重组质粒的构建与转化2_百度文库
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重组质粒的构建与转化2
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你可能喜欢如图表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列．现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．请回答下列问题：（1）用图1中的外源DNA（含有目的基因D）和图2中的质粒构建重组质粒需要使用限制酶和
．前者（酶）的专一性很强，其作用特点是
．（2）应该使用限制酶BamHⅠ同时处理质粒、外源DNA，而不选择其他3种，原因在于
．（多选） A．若使用SmaⅠ或者MspⅠ会破坏目的基因．B．若使用SmaⅠ切割质粒，能成功切开质粒得到粘性末端的可能很低．C．若使用MboⅠ切割质粒，质粒上会有2处被切开，会将质粒切成两段不利于筛选．D．使用限制酶BamHⅠ能保证目的基因和质粒获得相同的粘性末端，以便目的基因和运载体定向连接，不至于反向连接．E．使用BamHⅠ切割质粒，质粒上会有1处被切开，破坏抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于将来筛选含目的基因的受体细胞．F．只有使用BamHⅠ切割，才能保证质粒和目的基因上产生相同的粘性末端．（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d．从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有
种不同DNA片段．若同时用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割图2中的质粒，则可得到
个DNA片段．（4）为了筛选出成功导入含目的基因D的重组质粒的大肠杆菌，一般可进行如下步骤筛选：第一步：将大肠杆菌在含
的培养基上培养，得到如图3的菌落．第二步：再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含
的培养基上培养，得到如图4的结果（空圈表示与图3对照无菌落的位置）．第三步：选出图3培养皿中的某些菌落进行培养，即可得到含重组质粒的大肠杆菌．请在图3中圈出含目的基因的重组质粒的大肠杆菌的菌落以上筛选方式至少需要两步，其实还有其他更简单的操作方法．请阅读下列材料，回答问题．大肠杆菌pUC118质粒的某限制酶唯一酶切序列，位于该质粒的lacZ基因中．lacZ基因中如果没有插入外源基因，便可表达出β-半乳糖苷酶．当培养基中含有A物质时，A物质便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落；如果lacZ基因中插入了外源基因，带有pUC118质粒的大肠杆菌便不能表达β-半乳糖苷酶，培养基中的A物质不会被水解成蓝色，大肠杆菌将形成白色菌落．pUC118质粒还携带了氨苄青霉素抗性基因．如图5是利用lacZ基因筛选重组质粒示意图．（5）用图5中的培养基中筛选导入了重组质粒的受体大肠杆菌，制备时除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外还应加入物质应包括
（多选） A．伊红美蓝试剂
D．氨苄青霉素
F．噬菌体（6）将上述处理后的大肠杆菌置于图5中培养基上培养，以检测受体大肠杆菌是否导入重组质粒，结果可能出现蓝色或者白色菌落，其中
色大肠杆菌菌落即为含重组质粒的目的菌． - 跟谁学
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在线咨询您好，告诉我您想学什么，15分钟为您匹配优质老师哦马上咨询&&&分类： 如图表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列．现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．请回答下列问题：（1）用图1中的外源DNA（含有目的基因D）和图2中的质粒构建重组质粒需要使用限制酶和
．前者（酶）的专一性很强，其作用特点是
．（2）应该使用限制酶BamHⅠ同时处理质粒、外源DNA，而不选择其他3种，原因在于
．（多选） A．若使用SmaⅠ或者MspⅠ会破坏目的基因．B．若使用SmaⅠ切割质粒，能成功切开质粒得到粘性末端的可能很低．C．若使用MboⅠ切割质粒，质粒上会有2处被切开，会将质粒切成两段不利于筛选．D．使用限制酶BamHⅠ能保证目的基因和质粒获得相同的粘性末端，以便目的基因和运载体定向连接，不至于反向连接．E．使用BamHⅠ切割质粒，质粒上会有1处被切开，破坏抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于将来筛选含目的基因的受体细胞．F．只有使用BamHⅠ切割，才能保证质粒和目的基因上产生相同的粘性末端．（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d．从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有
种不同DNA片段．若同时用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割图2中的质粒，则可得到
个DNA片段．（4）为了筛选出成功导入含目的基因D的重组质粒的大肠杆菌，一般可进行如下步骤筛选：第一步：将大肠杆菌在含
的培养基上培养，得到如图3的菌落．第二步：再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含
的培养基上培养，得到如图4的结果（空圈表示与图3对照无菌落的位置）．第三步：选出图3培养皿中的某些菌落进行培养，即可得到含重组质粒的大肠杆菌．请在图3中圈出含目的基因的重组质粒的大肠杆菌的菌落以上筛选方式至少需要两步，其实还有其他更简单的操作方法．请阅读下列材料，回答问题．大肠杆菌pUC118质粒的某限制酶唯一酶切序列，位于该质粒的lacZ基因中．lacZ基因中如果没有插入外源基因，便可表达出β-半乳糖苷酶．当培养基中含有A物质时，A物质便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落；如果lacZ基因中插入了外源基因，带有pUC118质粒的大肠杆菌便不能表达β-半乳糖苷酶，培养基中的A物质不会被水解成蓝色，大肠杆菌将形成白色菌落．pUC118质粒还携带了氨苄青霉素抗性基因．如图5是利用lacZ基因筛选重组质粒示意图．（5）用图5中的培养基中筛选导入了重组质粒的受体大肠杆菌，制备时除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外还应加入物质应包括
（多选） A．伊红美蓝试剂
D．氨苄青霉素
F．噬菌体（6）将上述处理后的大肠杆菌置于图5中培养基上培养，以检测受体大肠杆菌是否导入重组质粒，结果可能出现蓝色或者白色菌落，其中
色大肠杆菌菌落即为含重组质粒的目的菌． 如图表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列．现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．请回答下列问题：（1）用图1中的外源DNA（含有目的基因D）和图2中的质粒构建重组质粒需要使用限制酶和．前者（酶）的专一性很强，其作用特点是．（2）应该使用限制酶BamHⅠ同时处理质粒、外源DNA，而不选择其他3种，原因在于．（多选） A．若使用SmaⅠ或者MspⅠ会破坏目的基因．B．若使用SmaⅠ切割质粒，能成功切开质粒得到粘性末端的可能很低．C．若使用MboⅠ切割质粒，质粒上会有2处被切开，会将质粒切成两段不利于筛选．D．使用限制酶BamHⅠ能保证目的基因和质粒获得相同的粘性末端，以便目的基因和运载体定向连接，不至于反向连接．E．使用BamHⅠ切割质粒，质粒上会有1处被切开，破坏抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于将来筛选含目的基因的受体细胞．F．只有使用BamHⅠ切割，才能保证质粒和目的基因上产生相同的粘性末端．（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d．从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有种不同DNA片段．若同时用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割图2中的质粒，则可得到个DNA片段．（4）为了筛选出成功导入含目的基因D的重组质粒的大肠杆菌，一般可进行如下步骤筛选：第一步：将大肠杆菌在含的培养基上培养，得到如图3的菌落．第二步：再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含的培养基上培养，得到如图4的结果（空圈表示与图3对照无菌落的位置）．第三步：选出图3培养皿中的某些菌落进行培养，即可得到含重组质粒的大肠杆菌．请在图3中圈出含目的基因的重组质粒的大肠杆菌的菌落以上筛选方式至少需要两步，其实还有其他更简单的操作方法．请阅读下列材料，回答问题．大肠杆菌pUC118质粒的某限制酶唯一酶切序列，位于该质粒的lacZ基因中．lacZ基因中如果没有插入外源基因，便可表达出β-半乳糖苷酶．当培养基中含有A物质时，A物质便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落；如果lacZ基因中插入了外源基因，带有pUC118质粒的大肠杆菌便不能表达β-半乳糖苷酶，培养基中的A物质不会被水解成蓝色，大肠杆菌将形成白色菌落．pUC118质粒还携带了氨苄青霉素抗性基因．如图5是利用lacZ基因筛选重组质粒示意图．（5）用图5中的培养基中筛选导入了重组质粒的受体大肠杆菌，制备时除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外还应加入物质应包括（多选） A．伊红美蓝试剂
D．氨苄青霉素
F．噬菌体（6）将上述处理后的大肠杆菌置于图5中培养基上培养，以检测受体大肠杆菌是否导入重组质粒，结果可能出现蓝色或者白色菌落，其中色大肠杆菌菌落即为含重组质粒的目的菌．科目:最佳答案解：（1）用图1中的外源DNA（含有目的基因D）和图2中的质粒构建重组质粒需要使用限制酶和DNA连接酶．限制酶的专一性很强，其作用特点是能够识别特点的碱基序列并加以切割．（2）A、若使用SmaⅠ或者MspⅠ会破坏目的基因，A正确；B、之所以不用SmaⅠ限制酶，原因是这种酶切割目的基因会破坏目的基因，利用这种酶质粒，不可能得到粘性末端，B错误；C、若使用MboⅠ切割质粒，质粒上会有2处被切开，并且两个抗性基因均会被破坏，这将不利于筛选，C正确；D、使用限制酶BamHⅠ切割目的基因和质粒，使目的基因和质粒获得相同的粘性末端，这会导致目的基因和运载体反向连接，D错误；E、使用BamHⅠ切割质粒，质粒上会有1处被切开，破坏抗生素A抗性基因，保留抗生素B抗性基因，以便于将来筛选含目的基因的受体细胞，E正确；F、利用BamHⅠ或MboⅠ切割，能保证质粒和目的基因上产生相同的粘性末端，F错误．（3）杂合子的基因型为Dd，其中D基因片段有两个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现三个片段长度分别是537bp、790bp、661bp，发生基因突变后的d基因片段只有一个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现两个片段长度分别是1327bp、661bp，所以从杂合子中分离的DNA片段被限制酶SmaⅠ完全切割后形成会四种不同的DNA片段．限制酶MspⅠ在质粒上存在一个酶切位点，而限制酶MboⅠ在质粒上存在于两个酶切位点，因此同时用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割图2中的质粒，则可得到3个DNA片段．（4）分析图解可知，该基因工程中，最好选择限制酶BamHⅠ切割目的基因和质粒，但是利用该酶切割将会破坏抗生素A抗性基因，则抗生素B抗性基因为重组质粒中的标记基因．在筛选过程中，首先让大肠杆菌在含抗生素B的培养基上培养，得到图3的菌落是含有目的基因及抗生素B抗性基因的菌落；再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含抗生素A的培养基上培养，得到图4的结果，则图4中的菌落是既含抗生素B抗性基因又含有抗生素A抗性基因的菌落．所以选出图3中有但图4中对应部位没有的菌落进行培养，就可以得到含重组质粒的大肠杆菌．（5）根据题意可知，pUC118质粒还携带了氨苄青霉素抗性基因，因此制备培养基时需要加入氨苄青霉素进行筛选，同时还需要加入琼脂作为培养基的凝固剂，A物质用于鉴定lacZ基因是否被破坏．（6）如果lacZ基因中插入了外源基因，带有pUC118质粒的大肠杆菌便不能表达β-半乳糖苷酶，培养基中的A物质不会被水解成蓝色，大肠杆菌将形成白色菌落．因此其中白色大肠杆菌菌落即为含重组质粒的目的菌．故答案为：（1）DNA连接酶
能够识别特点的碱基序列并加以切割（2）ACE（3）4
（4）抗生素B
画图如右 （5）B、C、D （6）白解析分析图1：图中DNA片段含有2个限制酶SmaⅠ切割位点，可被限制酶SmaⅠ切割产生长度为534+3=537bp、796-3-3=790bp、658+3=661bp的三中DNA片段．基因D两侧序列为GGATCC，可被限制酶BamHⅠ切割．分析图2：质粒含有CCGG序列、GGATCC序列和GATC序列，其中CCGG序列可被限制酶MspⅠ切割，GGATCC序列和GATC序列可被限制酶MboⅠ切割．用限制酶BamHⅠ切割破坏了抗生素A抗性基因，但没有破环抗生素B抗性基因，因此含有重组质粒的大肠杆菌能抗抗生素B，但不能抗抗生素A．知识点:&&基础试题拔高试题热门知识点最新试题
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标题: 载体构建之末(载体构建,质粒,抗性,大肠杆菌)
摘要: [载体构建之末(载体构建,质粒,抗性,大肠杆菌)] 大家好，很是让我郁闷，我现在在做构建载体，之前的一切非常顺利，但是到了最后的一步我停滞不前，现在我要将4k的片段（sal i+sca i）连入载体中但是我转化了五次全部失败了，最后发现是把我的引物的酶切位点和错了。我就郁闷死了20多天就这白玩了，我先在又重新合成的引物重新来做，但是今天挑菌发现只有两个，我还是非常高兴的摇了这两个，结果发现lb是浑浊了但是和之前的不太一样，有点象清鼻涕状，看不到菌液 关键词:[质粒 抗性 载体构建 大肠杆菌 载体 连接体系 引物]……
大家好，很是让我郁闷，我现在在做构建载体，之前的一切非常顺利，但是到了最后的一步我停滞不前，现在我要将4k的片段（sal i+sca i）连入载体中但是我转化了五次全部失败了，最后发现是把我的引物的酶切位点和错了。我就郁闷死了20多天就这白玩了，我先在又重新合成的引物重新来做，但是今天挑菌发现只有两个，我还是非常高兴的摇了这两个，结果发现lb是浑浊了但是和之前的不太一样，有点象清鼻涕状，看不到菌液的絮状沉淀，我怀疑有问题，但是还是鼓起勇气提了质粒。oh 我要疯了，没有质粒！怎么可能！我又重新挑了一遍，菌液还是如此，还是没有质粒。有抗性无质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)！难道是我的质粒和大肠杆菌(Escherichia coli)的基因组重组了。哎，今天又做了连接和转化，看看每天怎么样！我只希望明天有一个阳性的好了，我只盼有一个。请大家帮我分析一下。附上我的连接体系及过程说明：片段4k载体：9k。连接体系为10ul，两者比例在1:6----1:10只有，16度连接20h，3ul t4（takara），感受态（自己制作）没啥问题，一直在用，非常好用。将上述连接产物转入感受态细胞中冰浴30min，42度热激90s，再在冰浴中1-2分钟，加入无抗性的lb培养基，然后37度复苏1小时后涂于有抗性的平板上37度培养，由于这两个酶一个是平的一个是粘性的，所以我加大了酶量，也延长了连接时间。以上就是我现在的问题。请大家帮我分析。谢谢大家花了时间看了以上内容。谢谢大家了。期待您的回复！
回复How did you prepare the 4 kb insert DNA? Did you cut off the insert with Sal I plus Sac I from the other plasmid construct or from PCR fragment? In either case, how the digestion is done? Did you start the digestion by adding the two enzyme together, or did you finish the digestion first with Sal I, then cut the DNA with Sac I after DNA being cleaned?I am not sure that you have had any colonies in your first 5 ligations and transformations. You need to make sure that either 4 kb insert or the 9 kb vector is prepared with the Sal I and Sac I digested ends reliable to be reconnected. You said that the competent cells were made by yourself, have you ever tested the commercial one, such as the MaxiEfficiency DH5a from Invitrogen? In your cloning experiments, you need to try everything to get results that you have some more colonies, 50-500 colonies, from each ligation and transformation before you have chance to screen the positive one.回复4K的片段，用的还是两个不是很好用的酶，这个成功率。。。换酶切位点吧楼主。另外建议把片段分成两个小片段构建，做两个克隆分步上。回复补充说明：我的4k片段是pcr产物后双酶切得到的，骨架质粒也是双酶切得到的。今天看了板子一无所有，空空如也。哎，怎么办呢？回复建议：1）楼主的片段的准备可以做到更好一些，比如T连之后再切（如果两个酶双切条件不允许，进行分步切），保证酶切的片段的可靠性。2）楼主选择的一个平端一个粘末端的情况实际的链接效率很低，甚至低于两个平端的链接效率，这个如果可以的话重新选择适合的酶切点，若不行干脆平端pcr产物直接连接载体中，再筛选你所需的目的克隆或许时间更节省。3）建议楼主16℃连接过夜后，连接产物可再在4℃放置3-4h，再转化，可提高连接效率。4）对于感受态的问题，楼主完全那个对照质粒（大小与连接产物接近）做个对照，验证你的感受态转化大片段的效率。（我之前有个14k的片段转化自制JM109的感受态不是很高，后来用的takara，效率明显高很多。）5）楼主复苏时间长点呗，增加连接后的克隆的复制数，便于获得阳性克隆。实验不要急躁，冷静分析。。祝好运。。回复载体和pcr产物 双酶切一定一定要彻底切好了 没可能连不上回复同样遇到有抗性无质粒的(Escherichia coli)。。。回复4K的是不那么好连接的，需要多尝试下。Q回复今天我从t载体中切下来了我的4k片段，这会重新连接看看效果如何。
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电话：021-重组质粒的构建经验~~~_百度文库
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