体， 可用超速离心或 Sepharose 2B 凝胶过滤来处理， 超速离心330法比较节省时间，且可获浓度较高的脂质体溶液。凝胶过滤法较为简单，但会被稀释或因吸 附而丢失。 四、大鼠脑突触体膜的制备 其基本原理是将脑组织在预冷的 0.32mol／L 蔗糖溶液中进行匀浆，再利用脑突触体膜 的蛋白质与脂的比例、电荷性质、颗粒大小、形状等不同于其它的细胞器膜进行蔗糖密度梯 度离心，将其分离出来。 (一) 试剂与仪器 不同浓度的蔗糖溶液，0.32mol／L、0.8mol／L 及 1.2mol／L 等；50moL／L Tris 醋酸缓冲 缓液，pH7.2。 制备型超速离心机、低温高速离心机和 Potter 匀浆器。 (二) 操作步骤 选用健康成年大鼠，体重 200~250g，断头放血处死动物，迅速取出大脑，并立即在冰 盘上剥离大脑皮层部分，投入冰冷的 0.32mol／L 蔗糖溶液中，冰浴中用 Potter 匀浆器制备 匀浆(1 000rpm，上下 15 个冲程)，所得匀浆按示意图操作。经上述操作，可获完整的突触体 膜结构。此法需要超速离心机，有时需克服渗透压梯度的影响，常用葡聚糖作为替代蔗糖的 离心介质。 五、对生物膜的生物化学性质的研究方法 (一) 生物膜上结合酶的测定方法 膜结合酶是膜蛋白质重要组成部分之一，研究较为深入的是 Na+,K+―ATPase。本节仅 介绍此酶的测定方法 。 1. 比色法 其基本原理是三磷酸腺苷 (ATP)经 ATPase 的催化水解，成为二磷酸腺苷 (ADP) 和无机磷酸。通过测定所生成的无机磷酸的量，可间接测定 ATPase 的活性。Na+, K+-ATPase 可被 G-毒毛旋花苷(ouabain)抑制，先测出总 ATPase 活性，再测出用毒毛旋花苷 -G 抑制的 ATPase 活性，两者之差即为 Na+,K+―ATPase 活性。 此法一般实验室均可进行，其灵敏度有时难以满足研究的需要。因为，无机磷酸是在酸 性条件下，与钼酸试剂生成磷钼酸，磷钼酸经还原后可形成钼兰，按颜色有深浅，在 660nm 处比色测定，计算无机磷酸的量。 2. 生物发光法 其原理是利用 ATP、虫荧光素和虫荧光素酶形成腺苷酸―虫荧光素酶 复合物而发光，其生物发光强度与 ATP 浓度成正比。当反应液中，ATPase 与 ATP 作用―定 时间，测定 ATP 的消耗量，即测出 ATPase 活性。同时测定经 C ―毒毛旋花苷抑制 Na+ ,K+-ATPase 后的剩余 ATPase 活性，两者之差即是 Na+ , K+-ATPase 的活性。 生物发光法的灵敏性和准确性均高于比色法，它可测出 ATP 的 nmol／L 级浓度，但需 要一定的仪器设备，如生物发光计或液体闪烁计数仪。 (二) 膜脂质过氧化的检测方法 膜脂质过氧化是指膜成分中多不饱和脂肪酸的过氧化， 是机体损伤的形式之一。 从膜脂 质过氧化角度探讨外源化学物的毒性作用， 是目前毒理学研究的热点之一。 检测膜脂质过氧 化的方法可分为三类：氧耗的测定；羟基过氧化物的检测；脂质过氧化产物的检测。本节仅 对脂质过氧化产物的检测方法加以叙述。 1. 硫代巴比妥酸 (TBA) 法 TBA 法的原理是脂质过氧化的降解产物之一一丙二醛331(MDA)，可以与硫代巴比妥酸成色。在 520nm 处进行比色测定，可检测丙二醛相对含量的 变化，以了解生物膜质过氧化的情况。 TBA 法是一非常简便的方法，一般实验室均可进行。此法与荧光法、化学发光法等有 较好的相关性，但不足之处是灵敏度较差，某些因素应加以控制，如线粒体污染，样品中的 铁离子等。 2. 荧光法 原理是脂质过氧化的降解产物丙二醛可与体内蛋白质、氨基酸发生反应， 形成 Schiff 碱。 它因有 N―C=C―C=N 结构面具有荧光， 利用荧光分光光度计测定其荧光的 相对强度，可间接反映生物膜的脂质过氧化水平。 此法灵敏度高，约比 TBA 灵敏 10-100 倍，且可反映脂质过氧化产物丙二醛与体内蛋白 质的相互作用，其不足之处在于荧光没有适当的标准品，一般测定的是相对水平，应设立对 照组。 3. 其他 整体水平上进行脂质过氧化研究的方法，即从动物的呼出气中检出不饱和脂 质过氧化形成的挥发性烃类或乙烷或戊烷的浓度， 计算出脂质过氧化的水平。 此法的优点是 非创伤性检测。 较为灵敏的检测方法是化学发光法， 它是测定脂质过氧化产生的自由基， 尤其是链锁反 应终止阶段产生的激发态羰基， 其灵敏度高。 不足之处是需较特殊仪器的化学发光仪或液体 闪烁计数仪。 六、对膜的生物物理性质研究方法 (一) 膜流动性 膜流动性指膜中脂质分子和蛋白分子的运动。 生物膜的流动性是膜的生物学功能所必须 的， 膜流动性与细胞功能如细胞生长、 分化、 受体功能和酶功能、 膜融合等有着一定的关系。 许多外源化学物可通过改变膜的正常流动性而引起细胞损伤。 1. 膜脂流动性 (1) 荧 光 偏 振 法 ： 原 理 是 用 荧 光 标 记 分 子 l, 6- 二 苯 基 -1,3,5- 己 三 烯 (1,6-diphenyl-1,3,5-hexatrie,DPH)或 8-苯氨基-1-萘磺酸盐(8-anili-1-naphthalenesulfonate， ANS) 先将膜标记。DPN 是测定膜疏水区流动性的标记分子。ANS 有流动性，也能和蛋白质成非 共价结合，它是反映膜表面性质变化的标记分子。 DPH 是一种扁平长形分子，在膜脂质双层中，因疏水环境，其荧光强度明显增长，如 在膜表面亲水环境中几乎不发荧光。当 DPH 嵌入膜中，与磷脂分子平行排列。如磷脂分子 烃链相对不活动，则 DPH 排列整齐，用偏振光激发后，其发射的荧光变是偏振；如烃链活 动加大，使其荧光的偏振度下降。所以，依据偏振度的大小，可判断膜脂流动性。偏振度越 小，说明膜流动性越大，局部微粘度亦越低；反之亦然。 此法具简便、灵敏度高、重复性好的特点，可以反映膜的平均流动性。 用 ANS 可对膜表面性质有所了解：①通常是依据下列参数-ANS-膜复合物的荧光强度 变化反映外源化学物对膜表面性质影响； ②膜上 ANS 的荧光量子产率可反映 ANS 分子周围 环境的极性；③膜对 ANS 的结合量可反映膜表面电荷密度和膜表面分子的排列。 (2) 旋标记法及饱和转移自旋共振波谱法：原理是将能产生自旋共振的标记物结合在膜 磷脂分子的不同部位，应用电子自旋共振波谱仪，测出磷脂分子不同部位的活动度，可分别 探明脂极性头部，脂酰链中部及尾部的流动性。332此法可获得磷脂分子不同部位的更为细致的信息， 不足之处是需较昂贵的电子自旋共振 波谱仪和有经验的专业技术人员。 2. 膜蛋白质的运动 荧光漂白恢复法(fluorescence photobleaching recovery， FPR) 原理 是假想细胞膜上某种组分结合着荧光染料， 而这些组分又随机地分布在膜上。 以适当的荧光 标记分子如异硫氰荧光素标记膜蛋白质分子，在一个小的观察区中测量荧光强度 F。接着， 用强功率的激光照射该部位， 使原标记的蛋白分子上荧光染料产生不可逆的光化学反应―漂 白。停止激光照射后，由于观察区以外的未被漂白的蛋白质分子向这一区域扩散，使之荧光 强度逐渐升高。从荧光恢复曲线上，可算出蛋白质分子的扩散系统等。 运用 FPR 可获得膜蛋白的侧向扩散数据，并用以研究膜蛋白在膜上的状态、其运动性、 脂质―蛋白质的相互作用、 蛋白质―蛋白质的相互作用。 该技术需要氩或氪离子激光发射器、 荧光显微镜、荧光检测系统及数据处理等较为复杂的设备。 (二) 透性 生物膜是有高度选择性的通透屏障， 对于水溶性小分子物质能迅速透过膜， 对于大分子 却不能通透。它在维持细胞的正常生理活动中起着重要作用。 1. 电特征参数的测定 生物膜的电特征参数包括导电性、电容及膜电位等。测定方法 有瞬时和稳定的直流法，稳流稳压的交流法。 这些电特征参数与生物膜的成分，两侧环境和脂溶剂有关，电容测量的重复性好。 2. 荧光素释放法 原理是利用羧基荧光素的自猝灭性质。当包裹在脂质体内部，羧基 荧光素的浓度较大，会产生猝灭而不显示荧光；当膜通透性改变，其从脂质体内向外渗漏， 脂质体内因羧基荧光素稀释而出现荧光。依荧光强度的变化，反映脂质体膜的通透性改变。 (三) 结构的研究方法 生物膜主要由脂类与蛋白质通过非共价键结合形成，糖则通过共价 键与某些膜的脂或蛋白质结合，其形态是呈薄片结构。用于