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自然基金申请书
申请代码： 受理部门： 收件日期： 受理编号：C020202解除保护国家自然科学基金申 请 书资助类别：面上项目 亚类说明：青年科学基金项目 附注说明：项目名称：不同形态氮素调控果实有机酸代谢的分子生理机制 申 请 者：董彩霞 依托单位：南京农业大学 通讯地址：
南京农业大学资环学院 邮政编码： 单位电话：025- 电话： 025-电子邮件：cxdong@申报日期：日国家自然科学基金委员会国家自然科学基金申请书基本信息 nZjocs40YnB申 请 者 信 息学页 学依 托 单 位 信 息 合 作 单 位 信 息学项 目 基 本 信 息科学基金申请 基 ― 申请学学基本摘自 自 基 然要第2页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书项目组主要成员 项目组主要成员 （注:编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 姓 名范晓荣 任丽轩 卢颖林 谢越 严明 [在此录入修改] [在此录入修改] [在此录入修改] [在此录入修改]项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。 ） 性别 女 女 男 男 男 职 称 讲师 讲师 硕士生 硕士生 硕士生 学 位 博士 硕士 学士 学士 学士 单位名称 南京农业大学 南京农业大学 南京农业大学 南京农业大学 南京农业大学 电话 025- 025- 025- 025- 025- 电子邮件 rong.fan@bbsrc.ac.uk lxren@
项目分工 有机酸代谢 酶的表达 有机酸代谢 酶活的测定 有机酸来源 途径确定 有机酸代谢 酶的表达 有机酸代谢 酶的表达 每年工 作时间 （月） 6 8 10 10 10出生年月
总人数 6高级 1中级 2初级博士后博士生硕士生 3说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者） ，总人数自动生成。第3页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书经费申请表科目 一.研究经费 1.科研业务费 （1）测试/计算/分析费 （2）能源/动力费 （3）会议费/差旅费 （4）出版物/文献/信息传播费 （5）其它 2.实验材料费 （1）原材料/试剂/药品购置费 （2）其它 3.仪器设备费 （1）购置 （2）试制 4.实验室改装费 5.协作费 二.国际合作与交流费 1.项目组成员出国合作交流 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 四.管理费 合 计（金额单位：万元）申请经费21.0 6.0 1.0备注（计算依据与说明）15N、14C 分析测试费、DNA 测序、引物合成等 植物生长室水电费 项目组成员参加国内相关学术会议 1-2 次 发表论文所需版面费、函索资料、查新等所需信息 费7.0 0.5 2.0 高效液相色谱柱 3 只 有机酸标准品、反转录试剂盒、RNA 抽提试剂盒、 测酶活需要的试剂 玻璃器皿等易耗品、蒸馏水等3.0 1.0 1.0 参加一次国际学术会议 邀请外籍专家来华讲学、工作交流费 研究生和老师实验室补贴费、临时工用工费等 按 5％计算国家其他计划资助经费 与本项目相关的 其他经费来源 其他经费资助（含部门匹配） 其他经费来源合计0.0000第4页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书查看报告正文撰写提纲报告正文（一）立项依据与研究内容（ 字） ： 1.） 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。1.1 不同供氮形态显著影响番茄叶片和果实中有机酸的含量氮是植物体需要量最大的一种矿质元素。NO3-和 NH4+是植物从土壤中吸收的主要氮素形态。由 于硝化―反硝化作用的存在，土壤中一直处于 NO3-和 NH4+的混合状态。研究表明，NO3-和 NH4+以 一定比例配施能显著促进大部分蔬菜如番茄、辣椒、油菜等的生长，生物量和产量都有显著增加 （Errebhi and Wilcox, 1990; Elamin and Wilcox，1986; Clauseen and Lenz, et al., 1995; Dong et al., 2004） ， 而且 NO3-和 NH4+对叶片内有机酸的含量有显著影响：随着营养液中 NO3-比例减少、NH4+比例增加， 叶片中柠檬酸、苹果酸、α-酮戊二酸、草酸等有机酸的含量显著下降（Dong et al., 2004） ，表明 NO3和 NH4+的同化与植物体内有机酸的合成紧密相关。同时，我们发现，当营养液中 NH4+/NO3- &10% 时，成熟果实中苹果酸的含量显著高于柠檬酸，但二者的总量恒定；当 NH4+/NO3- &50%时，苹果的 含量仍然高于柠檬酸但二者的总量显著降低； NH4+/NO3-=25%时，柠檬酸的含量显著高于苹果酸， 当 二者的总量界于上述两种情况之间。对果实糖/酸比 （可溶性糖/可滴定酸度） 的计算表明， 4+/NO3NH =25%时糖/酸比最高（申请者博士后出站报告） 。而且，不同供氮形态显著影响了果实有机酸代谢关 键酶磷酸烯醇式丙酮酸（PEPCase）和氮代谢关键酶（NR、GS）的活性（董园园等，2006） ，这些 都表明果实中柠檬酸和苹果酸的含量是受氮素形态调控的，但调控的机理尚不明确。国内外关于这 一方面的研究几乎是个空白。下面分别从番茄果实有机酸代谢和氮素形态对叶片内有机酸合成的影 响两个方面加以综述。1.2 果实有机酸代谢（合成、贮存和降解）的研究进展 1.2.1 番茄果实有机酸研究概述糖和有机酸是影响番茄果实品质的重要因素， 二者构成了果实干重的 60%以上 （Salles et al., 2003; David and Hobson, 1981） 其中可溶性糖主要是葡萄糖和果糖， ， 有机酸主要是柠檬酸和苹果酸 （Guillet et al., 2002） ，分别占果实干重的 9%和 4%左右（David and Hobson, 1981） ，另外还包括少量的草酸和 其它微量有机酸（Shahidul Islam et al., 1996） ，因此，对果实有机酸的研究也就是研究柠檬酸和苹果 酸的代谢。绿色果实内同时进行着光合作用和呼吸作用（糖酵解和 TCA 循环） （Carrara et al., 2001） 。 果实有机酸的绝大部分是其自身合成的（李明启，1989） 。番茄果实中的有机酸总量随着果实的发育 而逐渐增加，转红期达到最高值，红熟期稍有下降（Shahidul Islam et al., 1996）或剧烈下降（Guillet et al., 2002） 。不同种类有机酸的含量随果实的成熟而发生不同的变化。苹果酸是在果肉细胞分裂结 束后达到最高值接着下降，而柠檬酸则是在果实成熟前达到最高值（Moing et al., 1998；Guillet et al., 2002）之后快速下降。正常情况下，三羧酸循环中的有机酸不存在积累的问题，但是如果这个途径 上有某（几）个酶的活性改变就会导致某些有机酸含量降低或发生积累。Goodenough（1985）指出， 在番茄果实发育期间，果实中的苹果酸和柠檬酸的含量基本相等，而成熟时苹果酸酶（NADP－ME）第5页 版本 1.003.281国家自然科学基金申请书的活性增加，使苹果酸发生降解；但三羧酸循环中的苹果酸脱氢酶（MDH）和柠檬酸合成酶（CS） 的活性并没有改变，从而导致果实中苹果酸含量下降和柠檬酸积累。积累的有机酸在液泡膜上质子 泵的作用下进入液泡并贮存（Terrier et al., 2001） ；成熟时液泡膜发生渗漏，有机酸外流至细胞质中 被降解，含量下降（Terrier et al., 2001；陈立发等，2005） 。因此，成熟果实的有机酸含量是合成和 降解的平衡结果（Famiani et al., 2000） 。SucroseNRNO3-Chloroplast-Calvin Cycle NiRGS-GOGATPEP PEPCase OAA MDH MalatePyruvateNO2NO2-NH4+Amino acidPyruvate OAA MalateAcetylCoA CSH+-ATPase H+-PPaseMalate Citrate TCA Aconitase Cycle Isocitrate 2-OGNAD-IDHMalate CitrateCitrateAconitaseIsocitrateNADP-IDHVacuoleMitochondria2-OGCytosol 图 1. 未成熟果实中有机酸合成、氮代谢示意图1.2.2 果实有机酸代谢过程中相关酶的研究进展国内外关于果实有机酸代谢过程中相关酶的研究如下： ① 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase） ：是番茄果实有机酸代谢的关键酶（Guillet et al., 2002） 。 在细胞质中，PEPCase 催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成草酰乙酸（图 1） ，草酰乙酸在苹果酸脱 氢酶作用下生成苹果酸。苹果酸和草酰乙酸进入三羧酸循环生成柠檬酸。番茄果实 PEPCase 存在两 种同工酶，分别由 LyCPpc1 和 LyCPpc2 编码（Guillet et al., 2002） 。其中，LyCPpc1 在番茄的 果实和其它器官中均有表达，而 LyCPpc2 仅在番茄果实细胞分裂期结束到果实成熟时有非常强而 特异性表达，在此期间 PEPCase 蛋白含量和酶活性均显著增加，伴随着果实内苹果酸和柠檬酸含量 也显著增加。原位杂交试验表明，LyCPpc2 主要在果实表皮细胞和靠近种子、体积正在膨大的凝 胶细胞中表达（Guillet et al., 2002） 。我们的实验结果表明，等氮量供应不同形态氮素时，100%NO3处理下果实 PEPCase 的活性在青果期达到最高值后急剧下降，而 NH4+/NO3-=25%时该酶在果实发育 前期一直保持较高活性直至果实膨大期后才急剧下降，表明果实 PEPCase 的活性显著受到外源供氮 形态的影响。但影响的机理尚不明确，可能是供氮形态影响了 PEPCase 基因的表达。这也是本项目 重点研究的内容。 ② 柠檬酸合成酶（CS） 、顺乌头酸酶（Aconitase, ACO）和异柠檬酸脱氢酶（IDH） ：这三种酶 被认为是与柠檬果实中的柠檬酸合成和降解有关的酶类（Sadka et al., 2000） 。柠檬酸合成酶是线粒体第6页 版本 1.003.281国家自然科学基金申请书三羧酸循环中的重要酶类，催化草酰乙酸和乙酰辅酶 A 合成柠檬酸。顺乌头酸酶是线粒体中异化柠 檬酸为异柠檬酸的酶，该酶的活性如果受到抑制，则柠檬酸出现积累。有研究指出，线粒体 ACO 和 细胞质 ACO 活性的消长反映了柠檬果实发育成熟中的有机酸的积累和降解（Sadka et al., 2000） 。果 实异柠檬酸脱氢酶（IDH）存在两种形式：线粒体异柠檬酸脱氢酶（NAD-IDH）和细胞质异柠檬酸 脱氢酶（NADP-IDH） ，前者只在线粒体存在并参与三羧酸循环，催化异柠檬酸脱羧生成α-酮戊二酸 （2-OG） ；后者在细胞质、叶绿体、过氧化体中都有。异柠檬酸从线粒体转入细胞质后在 NADP-IDH 的作用下生成α-酮戊二酸，进入叶绿体，为氨基酸合成提供碳架。该酶活性的升高和降低对柠檬酸 的含量有显著影响。果实硝酸还原酶（NR）基因（桃果 NR 序列已公布，登录号 AB061670）的存 在表明果实内可能同时进行着活跃的氮代谢，需要大量的α-酮戊二酸作为合成氨基酸的碳架，其最 终的结果可能刺激了有机酸代谢。不同供氮形态对果实 NR、谷氨酰胺合成酶（GS）转录水平的影 响至今无人报道。这也是我们在本项目中要着重研究的内容。 ③苹果酸脱氢酶（MDH） 、苹果酸酶（NADP－ME） 、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK） ：这 三种酶可能与果实苹果酸合成和降解有关（Ruffner et al., 1984; Popova et al.,1998；Chen et al., 2001） 。 NAD-MDH 常和 PEPCase 共同作用，由 PEPCase 催化产生的草酰乙酸在 MDH 的作用下转变成苹果 酸（Ruffner et al., 1984） 。NADP－ME 和 PEPCK 可能与苹果酸的降解有关。果实中 PEPCK 仅被一 个基因编码，在成熟的番茄果皮中活性和含量都很高，推测可能与果实成熟时苹果酸的降解有关 （Bahrami, 2001） 。 ：这是两种存在于液泡膜上与果 ④ 液泡膜 H+-ATPase（V-ATPase）和 H+-焦磷酸化酶（V-PPase） 实有机酸贮存有关的酶类，通过质子泵的作用，使液泡膜产生质子电化学梯度，将柠檬酸（或苹果 酸）逆浓度梯度运输到液泡中贮存。Milner & Smith（1995）发现，在果实发育早期，液泡膜上 V－ ATPase 活性较高，发育中期下降，果实成熟时又升高，表明 V－ATPase 在果实的整个发育过程中均 起重要作用，能肯定的是它与果实糖的贮存紧密相关（Amemiya, 2005） ，但与柠檬酸或苹果酸的贮 存相关的研究尚不多见。 以上这些酶大多是在多年生木本植物的果实（如柑橘、柠檬、葡萄、桃、梨、苹果等）中进行 研究的，并在分子水平上获得了较大的进展（克隆了相关基因并从转录水平研究了其表达） （陈发兴 等，2005；罗安才等，；2004；Famiani et al., 2000；Etienne et al., 2002; Moing et al., 2000； Sadka et al., b； Diakou et al., 2000） 对番茄果实中有机酸的研究则较少 ； （Gallardo et al 1995； Shahidul Islam et al., 1996；Chen et al., 2001；Bahrami et al., 2001; Guillet et al., 2002） 。同时，柑橘、 柠檬等果实易积累柠檬酸而桃、李等果实易于积累苹果酸（李明启，1989） ，表明这些果实中只有一 条主要的有机酸代谢途径；而番茄果实是苹果酸和柠檬酸含量都较高（尽管酸的总量远远低于柑橘、 葡萄、桃等）的果蔬作物，只研究一两种酶的活性和转录水平上的差异显然不可能全面地说明整个 生育期内果实有机酸变化的根本原因。对氮素形态来说，NO3-和 NH4+对果实中的有机酸含量的影响 研究较少且不深入，绝大多数研究中都仅仅是把有机酸作为一个品质的衡量指标，在国内外文献库 中几乎找不到氮素形态对果实有机酸种类和影响机理的报道。从我们目前的实验结果中能够推测， 除了关键酶 PEPCase 的活性分别受到不同供氮形态（NO3-和 NH4+）的影响，苹果酸和柠檬酸合成、第7页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书降解有关的酶如 NAD－MDH 和 CS、AOC、NADP－IDH 的活性也分别在不同程度上受到 NO3-和 NH4+的影响。因此，十分有必要进一步从分子水平上研究氮素形态对这些酶转录水平上的表达差异 从而揭示不同氮素形态对果实有机酸含量的影响机理。1.2.3 氮素形态对叶片内有机酸代谢影响的研究进展苹果酸是供 NO3-植物所必需的一种有机酸，因为 NO3-的吸收需要苹果酸的参与（Touraine et al., ；Martinoia and Rentsch, 1994） 。业已证明，这些苹果酸可能是 PEPCase 催化的回补反应 生成的草酰乙酸直接在苹果酸脱氢酶的作用下生成的（Mengel and Kirkby, 2001） ，PEPCase 是该过程 的关键酶（Chollet, 1996） 。α-酮戊二酸是氨基酸合成的前体，也是供 NO3-和 NH4+的植物同化所必需 的一种有机酸（Hodges, 2002; Müller et al., 2001; Martinoia and Rentsch, 1994） 。Britto and Kronzucker （2005） 在无机氮同化的模型中提出， 4+同化所需要的碳架α-酮戊二酸就是通过 TCA 循环产生的， NH 是碳、氮代谢的枢纽（Hodges, 2002） 。当供给烟草幼苗 NO3-时，其植株体内一系列氮代谢和有机酸 代谢的相关基因（如 nia、nii、gln、glu（编码氮代谢的有关酶：NR、NiR、GS、Fd-GOGAT）和 ppc、 pkc、Cs、icdh1 或 idh（编码有机酸代谢的酶：PEPCase、丙酮酸激酶 PK、柠檬酸合成酶 CS、细胞 质 NADP－异柠檬酸脱氢酶或线粒体异柠檬酸脱氢酶）的表达均增加（Krapp et al., 2002；Stitt et al, 2002；Scheible et al., 1997；Lancien et al., 1999） ，有机酸的含量也显著增加。因此，植物体内氮代谢 是与碳同化、有机酸代谢紧密相关的（Hodges, 2002） 。 由于氧化还原电位不同，植物对 NO3-和 NH4+的吸收和同化机制截然不同。NH4+是植物从根部 吸收并在根部直接同化的，而 NO3-则主要由根吸收上运至叶片，在叶片中被还原和同化的。NH4+ 的吸收使细胞质碱化，pH 增加；而 NO3-的吸收则是通过质膜上的 H+/NO3-共运门运入细胞质的，细 胞质酸化，pH 下降。不同氮素的吸收导致细胞质内 pH 的改变，从根本上影响了某些酶的活性，从 而导致机体内有机酸含量有很大差异――高 pH 条件有利于提高 PEPCase 和苹果酸脱氢酶的活性， 使 PEP 羧化生成草酰乙酸和苹果酸；相反，低 pH 则提高苹果酸酶的活性，使苹果酸脱羧生成丙酮 酸（Britto and Kronzucher, 2005） 。因此，单供 NO3-的植物体内有机酸含量显著高于单供 NH4+，我们 也发现不同比例铵硝配施可以显著降低番茄幼苗叶片内有机酸尤其是苹果酸和柠檬酸的含量（Dong et al., 2004） ，当营养液 NO3-:NH4+=75:25 时，叶片中苹果酸含量仅为 100%硝处理的 15%。 目前对植物体内有机酸代谢的研究要么只限于根或叶片，从未涉及果实；要么又将研究对象仅 仅局限于果实，营养器官和生殖器官的研究严重脱节，非常有必要将这两部分联系起来综合研究。 同时，虽然通过嫁接试验间接证明柠檬果实中有机酸全部在果实内合成（李明启，1989） ，但韧皮部 细胞质中存在 GS，以及 PEPCase、NADP－ME、GS 大量存在于葡萄果肉组织的维管中都表明了同 化物向果实或种子运输的过程中可能会发生物质合成的过程（Famiani et al., 2000） 。除此之外，番茄 是一种与柠檬、葡萄、苹果等有显著生物学差异的果蔬作物，其生育期短、生长快，因此可能存在 有机酸从营养体运输进入果实或有部分光合同化产物在向果实运输的过程中发生了有机酸的合成过 程。从我们已有的研究结果来看，NO3-和 NH4+对番茄叶片中有机酸的合成和含量是有显著影响的 （Dong et al., 2004） ，因此在不同供氮条件下有机酸从叶片运入果实的可能性更大。第8页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书1.4 不同形态氮素对番茄果实有机酸影响的分子生理机制是什么？ 不同形态氮素对番茄果实有机酸影响的分子生理机制是什么 是什么？ 番茄是最为重要的果蔬类经济作物，也是用于结鲜果实作物遗传学研究的模式作物。它具备其 它如拟南芥、水稻等模式作物所不具备的生物学现象，如果实的发育、成熟过程等等，而且在植物 的进化树中，番茄远离其它模型作物。因此，本项目以番茄作为研究对象，具有重要的植物代谢组 学研究上的普遍指导意义。本项目就是立足于氮素形态对番茄果实内有机酸含量的影响，不仅要弄 清不同供氮形态下果实有机酸是否有部分来自叶片的外运以及氮素形态的调控，而且要从氮素形态 影响果实有机酸代谢的分子基础上阐述果实内有机酸差异的机理，明确两种氮素形态及配比引起有 机酸代谢差异的时空表达模式，其最终的目的是不仅能从理论上回答影响果实有机酸代谢的分子基 础，而且能为农业生产中氮素形态调控果实有机酸提供理论依据和新的思路。 主要参考文献：Amemiya T., Kanayama Y., Yamaki S, et al., 2005. Fruit-specific V-ATPase suppression in antisense-transgenic tomato reduces fruit growth and seed formation. p9 Bahrami AR., Chen ZH., Walker RP., et al. 2001. Ripening-related occurrence of phosphoenolpyruvate carboxykinase in tomato fruit. Plant Molecular Biology 47: 499-506 Britto D., and Kronzucher HJ. 2005. Nitrogen acquisition, PEP carboxylase, and cellular pH homeostasis: new views on old paradigms. Plant, cell, environment. 6-1409. Carrara S., Pardossi A., Soldatini GF. 2001. Photosynthetic activity of ripening tomato fruit. Photosynthetica., 39(1): 75-78 Chen GP., Wilson ID., Kim SY et al., 2001. Inhibiting expression of a tomato ripening-associated membrane protein increases organic acids and reduces sugar levels of fruit. Planta, 9-807 Chollet R, Vidal J, O’leary MH. 1996. Phosphoenolphruvate carboxylase: an ubiquitous, highly regulated enzyme in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47: 273-298 Claussen W, Lenz F. 1995. 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董园园 董彩霞 卢颖林 缪辰 沈其荣 NH4+-N 部分代替 NO3--N 对番茄生育中后期氮代谢相关酶活性的影响. 土壤学 报,)，在印 李明启，果实生理。北京：科学出版社，1989. 罗安才, 李道高, 李纯凡. 柑桔果实糖酸比及线粒体乌头酸酶活性的变化. 西南农业大学学报, 2004, (4). 467-470 罗安才, 李道高, 杨晓红. 柑桔果实有机酸代谢研究进展. 园艺学报, 2001, (S1): 597-602 罗安才, 杨晓红, 邓英毅, 李纯凡等. 柑橘果实发育过程中有机酸含量及相关代谢酶活性的变化. 中国农业科学, 2003, (8). 941-944第 10 页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书2.项目的研究内容、研究目标 以及拟解决的关键问题 （ 以及拟解决的关键问题。 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。 此部分为重点阐述内容）2.1 研究内容(1) 不同供氮形态（NO3-、NH4+）下番茄果实中有机酸来源的研究 在不同供氮条件和果实的不同发育阶段（幼果、绿熟、转红、成熟四个时期） ，分别对目标果实 下面的那一个叶片（果实同化物运入的“源” ）引入放射性同位素 14CO2，同时用环蒸法烫伤果柄、 主茎段以及叶柄的韧皮部，并采用改进的“空种皮杯法”检测有机酸（主要是柠檬酸和苹果酸） ；同 时用活体法收集并监测韧皮部汁液中柠檬酸和苹果酸的含量，研究不同形态氮素处理下叶片内合成 的有机酸是否是果实内有机酸的来源之一； (2) 不同形态氮素（NO3-、NH4+和 NO3-:NH4+=75:25）对外运来的有机酸的合成、运输的影响的研究 如果研究内容 1 的结论是肯定的，即番茄果实内的有机酸是有部分来源于叶片产生的有机酸， 那么就展开如下研究内容：在不同形态氮素处理下、果实不同发育时期、分别对叶片引入放射性同 位素14CO2，研究叶片内柠檬酸和苹果酸的含量、有机酸合成的关键酶 PEPCase 以及氮代谢关键酶NR 和 GS 活性和转录水平上的表达差异，计算外运有机酸占果实总有机酸的比例，揭示不同形态氮 素对果实中外运的那部分有机酸合成的差异和对果实有机酸总量的贡献率。如果研究内容 1 的结论 是否定的，即番茄果实内有机酸完全是果实自身合成的，那么就开展研究内容 3。 (3) 不同形态氮素（NO3-、NH4+和 NO3-:NH4+=75:25）对果实不同发育期中果实中的柠檬酸和苹果酸 含量、游离 NO3-、NH4+含量以及柠檬酸和苹果酸合成的主要酶活性影响的研究 从营养液中引入 15N，在果实发育的四个时期（同上）分别采集果实，分析果实中柠檬酸、苹果 酸、15NO3-、15NH4+的含量，同时测定柠檬酸和苹果酸代谢的酶（PEPCase、CS、ACO、NAD(P)-IDH、 NAD-MDH、NAD-ME）和氮代谢关键酶（NR、GS）的活性，从生理学角度明确不同形态氮素对不 同发育阶段果实有机酸含量和各种酶活性的影响。 (4) 研究不同形态氮素（NO3-、NH4+和 NO3-:NH4+=75:25）对果实不同发育期中柠檬酸和苹果酸合成 的酶、氮素代谢关键酶基因表达模式的影响 根据研究内容 3 的结果，可以初步判断哪些酶对番茄果实有机酸合成的影响最大，在此部分中 就重点研究这些酶在转录水平上的表达差异。 根据已经报道的保守序列， 分别设计引物， RT－PCR 用 方法研究这些酶受不同形态氮素影响的分子机制，同时研究果实中氮代谢关键酶（NR 和 GS）在转 录水平上表达差异。 从分子水平上综合分析氮素形态对果实柠檬酸和苹果酸合成的酶的差异之所在。2.2 研究目标(1) 揭示不同形态氮素影响果实有机酸来源和含量的生理和分子机制； (2) 为农业生产中氮素形态调控果实有机酸含量提供理论依据2.3 拟解决的关键问题： 拟解决的关键问题：第 11 页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书(1) 本项目在实验技术上要解决的关键问题是如何确定韧皮部烫伤的程度以及适应全生育期实验所 用 15N 的丰度。 (2) 项目要解决的关键科学问题是揭示不同形态氮素影响果实有机酸含量的生理和分子机制。3.拟采取的研究方案及可行性分析。 （ 拟采取的研究方案及可行性分析。 包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）3.1 研究方法和实验手段(1) 环蒸试验：环蒸韧皮部是以烫伤韧皮部组织来研究同化物运输的经典实验。不同发育时期的番茄叶柄、果柄和主茎段韧皮部的厚度不同。参照文献 1 分别在每个发育时期取这些部位做石蜡切片 以确定韧皮部的厚度。用 90℃热水烫 9-10 秒。 (2) 改进的“空种皮杯”法：根据戴玉玲等（1997），做以下改动：①琼脂糖的制备：在烧杯中置于 适量的 1%琼脂糖和一只温度计， 放在可调低温电炉上缓缓加热， 待完全融化后降低温度到 30℃ （此 时琼脂糖即将凝固）。② 将果实从果柄和萼片接口处取下，留下完好的果柄和萼片，用滴管吸取适 量即将凝固的琼脂糖液滴于摘除果实处，然后用塑料袋将处理中的果柄、萼片和琼脂糖密封起来。 半个小时左右，将塑料袋和琼脂糖块取下，稀释，与未处理的琼脂糖作对照，定量或定性分析其中 柠檬酸和苹果酸的含量或放射性。 (3) 果实中有机酸的提取和测定：我们通过比较蒸馏水直接提取、80%乙醇提取－旋转蒸发浓缩、 蒸馏水提取－冷冻干燥浓缩三种方法对番茄果实和叶片中有机酸的提取，最终确定采用以蒸馏水直 接提取法既能有效保证有机酸的提取量，又能大大简化试验步骤[3]。在原有高效液相色谱测定有机 酸的基础上，本课题组探索出用一种流动相测定植物体内 12 种有机酸和 Vc 的方法[4]。该方法操作 简单，回收率高，误差小。 (4) 果实和叶片中 PEPCase 的提取和活性测定： PEPCase 活性测定：参照 Nobuhisa 和 Motoki（1997）的方法，并略有改动。①提取：将叶片或 未成熟的番茄果实（成熟的果实则直接匀浆提取）置于预冷研钵中，加入少许石英砂、0.15g 左右聚 乙烯吡咯啉酮（PVP）及 3ml 咪唑－HCl 提取缓冲液（成分为 20％（V/V）甘油、5mmol L -1MgCl2 溶液、 5mmol L C1 NaF 溶液、 5mmol L -1 巯基乙醇、 15mmol L -1 苯甲基磺酰氟 （PMSF）1mmol L -1EDTA ， 、 pH7.1） ，冰上研磨成匀浆，再分别用 1ml 咪唑－HCl 提取缓冲液洗 2 次，接着 18,000r min-1 离心（离 心温度为 4℃）20min，得到的上清液即为酶的粗提取液。②分离与提纯：将粗酶提取液经 0.22?m 滤膜过滤，吸取滤液 1.5ml，经 Sephadex－G25 柱脱盐、分离和提纯，收集流出液。③测定：取收 集液 1ml 与 0.8ml 50m mol L -1HEPES-KOH 缓冲溶液（成分为 0.2mmol L -1NADH、10mmol L -1MgCl2 溶液、10mmol L -1NaHCO3 溶液、2mmol L -1 磷酸烯醇式丙酮酸）混合，混合液在室温（25℃）下保 温 5min，然后放入紫外分光光度计中并开始计时，在 340nm 处进行测定，并以 OD340 下降 0.01 作为 一个酶活性单位。 果实中顺乌头酸酶、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、NADP－异柠檬酸酸合成酶的提取和活性 测定均按照罗安才（2003）方法。 (5) RT－PCR 检测酶在转录水平上的表达 根据已有的在番茄上或在桃、柑桔等果实中克隆出的柠檬酸和苹果酸合成的相关酶、叶片中第 12 页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书PEPCase 以及叶片和果实中氮代谢关键酶（NR 和 GS）的基因序列，设计引物，用 RT－PCR 方法研 究这些酶在转录水平上的表达。 参考文献： 1. 植物生理学实验手册. 上海植物生理学会主编。上海:上海科学技术出版社出版. 2. 戴玉玲，张蜀秋，杨世杰，娄成后. 1997. 研究种子同化物卸出的微注射法和空种皮杯法。植物生理学通讯，33(5): 3. 4. 5. 6. 7. 8.363-367 董园园， 董彩霞， 沈其荣， 卢颖林， 缪辰. 2005. 高效液相色谱法分析植物组织中有机酸含量的前处理方法比较. 南 京农业大学学报，28(4): 140-143 董彩霞，董园园，王健，沈其荣，王格. 用一种流动相测定植物体内 12 种有机酸和 Vc 的方法. 土壤学报，2005 （42） ，2：280-284. Nobuhisa K, Motoki I. Responses to Nitrogen Sources and regulatory properties of root phosphoenolpyruvate carboxylase. Soil Sci. Plant Nutr , ～650 罗安才,杨晓红,邓英毅,李纯凡,向可术,李道高. 柑橘果实发育过程中有机酸含量及相关代谢酶活性的变化. 中国农 业科学,2003,(8). Etxeberria ED & Gonzalez P. 2004. Simultaneous isolation of tonoplast and plasmalemma from Citrus juice cells: Combination of sucrose gradient and two phse partitioning. Hortscience, 39: 174-176. Terrier N., Sauvage FX., Ageorges A. et al. Changes in acidity and in proton transport at the tonoplast of grape berries during development. Planta. -28第 13 页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书3.2 技术路线NO3-:NH4+=100:0, 0:100 幼果、绿熟、转红、成熟期 环蒸果柄韧皮部，收集“库”端有机酸有检测 14C-柠檬酸 14 C-苹果酸无NO3-:NH4+=100:0, 75:25，0:100 ，NO3- 和 NH4+ 的 吸收速 率☆叶片和果柄、 果枝、叶柄等 韧皮部内的 PEPCase、 NR、 GS 的活性和 表达强度果实和 叶片中 柠檬酸 和苹果 酸的含 量★柠檬酸 和苹果 酸、 可溶 性糖的 含量、 产 量PEPCase ★ NAD-MDH, NADP-ME, CS,游离 NO3-、 NH4+ 和游离 氨基酸 含量★AOC, ADP-IDH, NR 和 GS(★)的活 性揭示不同形态氮素对外运有 机酸合成和运输的影响机制根据已报道的果实内的上述相关基因序 列，分别设计引物，用 RT－PCR 方法研 究其在转录水平上的时空差异表达模式从生理和分子水平上揭示氮素形 态对果实有机酸含量的影响机制 注：☆ 示已经开展并有初步的实验结果；★ 示已经开展并发表了相关论文（土壤学报，2006）3.3 实验方案实验 1. 采用逐步排除法研究果实中有机酸的来源途径，主要是确定在不同供氮条件下果实有机酸是 否有部分来自叶片。 以韧皮部环蒸、叶片引入放射性同位素 14CO2、改进的“空种子杯法”收集有机酸并结合活体收 集叶片韧皮部汁液的方法来研究同化物在韧皮部中的运输及在“库”端的卸载。以“Micro-Tom”番 茄品种（生育期 70-90 天）为材料，采用砂培滴灌栽培（图 2） 。设全硝（100% NO3-）和全铵（100% NH4+）两个处理（总氮浓度 4mM，不引起铵毒害；其它营养元素按 Hoagland 营养液配方和阿农微第 14 页 版本 1.003.281国家自然科学基金申请书量元素营养液配方配制；均添加 7?mol/L 硝化抑制剂） ，分别在开花后 7 天（幼果期） 、14 天（青果 期） 、28 天（转红期）和 35 天（成熟期）在图 3 所示的 1，2，6，7 的部位环蒸韧皮部，将叶片引入 放射性同位素 14CO2，标记 1 小时，结合改进的“空种子杯法”收集“库”端有机酸，同时用活体法 收集叶片韧皮部汁液监测其中柠檬酸和苹果酸的放射性和含量。如果答案是肯定的，则转入实验 2。 如果在“库”端检测不到有机酸，则证明果实中有机酸全部是果实发育过程中自身合成的，转入实 验 3；2 1 3 4 7 5 图 2. 番茄自动滴灌栽培方式 （品种：Micro-Tom） 61. 2. 3. 4. 5.果枝 果柄 萼片 果实 叶片（此处示意图为单叶， 实际上 是复叶）6. 叶柄 7. 果 柄 与 叶 柄 间的主茎段图 3. 研究番茄果 实有机酸运输途 径的示意图实验 2. 研究不同氮素形态对外运来的有机酸的合成、运输的影响的研究 我们已有的实验结果表明，营养液中 NO3-:NH4+=75:25 能显著促进番茄幼苗的生长和提高产量 （Pedosphere, 2004; 土壤学报， 2006）因此， 。 在本实验中设置三个氮形态处理 （NO3-:NH4+=100:0; 75:25; 0:100，总氮浓度 4mM） ，品种和栽培方式同实验 1。主要研究氮素形态对叶片有机酸运输的影响。 通过分析不同形态氮素对叶片中柠檬酸和苹果酸含量的影响、 叶片内有机酸合成的关键酶 PEPCase、 果柄、主茎段以及萼片等韧皮部中 PEPCase 的活性和转录水平上的表达差异、NO3-和 NH4+的吸收和 同化速率、NR 和 GS 的活性与表达差异，以揭示不同形态氮素对果实外源运入的有机酸的含量差异 的分子生理机制； 实验 3. 研究不同形态氮素对果实有机酸含量、有机酸代谢相关酶和氮代谢相关酶活性的影响。 品种、栽培方式、处理、采样时间均同实验 2，不同之处在于在营养液中采用+ 15N 标记，NO3 :NH4 =75:25 时采用交叉标记。每次采集 15 个左右果实，分析果实中柠檬酸、苹果酸、NO3-、 NH4+、 氨基酸、 可溶性糖的含量， 同时测定柠檬酸和苹果酸合成的酶 （PEPCase、 ACO、 CS、 NADP-IDH、 NAD-MDH）和氮代谢关键酶（NR、GS）的活性，初步从生理学角度获得 NO3-和 NH4+对不同发育 阶段果实有机酸含量和相关酶活性的影响的实验结果，为进一步在分子水平上研究各种酶在转录水 平上的差异打下生理学基础；第 15 页 版本 1.003.281国家自然科学基金申请书实验 4. 用 RT－PCR 方法研究氮素形态对果实有机酸代谢的影响。 品种、栽培方式、处理、采样时间均同实验 2。根据实验 3 的研究结果，将一些受氮素形态影 响不大的酶可以不再做进一步的研究。根据已经报道果实中存在的有机酸代谢酶的保守序列，分别 设计引物，用 RT－PCR 方法研究不同形态氮素处理对上述酶在不同发育时期、不同部位上在转录水 平上的表达模式的影响； 同时， RT－PCR 研究对果实内氮代谢关键酶 NR 和 GS 的转录水平差异， 用 将两者进行综合分析，从而在分子水平上揭示氮素形态对果实柠檬酸和苹果酸合成的酶和氮代谢关 键酶的影响机理。3.4 关键技术环蒸法烫伤韧皮部的实验虽然比较经典，但在番茄上的应用未见报道，必须在每个采样时期用 石蜡切片来观察并确定韧皮部的位置。3.5 可行性分析① 我们已有的研究结果表明，营养液中不同氮素形态显著影响了果实柠檬酸和苹果酸的含量和比 例，也显著影响了果实有机酸代谢关键酶 PEPCase 和氮代谢关键酶 NR、GS 的活性，表明果实中柠 檬酸和苹果酸的含量是受氮素形态调控的，本项目正是立足于这一科学问题，从分子水平进一步研 究这种差异的机制之所在。 ② 申请者在硕士研究阶段就开始对两种氮素形态（NH4－N 和 NO3－N）对光合和叶绿素荧光参数 的影响进行了研究，并在《植物生理学报》和《作物学报》中分别发表论文；博士研究阶段对番茄 果实钙生理又做了大量研究，熟练掌握了番茄栽培和果实取样方法。关于不同形态氮素对不同生育 阶段果实内氮素代谢相关酶 NR、GS 和 PEPCase 活性的影响目前也在《土壤学报》 （2006，43 卷） 发表，这使得本项目的顺利实施有了坚实的研究基础和可靠的技术保障。 ③ 在本项目中要研究的 PEPCase 是有机酸合成的关键酶，我们已经熟练掌握测定果实中该酶活测 定，其在番茄果实中相关的基因序列都已经公布；其它要研究的酶活性测定也有成熟的方法并且在 果实中的基因序列也已公布，这使我们完全有把握完成这些基因在番茄果实中的表达方面的工作。 ④ 申请者所在的植物营养分子生理实验室具有先进的仪器设备、良好的科研条件，如荧光定量实 时及普通多通量 PCR 仪、凝胶成像系统、大容量高速及台式冷冻离心机、电激转化细胞融合仪、摇 床、超纯水制备系统、灭菌锅、杂交炉、超低温冰箱（柜）、冷冻干燥仪等是本项目顺利实施的基 本保证。 申请者认为，已经开展的研究和所获结果、课题组成员的研究背景、课题所需实验和技术装备 条件均能够满足本研究的需要，研究计划和实施步骤合理稳健，完全能够实现预期目标。4.本项目的特色与创新之处。 本项目的特色与创新之处。4.1 本项目的特色之一是从转录水平上研究果实有机酸代谢酶和氮代谢酶的时空表达模式，从而揭 示不同形态氮素对果实有机酸含量影响的分子机制。 4.2 本项目的特色之二是以番茄为研究对象并选用速生模型番茄“Micro-Tom”品种。番茄是结鲜蔬 菜遗传学研究的模式作物，本项目以番茄作为研究对象，具有重要的植物代谢组学研究上的普遍指 导意义。“Micro-Tom”品种具有以下特点：① 该品种生长期短（从播种到收获 70-90 天）、个体 小（10-15cm）、种植密度大（每平方米 1357 株），不仅大大缩短了研究周期，而且克服了常规品 种由于生长期长、个体大（一般樱桃番茄为无限生长类型、普通大番茄也高达 80cm-150cm，生长周第 16 页 版本 1.003.281国家自然科学基金申请书期至少 100-120 天）而造成目标差异扩大化的缺点；② 该品种与正常番茄品种仅有三个基因基因位 点（分别是 Dwarf, Miniature, Self-pruning）存在差异（均是控制植株高矮），因此，完全可以将对 该品种的研究结果推广应用到生产上广泛使用的品种上，使得整个研究过程简单而不失代表性；③ 该品种是筛选相关功能基因突变体的最有利工具（Emmanuel and Levy, 2002），这使得我们在进行 相关基因表达研究之后可以通过筛选突变体来做进一步的深入研究，以保证该研究的延续性。 4.3 本项目的创新之处在于：在适宜比例铵硝营养配施能提高番茄产量的前提下，分别从生理和分 子水平上研究不同供氮形态对果实有机酸代谢酶和氮代谢关键酶活性和转录水平的影响，揭示不同 氮素形态对果实有机酸含量的分子生理机制，为农业生产中氮素形态调控果实有机酸含量提供理论 依据。5.年度研究计划及预期研究结果。 （包括拟组织的重要学术交流活动、 国际合作与交流计划等） 年度研究计划及预期研究结果。按照“研究方案”中的实验 1 进行试验。摸索“空种皮杯法”的操作条件、熟练韧皮部环割和2007 年 1 月－7 月 收集韧皮部汁液的方法，研究不同供氮条件下果实有机酸来源的可能途径。预期发表至少 1 篇核心 期刊论文； 2007 年 8 月－2008 年 2 月 NH 叶片有机酸含量和关键酶 PEPCase、 NR、 按实验 2 进行试验。 包括测定 NO3-、 4+的吸收速率、 GS 的活性和表达。预期发表 2 篇核心期刊论文和 1 篇 SCI 源论文； 2008 年 3 月－2008 年 9 月 按照实验 3 进行试验并重复一次。包括测定不同发育时期果实游离 NO3-、NH4+的含量、有机酸 的含量和系列有机酸代谢和氮代谢关键酶的活性。目的是获得氮素形态对果实有机酸含量和相关酶 活性差异的生理资料。预期将至少发表 2 篇核心期刊论文； 2008 年 10 月－2009 年 8 月 按照实验 4 进行试验。主要用 RT－PCR 方法进行果实有机酸代谢酶和氮代谢关键酶的表达。预 期发表 2 篇核心期刊论文和至少 1 篇 SCI 源论文； 2009 年 9 月－2009 年 12 月 数据整理、统计分析，全面总结，项目鉴定，汇报。（二）研究基础与工作条件 1、工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩） 工作基础通过近三年来对不同形态氮素对番茄叶片和果实有机酸含量影响的研究，我们发现，不同供氮 形态对番茄幼苗叶片和果实中有机酸含量有显著的影响，而且氮素形态的不同配比显著影响了果实 中柠檬酸和苹果酸的含量和比值，对其中有机酸代谢的关键酶 PEPCase 和氮代谢关键酶 NR 和 GS 的活性也进行了初步研究，部分内容已经在 Pedosphere 等刊物上发表。项目参加人范晓荣在分子生 物学方面有很好的工作基础， 申请者本人目前正在进行 PEPCase 的 RT－PCR 分析， 所在的植物营养 分子生物学实验室设备齐全，完全能够顺利开展本项研究。另外，申请者分别从硕士和博士期间对 氮素形态和番茄方面开展了大量的研究工作：在硕士阶段对不同形态氮素影响不同蛋白质含量小麦 幼苗光合、荧光等生理作用进行了研究，以第一作者发表 3 篇论文；博士期间对番茄钙营养和钙生 理方面进行了大量研究，以第一作者发表核心期刊论文 9 篇，SCI 论文 1 篇。因此无论在实验内容还第 17 页 版本 1.003.281国家自然科学基金申请书是实验技术和手段方面均已为本项目的完成奠定了很好的基础，项目一旦批准，就可以按计划进行， 完成预期目标。2、工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家重点实 工作条件验室和部门开放实验室的计划与落实情况。 ） 申请者所在的植物营养分子生理实验室具有的设施有：荧光定量实时及普通多通量 PCR 仪；凝 胶成像系统；大容量高速及台式冷冻离心机；电激转化细胞融合仪；摇床；超纯水制备系统；灭菌 锅；杂交炉；超低温冰箱（柜）；冷冻干燥仪；Waters 高效液相色谱仪；自动流动注射分析仪；40 平方米的组培室及恒温、恒光植物生长室等，完全具备进行该项目研究所需的条件。目前最需购买 的是液相色谱柱（耗损重， 已废弃 1 只） 反转录试剂盒及合成引物等， 、 需从本项目申请经费中支出。3、申请人简历（包括申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关 申请人简历的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。论著目录要求详细列出所有作者、 论著题目、期刊名或出版社名、年、卷（期） 、起止页码等；奖励情况也须详细列出全部受奖人员、 奖励名称等级、授奖年等） 董彩霞， 董彩霞，博士，副教授，硕士生导师。1996 年获山东农业大学植物营养学学士学位，1999 年获山东 农业大学植物生理学理学硕士学位， 2002 年获中国科学院南京土壤研究所植物营养学博士学位， 2002 年 8 月－2004 年 11 月在南京农业大学农业资源利用博士后流动站做博士后研究工作， 出站后留任植 物营养系教师。迄今已发表核心期刊研究论文 19 篇，其中 2 篇为 SCI 收录。在校期间，分别于 1998 年、1999 年、2001 年分别荣获“山东农业大学优秀硕士”、“山东省优秀硕士毕业生”、“中国科学院南 京土壤研究所优秀博士研究生”荣誉称号。在本项目中整体把握实验进展并负责 氮代谢关键酶（NR 和 GS）的克隆和表达研究。其它参加者： 其它参加者：范晓荣，南京农业大学植物营养分子生物学博士。1999 年获南京农业大学生物技术专业理学学士学 范晓荣 位；2002 年获南京农业大学植物营养专业农学硕士学位；2005 年获南京农业大学植物营养专业博士 学位。迄今发表论文 9 篇，其中 2 篇为 SCI 收录。在本项目中和一个研究生一起负责 PEPCase、柠 檬酸合成酶等有机酸代谢相关酶基因的 RT―PCR 分析； 任丽轩，讲师，植物营养专业，2001 年获中国农业大学植物营养学农学硕士学位。主要从事植物营 任丽轩 养和连作障碍方面的研究。在本项目中主要和一个硕士生一起负责氮代谢酶和 PEPCase、柠檬酸合 成酶等有机酸代谢相关酶的活性测定； 卢颖林，植物营养专业硕士研究生，研究方向为植物营养生理学，在本项目中负责不同形态氮素对 卢颖林 果实外运有机酸的检测和分析。 郭强，植物营养专业硕士研究生，研究方向为植物营养生理学，负责有关酶活性的测定。 郭强 谢越，植物营养专业硕士研究生，研究方向为植物营养分子生理学，负责有机酸代谢酶表达的研究。 谢越近期发表与本项目有关的论文有： 近期发表与本项目有关的论文有：Dong C.X., Zhou J.M., Fan X.H., et al. Application methods of Ca supplements affect nutrient levels and Ca forms in mature fruits of tomato. J. Plant Nutrition.. 2004,28. (8) ,. Dong Caixia, Shen Qirong, Wang Ge. Tomato growth and organic acid changes in response to partial replacement of NO3--N by NH4+-N Pedosphere. ): 159-164 3. 董彩霞，周健民，范晓晖等。花期减少施钙量对不同钙效率番茄果实钙形态和含量的影响。植 1.第 18 页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书物生理学通讯, ),128-130. 4. 董彩霞，周健民，王庆亚，乔丽雅，王火焰。缺钙对不同钙效率番茄幼苗钙吸收及幼茎解剖结 构的影响。植物营养与肥料学报，), 233-237. 5. 董彩霞，田纪春，赵世杰。籽粒蛋白质含量不同的小麦品种间光合速率的比较。植物生理学报， ） ，419-424 6. 董彩霞，赵世杰，田纪春，孟庆伟，邹崎。不同浓度的硝酸盐对高蛋白小麦幼苗叶绿素荧光特 性的影响。作物学报，） ，59-64 7. 董彩霞，田纪春，赵世杰。不同形态氮素对高蛋白小麦幼苗叶绿素荧光特性的影响。西北植物 学报，） ，229-234 8. 董彩霞,周健民,赵世杰,王火焰.外源钙对不同钙敏感型番茄幼苗某些生理特性的影响.应用生态学 报，） ，267-272 9. 董彩霞, 周健民, 王火焰, 范晓晖. 缺钙对不同钙效率番茄幼苗根系 ATP 酶活性及膜透性的影响. 土 壤学报，2006，43：在印 10. 董彩霞，董园园，王健， 沈其荣， 王格. 用一种流动相测定植物体内 12 种有机酸和 Vc 的方法. 土 壤学报，2005（42） ，2：280-284 11. 董园园，董彩霞，沈其荣，卢颖林，缪辰. 2005. 高效液相色谱法分析植物组织中有机酸含量的 前处理方法比较. 南京农业大学学报，28(4): 140-143 12. 董园园 董彩霞 卢颖林 缪辰 沈其荣 NH4+―N 部分代替 NO3-―N 对番茄生育中后期氮代谢相关 酶活性的影响. 土壤学报，） ，在印 13. 卢颖林，董彩霞，沈其荣等. 应用 HPLC 同时测定植物组织中六种细胞分裂素组分和生长素的含 量，植物营养与肥料学报，接收 14. Xiaorong Fan, Qirong Shen, Zhengqiang Ma, Huilan Zhu, XiaoMing Yin, Anthony J. Miller, 2005, A comparison of nitrate transport in four different rice (Oryza sativa L) cultivars，Science in China Ser. C Life Sciences, 2005, Vol. 48:897-911 (SCI) 15. Xiaorong Fan, Ruth Gordon-Weeks, Qirong Shen and Anthony J. Miller, 2006, Glutamine transport and feedback regulation of nitrate reductase activity in barley roots leads to changes in cytosolic nitrate pools. Journal of Experimental Botany,1-8（on line） 16. 尹晓明，范晓荣，贾莉君，曹云，沈其荣，2005，NH4+的吸收对水稻根系细胞膜电位的影响， 植物营养与肥料学报，11（6） ：769-773 17. Fan Xiao-rong, Anthony J Miller, Shen Qi-rong, The measurement of membrane potential and NO3 activity in root cells using ion-selective microelectrodes. Agricultural Sciences in China, ): . 范晓荣 沈其荣，2003，ABA 和 IAA 对旱作水稻叶片气孔的调节作用，中国农业科学，36(12)： . 贾莉君，范晓荣，尹晓明，曹云，沈其荣，2005，双阻离子选择性微电极测定活体不结球小白 菜叶片细胞中硝酸根离子的活度，土壤学报，42（3） ：447-452 20. 任丽轩,左元梅,江荣风,张福锁.石灰性土壤上 HCO3-诱导花生缺铁失绿的机制。生态学报，2005， 25(4): 795-801 21. Li-xuan Ren, Rong-feng Jiang， Yuan-mei Zuo， Fu-suo Zhang, Qi-rong Shen .Effect of soil water content on iron nutrition of peanut in calcareous soils under varying CaCO3 regimes. Plant and Soil. Accepted4、承担科研项目情况（申请者和项目组主要成员正在承担的科研项目情况，包括自然科学基金 承担科研项目情况的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、负责的内容等。 ）第 19 页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书作为主要参加人，独立完成“中国科学院南京土壤研究所所长基金（编号 BR0007）”有关番茄钙 营养与生理方面的研究，以第一作者发表国内外有关论文 9 篇；获得中国博士后基金“蔬菜作物液泡 内硝酸盐高效利用的生理机制（编号 ）”资助，已结题。现在以南京农业大学优秀人才科 研启动费（3 万元）和“土壤－植物营养国家重点实验室基金”（4 万元）作为启动资金。5、完成自然科学基金项目情况（对申请者负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准 、号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总 结摘要（限 500 字）和相关成果的详细目录。 ） 无（三）经费申请说明（要求按照《国家自然科学基金经费管理办法》认真填写，购置 5 万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项目研究的直接相关性及必要性。 ） 经费15项 目 N、14C 分析测试费、PEPCase、NR、GS 等酶活测定、引物 合成 恒温培养室电费、水费等 项目组成员参加国内相关会议的会议费/差旅费 发表论文所需版面费、审稿费等、函索资料、查新等所需信 息费 反转录试剂盒、 RNA 抽提试剂盒及有机酸标准品和测酶活试 剂 玻璃试管等易耗品 购高效液相色谱柱（用无机盐作流动相，色谱柱损耗重） 项目组成员参加一次国际会议费 邀请外籍教授来华工作交流、讲学等 研究生和老师实验室补助费、临时工用工费 按 5%计算单位： 万 6 1 1.5 2.5研究 经费 21 万科研业务费 11 万实验材料费 10 万7 0.5 2.5 3.0 2.5 1.4 27.4国际合作与交流费 劳务费 2.5 万 管理费 1.4 万 总 计（四）其他附件清单（附件材料复印后随纸质《申请书》一并上交） 附件材料复印后随纸质《申请书》一并上交）（随纸质申请书一同报送的附件清单，如：具有中级技术职称申请者的推荐信或在职研究生申请 项目的导师推荐信等。在导师的推荐信中，需要说明申请课题与学位论文的关系，承担课题后的工 作时间和条件保证等。 ）第 20 页版本 1.003.281国家自然科学基金申请书[ 申 请 者：董彩霞 依托单位：南京农业大学 项目名称：不同形态氮素调控果实有机酸代谢的分子生理机制 资助类别：面上项目 亚类说明：青年科学基金项目 附注说明：签字和盖章页(此页自动生成,打印后签字盖章) 签字和盖章页(此页自动生成,打印后签字盖章)解除保护申请者承诺： 申请者承诺：我保证申请书内容的真实性。如果获得基金资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自 然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填 报失实和违反规定，本人将承担全部责任。 签字：项目组主要成员承诺： 项目组主要成员承诺我保证有关申报内容的真实性。如果获得基金资助，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的 有关规定，切实保证研究工作时间，加强合作、信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人 报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担相关责任。 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 姓 范晓荣 任丽轩 卢颖林 谢越 严明 名 工作单位名称 南京农业大学 南京农业大学 南京农业大学 南京农业大学 南京农业大学 项目分工 有机酸代谢 酶的表达 有机酸代谢 酶活的测定 有机酸来源 途径确定 有机酸代谢 酶的表达 有机酸代谢 酶的表达 每年工 作时间 (月) 6 8 10 10 10 签 字依托单位及合作单位承诺： 依托单位及合作单位承诺：已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研 究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守国家自然科学基金委员会有 关规定，督促项目负责人和项目组成员以及本单位项目管理部门按照国家自然科学基金委员会的规 定及时报送有关材料。 依托单位公章 日期： 合作单位公章 1 日期： 合作单位公章 2 日期：
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