甲硫氨酸可以通过甲硫氨酸循环再生，为什么说它是必需氨基酸呢？_百度知道义项指多义词的不同概念，如的义项：网球运动员、歌手等；的义项：冯小刚执导电影、江苏卫视交友节目等。
学名：2-氨基-4-甲巯基丁。一种含硫的非极性α氨基酸。L-甲硫氨酸是组成的20种中的一种，是哺乳动物的必需氨基酸和生酮氨基酸。其侧链易氧化成甲硫氨(亚)砜。符号：M。甲硫氨酸是构成的必需氨基酸之一，参与蛋白质合成。
英文名 DL-Methionine
别称 甲硫基丁氨酸
化学式 C5H11O2NS
分子量 149.21
CAS登录号 59-51-8
中文学名:甲硫氨酸或甲硫基丁氨酸 俗名中文名称:DL-蛋氨酸中文别名:DL-甲硫氨酸;DL-2-氨基-4-甲硫基丁酸;混旋蛋氨酸英文名称:DL-Methionine英文别名:(±)-2-Amino-4-(methylmercapto)DL-2-Amino-4-(methylthio)butanoicacid单字母符号:M三字母符号:MetCAS号:59-51-8分子式:C5H11O2NS线性分子式:CH3SCH2CH2CH(NH2)COOH分子量:149.21MDL号:MFCDBeilstein号:636185EC号:200-432-1密度:1.340g/cm3沸点:186.8°C at 760 mmH类别:氨基酸类对应:AUG对应:UAC甲硫氨酸，是含硫，生物体必须将D-型在体内转化为L-型才能被机体利用。与生物体内各种含硫化合物的代谢密切相关。在生物体内先从ATP接受基变成S-腺苷酰甲硫氨酸(活性甲硫氨酸)再进行甲基转移。失去甲基的同型经胱硫醚变成半胱氨酸。当缺乏时，会引起食欲减退、生长减缓或不增加体重、肾脏肿大和肝脏铁堆积等现象，最后导致肝坏死或纤维化。蛋氨酸是α-氨基酸的一种，在它的分子中，含有一个碱性基团(-NH2)和一个酸性基团(-COOH)，它是二性的。可以看出在强酸性溶液中它是以阳离子形式存在，而在强碱性溶液中，它是以阴离子形式存在的，在等电点处结晶出来，即当加酸或加碱至羧基和氨基的离子化程度相等时，溶液的pH值为它的等电点。蛋氨酸的等电点为5.74，由于它的这些性质，所以蛋氨酸虽然是有机物，但它具有无机物的某些属性，如它可以溶于水，但难溶于非极性物质，有相当高的熔点，其水溶液性质与具有高偶极矩的水溶液相似等等。又由于蛋氨酸的机构中有一个不对称的碳原子，所以它具有旋光性，且存在一对对映体。在较早的文献中，对不同的旋光性和不同的对映体均以d(右旋)、l(左旋)表示。将旋光性和对映体加以区分，对映体右旋构型记以&D&，左旋构型记以&L&，二者之间是实物与镜象的关系。又根据旋光方向不同，分左旋记以l(或&-&)，右旋记以d(或&+&)本文所采用的符号与原文献相同。等量的右旋构型和左旋构型共同混合时，它们的旋光能力就相互抵消，不显示旋光性，这样的等量对映体的混合物称为外消旋体。记以&DL&。人工合成的蛋氨酸就是外消旋体。蛋氨酸的两个对映体(D和L)除了比旋光性大小相等方向相反外，具有相同的物理化学性质，但在对另一具有旋光性化合物反应时，左右旋体的反应速率常常不相同。但两个对映体与外消旋体的物理性质往往有区别，这是由于它的晶体结构与纯对映体不同，1:1的对映体化合物(DL)比每一个孤单的对映体在晶格中排列得更紧密一些，所以表现在熔点、溶解度和比重不相同。对于二个对映体(L或D)与外消旋体(DL-)的热力学(化学)性质根据法方文献介绍:左旋构型(L-)的ΔS可以用于外消旋体的ΔG的计算中。(ΔG=(ΔH-ΔS)但是外消旋体由根据热容扩展的低于90K的数据而得到的熵数据，对于L-构型大多数情况不适用。同时根据热力学的Kopp规则(固体化合物的热容约为构成元素的原子热容量总和)，即左旋体(L)于外消旋体(DL-)的热容数据可用相同的方法估算。尽管这个规则是很粗糙的，但从文献发表的其它氨基酸的DL-热化学数据与其左旋构型(L)基本相同，或完全相同。因此只要左旋构型(L)的热力学数据可靠，在没有外消旋体的热力学和热化学数据的庆卡下，使用左旋构型数据可以做近似计算。
外观与性状:白色薄片状结晶或结晶性粉末。有特殊气味。味微甜。熔点:280~281℃(分解)(L体);281℃():10%水溶液的PH值5.6~6.1。:无旋光性。:对热及空气稳定。对不稳定，可导致脱甲基作用。溶解性:溶于水(3.3g/100ml,25℃)、稀酸和稀碱。于95%，极难溶于，几乎不溶于。相对密度(水=1):1.340(消旋体)
甲硫氨酸，为含硫之一。是蛋白质的一种成分，卵白蛋白和中很多，天然得到的是L-型。是必需氨基酸之一，L型D型都有效。或直接脱去和氨，而间接地经同型半胱氨酸分解成α-酮酸。甲硫氨酸的生物合成是从O-乙酰同型等硫化物，或由半胱氨酸的逆途径生成同型(至此仅在链孢霉上出现)，再向同型半胱氨酸通过转移甲基而生成。这些甲基有由⑴N-最高正价化合物(例如)，⑵ S-最高正价化合物(例如)直接转移的，有由⑶活性C1单位新产生的等。再者活性甲硫氨酸本身，也通过分解成同型半胱氨酸，成为、N-甲基烟酸、、等的。活性甲硫氨酸经过脱羧、脱硫甲基反应也变成。另一条合成途径是通过硫甲基转移给α-酮丁酸而生成甲硫氨酸。甲硫氨酸含的硫对碱是稳定的。溴化氰在甲硫氨酸残基处可将肽切断，因此多用于氨基酸排列的研究。甲硫氨酸为人体必需八种氨基酸之一。人体内不能合成，必须依靠外源补充。在人体内与ATP结合生成S-腺苷氨酸。
L-甲硫氨酸 中国药典2010版Test Items项目Specification质量指标Assay 含量≥98.5%Characteristic性状白色结晶或结晶性粉末，有特臭。Specific rotation[a]D比旋度+21.0°~ +25.0°Identification 鉴别该品的红外吸收图谱与对照图谱(光谱集444图)一致PH酸度5.6~6.1Transmittance溶液透光率≥98.0%Chloride氯化物≤0.02%Sulfate硫酸盐≤0.02%Ammonium铵盐≤0.02%Other amino acids其他氨基酸≤0.5%Loss on drying干燥失重≤0.2%Residue on ignition炽灼残渣≤0.1%Iron铁盐≤0.0015%Heavy metals(as Pb)重金属≤10ppmArsenic砷盐≤0.0001%Bacterial endotoxins细菌内毒素≤25 EU/gStorage:Preserve in well-closed containers密封保存
酸度测定:取该品0.5g，加水50ml溶解后，依法测定，pH值应为5.6~6.1。溶液的透光度:取该品0.5g，加水20ml溶解后，照分光光度法，在430nm的波长处测定透光率，不得低于98.0%。检验:取该品0.30g，依法检查，与6.0ml制成的对照液比较，不得更浓(0.02%)。硫酸盐检验:取该品1.0g，依法检查，与标准硫酸钾溶液2.0ml制成的对照液比较，不得(0.02%)。铵盐检验:取该品0.10g，依法检查，与标准氯化铵溶液2.0ml制成的对照液比较，不得更深(0.02%)。其他氨基酸测定:取该品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述溶液5μl，点于硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)为展开剂，展开后，晾干，在90℃干燥10分钟，喷以茚三酮的丙酮溶液(0.5→100)，再在90℃加热10分钟，立即检视，应只显一个紫色斑点。干燥失重:取该品，在105℃干燥3小时，减失重量不得过0.2%。炽灼残渣 不得过0.1%。铁盐 取该品1.0g，依法检查，与标准铁溶液1.5ml制成的对照液比较，不得更深(0.0015%)。重金属 取该品0.50g，加水23ml溶解后，加(PH3.5)2ml，依法检查，含重金属不得过百万分之十。砷盐 取该品2.0g，加水23ml溶解后，加盐酸5ml，依法检查，应符合规定(0.0001%)。热原测定:取该品，加制成每1ml中含20mg的溶液，依法检查，剂量按家兔体重每1kg注射10ml，应符合规定(供注射用)。
方法名称:甲硫氨酸原料药-甲硫氨酸的测定-电位滴定法应用范围:该方法采用滴定法测定甲硫氨酸原料药中甲硫氨酸的含量。该方法适用于甲硫氨酸原料药。方法原理:供试品加无水甲酸与冰醋酸溶解后，，用高氯酸滴定液进行电位滴定，并将滴定的结果用空白试验校正，根据滴定液使用量，计算甲硫氨酸的含量。:⒈ 冰醋酸⒉ 无水甲酸⒊ 高氯酸滴定液(0.1mol/L)⒋ 结晶紫指示液⒌ 基准邻苯二甲酸氢钾仪器设备:电位滴定仪:①滴定液(0.1mol/L)配制:取无水冰醋酸(按计算，每1g水加醋酐5.22mL)750mL，加入(70~72%)8.5mL，摇匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL，摇匀，放置24小时。若所测供试品易，则须用水分测定法测定本液的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量为0.01%~0.2%。标定:取在105℃干燥至恒重的基准约0.16g，精密称定，加无水冰醋酸20mL使溶解，加结晶紫指示液1滴，用本液缓缓至蓝色，并将滴定结果用空白试验校正。每1mL滴定液(0.1mol/L)相当于20.42mg的。根据本液的消耗量与的取用量，算出本液的浓度。②结晶紫指示液取结晶紫0.5g，加冰醋酸100mL使溶解。操作步骤:精密称取供试品约0.13g，加无水甲酸3mL与冰醋酸50mL溶解后，照电位滴定法，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于14.92mg的C5H11NO2S。注:&精密称取&系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一。&精密量取&系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。参考文献:中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005年版，一部，p.126。
⒈可用经水解、精制而得。⒉也可由与经斯特雷克合成反应制备(由和加成后再与和反应，生成a-氨基腈，再经水解得到a-氨基酸)。
DL-蛋氨酸(DL-Methionine)用途:营养增补剂。与L-型蛋氨酸的生理效果相同，但价格低(L-型由DL-型制得)，故一般均用DL-蛋氨酸。在燕麦、黑麦、米、、小麦、花生粉、、土豆、菠菜等植物性食品中属于限制氨基酸。添于上述食品中以改善氨基酸平衡。需要量随胱氨酸摄入量而异。成人男子需要量为1.1g/d。海胆味与蛋氨酸有关，海胆甜味与甘氨酸、丙氨酸有关，苦味与缬氨酸有关，鲜味与谷氨酸等有关，因此可将这些氨基酸配制成调味剂。尚用于氨基酸输液，综合氨基酸制剂。按我国GB2760-86规定可用作香料。
抗肝硬变、及各种急性、慢性、病毒性、黄疸性肝。甲硫氨酸可以促进肝细胞膜磷脂甲基化，使膜流动性增强Na、K -ATP酶泵作用强，可以减少肝细胞内胆汁的淤积，转硫基作用加强，从而增强了肝细胞内半胱氨酸、谷胱苷肽及的合成，减少了在肝内聚积，加强了解毒作用，有利于肝细胞恢复正常生理功能，促使黄疸消退和肝功能恢复。抗各种原因引起的肝内胆汁淤积病毒感染、妊娠和长期肠道外营养都有可能导致肝内胆汁淤积，甲硫氨酸通过生成牛磺酸与胆汁酸共价结合，增强酸溶解度，易于排除肝细胞外，同时通过肝细胞膜磷的甲基化，增强Na、K、-ATP酶活性促进胆汁外排。应用甲硫氨酸可以明显减少由胆汁淤积引起的皮肤瘙痒和肝功异常。
甲硫氨酸通过增加体内半胱氨酸和合成，增加谷胱苷肽和超氧歧化，其甲基作用使内源性合成增加，从而稳定了溶酶体膜，减少了酸性磷酸酶的释放，保护了心肌细胞线粒体免受损害，对克山病造成的心肌损害尤为有用。
抑郁症患者血液中甲硫氨酸浓度显著降低补充外源性甲硫氨酸对抑郁症有治疗作用。
甲硫氨酸通过转硫作用生成牛磺酸有明显的降压作用。
甲硫氨酸能预防和治疗有毒金属非金属对人体的伤害。甲硫氨酸利用其所带的甲基，在体内转化成，对有或药物进行甲基化而起到解毒的作用。因此，甲硫氨酸可用于防治慢性或急性肝炎、等肝脏疾病，也可用于缓解砷、、、苯、吡啶和等有害物质的。是预防和治疗重金属铅镉汞对造成损害的重要物质。它与进入人体内的毒性金属结合，变成可溶性的物质随胆汁排除体外，发挥了防毒和驱毒作用。人体肺部沾染SiO2粉尘后，组织释放氧自由基增加造成增加，造成肺脏进一步损害，甲硫氨酸转化成的半胱氨酸和谷胱苷肽可以阴断这一过程，保护肺部免受进一步损害。
在体内生物合成与代谢中发挥着重要的作用。甲硫氨酸是体内最重要的，很多含氮物质在生物合成时甲硫氨酸提供甲基如肌酸、松果素、肾上腺素、、肌碱、、甲基组胺、甲烟胺等。同样甲基化在蛋白质和的修饰加工方面也极为重要。
含蛋氨酸的食物不像其他营养素那么的多，其中含量最丰富的前几位食物有:、葵花子、乳制品、酵母、海藻类、叶类蔬菜等。该品与有，禽兽缺乏甲硫氨酸会引起发育不良、体重减轻、肝肾机能减弱、肌肉萎缩、皮毛变质等。甲硫氨酸是近几年热门的研究课题，已知它具有多种生理活性。甲硫能够增强TNFa产生和NK细胞活性。增强介素IL-1、IL-2、IL-6的表达。能够减轻肝细胞损伤对淋巴细胞增强的抑制，参与了调整月经周期，同时甲硫脑啡肽与以串联方式发挥中枢镇痛作用。
1. 终端饲料厂批量采购积极性相对较差，局部地区批量成交均以执行前期订单为主。由于在10月份国内多数终端饲料厂均作了批量采购，多数终端饲料厂的蛋氨酸库存可用至一个月之久，有的甚至可用2个月，因此其批量采购积极性均普遍不高，蛋氨酸成交积极性较差。国内局部地区的成交量较大的原因是多数终端饲料厂以执行前期订单为主，受此影响，国内局部蛋氨酸市场成交价格相对宽泛。2. 主流蛋氨酸供货商出货积极性强，货源充裕。据了解国内几大品牌的蛋氨酸供货商出货积极性较高，国内各地市场货源相对充足。在终端饲料厂的的批量采购积极性欠佳的大背景下，国内蛋氨酸价格逐步趋于趋弱，局部地区成交价格偏低。3.近两个月，国际原油价格走出了一波&过山车&式的行情。受到疲弱的经济数据和地缘紧张局势的交替影响，国际油价在10月上旬经历了暴跌后反弹、反弹后再次下跌的行情。纽约原油期货价格一周经历了两次4%以上的涨跌。进入10月中下旬，纽约油价一波&五连跌&的行情，让下调窗口再度面临开启。但就在10月25日，受到利好经济数据的推动，国际油价结束了连续多个交易日的下跌趋势，出现大幅度上涨。随后欧美天气的&变脸&导致取暖油需求增加，再度拉高国际油价，最终国内成品油调价窗口未能在10月份如期开启。11月份以来，第一周，国际油价先是连续三个交易日上涨，随后三个交易日大幅下跌，纽约和伦敦两地油价更是创下今年8月3日最低收盘价;国际油价再度迎来小幅反弹。国际油价的不确定性很难为蛋氨酸市场的走势提供强有力的指导作用。
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{{if list && list.length}}N-甲酰甲硫氨酸_百度百科
N-甲酰甲硫氨酸
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N-甲酰甲硫氨酸是一种化学物质，分子式是C6H11NO3S。
N-甲酰甲硫氨酸基本信息
N-甲酰甲硫氨酸结构简式
甲酰甲硫氨酸
N-甲酰（甲基）高半胱氨酸
：CSCCC(NC=O)C(O)=O
：224-322-8
：C6H11NO3S
：177.22 g/mol
N-甲酰甲硫氨酸简介
N-甲酰甲硫氨酸（：N-Formylmethionine，简写为：fMet）是一种存在于及相关的细胞器中的。它是的衍生物，其中一个甲酸基被加到原甲硫氨酸的上。他专门用于蛋白质合成的起始阶段，之后它可被移除。
N-甲酰甲硫氨酸在、和的中起到至关重要的角色。但它并不用于中的，真核细胞的细胞溶质中只有被翻译。它亦不被用于中。在人体中，N-甲酰甲硫氨酸会被免疫系统识别为外源性物质并刺激机体对抗潜在感染。
N-甲酰甲硫氨酸在蛋白质合成中的功能
N-甲酰甲硫氨酸是合成中的起始残基，因此它位于生长中的N-端。N-甲酰甲硫氨酸被一种特殊的转移RNA（tRNA.fMet）递交到（30S）-信使RNA复合体上，这种特殊的tRNA具有3'-UAC-5'可以结合到位于上的5'-AUG-3'起始上。
编码N-甲酰甲硫氨酸密码子与编码的相同，都是AUG。然而，AUG也是的起始。当这个密码子被用于起始阶段时，N-甲酰甲硫氨酸便代替，因此形成了新生链的第一个。当相同的在接下来的中出现时，核糖体便会使用正常的。许多有机体都会使用这一机制的变体形式。
将甲酰基接到甲硫氨酸的过程是由一种称为甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶的行使的。这一修饰过程在甲硫氨酰被接到tRNA.fMet上之后才发生。
请注意：甲硫氨酸既可被装载到tRNA.fMet上也可以被装载到tRNA.Met上。只有甲硫氨酸被加到tRNA.fMet而不是加到tRNA.Met上时，甲酰转移酶才会催化将甲酰基加到甲硫氨酸上。
这一甲硫氨酸会从大多数的蛋白质上被甲硫氨酸胺基肽酶（MAP）移除（发生在宿主和重组体中）。
N-甲酰甲硫氨酸与免疫的相关性
因为N-甲酰甲硫氨酸只存在于所合成的蛋白质中，而不存在于生产出的蛋白质中，故可以用以帮助识别异己。多形核细胞可以与以N-甲酰甲硫氨酸开头的蛋白相结合，并用其启动功能。
企业信用信息s腺苷甲硫氨酸试剂溶解方法
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09-04-09 &匿名提问
多胺通过改变DNA结构和调节信号传导等方式调节基因的表达，从而在细胞生长和分化过程中发挥着重要的作用。在肿瘤细胞和组织中多胺的含量和生物合成明显增高［1］。鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)是多胺生物合成途径中第一个限速酶，可催化L?鸟氨酸脱羧生成腐胺。S－腺苷甲硫氨酸脱羧酶（s?adenosylmethionine decarboxylase, AdoMetDC）是多胺合成的第二个限速酶。主要催化S?腺苷甲硫氨酸(s?adenosylmethionine, SAM)脱羧基形成脱羧的SAM(dcSAM)，为精脒和胺的合成提供丙氨基。虽然ODC一直是研究的焦点，但AdoMetDC活性在许多肿瘤中也明显升高。过表达AdoMetDC可以促使NIH3T3细胞的恶性转化，较ODC可能是更有力的转化诱导剂。抑制ODC和AdoMetDC的活性可以防治肿瘤的形成和转移［2］。因此ODC和AdoMetDC是肿瘤治疗的重要靶标。    为了探讨同时抑制ODC和AdoMetDC的表达，全面降低细胞内多胺的含量对肺癌的治疗作用,我们在已构建的ODC单反义腺病毒的基础上［1,3］,又构建了可以同时表达ODC和AdoMetDC 反义RNA双反义腺病毒载体。现通过研究其在体外对肺癌A?549细胞生长和侵袭的抑制作用，探讨其未来作为肺癌基因治疗方法的可能性。    1  材料与方法    1.1  材料    1.1.1  细胞株  A?549细胞购自中科院上海细胞所Ad?GFP, Ad?ODCas和Ad?ODC?AdoMetDCas由山东大学医学院分子生物学实验中心包装完成［2］。    1.1.2  主要试剂  DMEM、RPMI?1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT、ODC抗体购自Sigma公司。TUNEL试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。    1.2  方法    1.2.1  体外基因转染效率的检测  收集对数生长期A?549细胞，按3×105个/孔铺于六孔板中。培养24?h后，吸出细胞培养液加入500?μl Ad?GFP病毒孵育液，感染复数分别100、50、20、10、5和0，每组设3个复孔。37?℃孵育90?min。吸出病毒孵育液，加入完全培养基2?ml，放入细胞培养箱继续培养48?h。收集细胞前，用预冷的PBS清洗一遍细胞。加入消化液（0.25%胰酶＋0.02%EDTA）消化。1?000?r/min离心5?min，500?μl PBS+2%小牛血清重悬细胞。流式细胞仪计数GFP阳性细胞及细胞总数。未感染病毒的细胞（MOI=0）设为对照细胞。    基因转染效率＝GFP阳性细胞数(平均数)细胞总数(平均数)×100％    1.2.2  重组腺病毒Ad?ODC?AdoMetDCas感染效率的测定  将生长良好的A?549细胞经适当培养后，调至浓度为5×104个／ml，每孔100?μl接种于96孔培养板中。培养24?h后，分别被Ad?ODC?AdoMetDCas和Ad?GFP以100、50、25、10、1的MOI感染，每组6个复孔。作用后48?h，加入5?mg/ml的MTT溶液20?μl／孔，37?℃作用4?h后弃培养液，每孔加入DMSO150?μl，振荡10?min，酶标仪（BIO?RAD Model 680）测定570?nm处的吸光值。    1.2.3  细胞生长曲线  将对数生长期的A?549细胞按5×103个/孔接种96孔培养板，于37?℃、5%CO2培养箱中培养24?h后，将重组腺病毒Ad?ODC?AdoMetDCas与空病毒Ad?GFP分别以50、25的MOI感染A?549细胞，对照组为不含病毒的培养液，每个组设6个复孔。于处理后24、48、72和96?h，加入0.5％的MTT（5?mg/ml），每孔20?μl，孵育4?h，再加入二甲基亚砜150?μl溶解紫蓝色沉淀。酶标仪测定570?nm波长吸光值，绘制生长曲线。    1.2.4  ODC,AdoMetDC蛋白的表达  采用Western Blot检测。1×106 A?549细胞分别感染50?MOI的Ad?GFP、Ad?ODCas和Ad?ODC?AdoMetDCas 72?h后收集细胞。用裂解液抽提细胞总蛋白,裂解液组分：50?mmol/L Tris(pH8.0), NP?40(1%), aprotinin(1?μg/ml),十二烷基磺酸钠(0.1%), 叠氮钠(0.02%), 氯化钠(150?mmol/L), PMSF(100?μg/ml)。蛋白样品浓度采用BCA法测定,经SDS?PAGE（12％分离胶）电泳,电转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭2?h,一抗4?℃孵育过夜,加入HRP标记的二抗室温孵育2?h后,采用SuperSignal West Pico化学发光底物曝光显影。β肌动蛋白表达作为内参照。    1.2.5  细胞内多胺含量的测定  收集107个细胞，用冰冷的PBS冲洗2遍；1?000?r/min离心5?min收集细胞沉淀，过多的PBS用棉棒轻轻沾去；在细胞沉淀中加入0.5?ml 10％高氯酸，4?℃孵育30?min；12?000×g离心3?min，上清液可贮存于-20?℃。取丙酮溶解的丹酰氯200?μl，细胞上清液200?μl，已二胺50?μl和饱和Na2CO3 50?μl混匀；50?℃水浴30?min；加样分析。流动相A为甲醇，B为重蒸水。开始时AB两液以8∶2混合入柱，10?min内A液上升至100％，B液降为0。维持15?min。流速1?ml/min。荧光激发波长370?nm，发射波长506?nm。纸速3?mm/min,柱温40?℃。    1.2.6  TUNEL标记检测法检测细胞凋亡  腺病毒Ad?ODC?AdoMetDCas、 Ad?ODCas和Ad?GFP分别以50?MOI感染A?549细胞。将约5×107个/ml的细胞于4%中性甲醛溶液温室中固定10?min,在载玻片上滴加100?μl细胞悬液并使之干燥。PBS洗片，与0.3% H2O2甲醇溶液室温孵育30?min。PBS洗片，与通透液(0.1%TritonRX?100溶于0.1%枸橼酸钠溶液中)在冰浴中孵育2?min。PBS冲洗后擦干，滴加50?μl TUNEL反应混合溶液，湿盒中37?℃孵育60?min。加入50?μl转化剂POD，湿盒中37?℃孵育30?min。PBS冲洗，加入100?μl DAB底物溶液，室温孵育10?min。封片，在光镜下分析结果。    1.3  统计学处理  数据统计为±s，采用SPSS Version12.0软件对数据进行成组t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。    2  结  果    2.1  体外基因转染效率的测定结果  本实验采用不同MOI的Ad?GFP感染A?549细胞,用来检测腺病毒介导的基因转染效率。结果显示，50?MOI的Ad?GFP 感染细胞后，75% A?549细胞呈现GFP阳性,而且没有明显的细胞毒性（图1）。所以本试验的感染复数确定为50。    2.2  重组腺病毒Ad?ODC?AdoMetDCas抑制肺癌细胞的生长  重组腺病毒Ad?ODC?AdoMetDCas对肺癌细胞A?549有剂量依赖性的抑制作用(图2)，根据实验结果挑选A?549细胞的感染滴度为50MOI（Mutiple of Infection, 感染复数）。正常情况下A?549细胞生长迅速，而感染Ad?ODC?AdoMetDCas后细胞生长明显减慢，细胞生长曲线更趋低平（图3），最大生长抑制率可达70%，而无明显细胞毒性。    A?549细胞感染不同滴度的Ad?ODC?AdoMetDCas和Ad?GFP对细胞的影响    Fig.2  Effect of different tite Ad?ODC?AdoMetDCas and Ad?GFP on cell proliferation of A?549 cells    A?549细胞感染不同病毒后的细胞生长曲线    Fig.3  Effect of different virus on proliferation of A?549 cells    2.3  腺病毒对ODC和AdoMetDC表达的影响  见图4。由图4可见，Ad?ODCas处理组ODC蛋白表达明显降低, AdoMetDC没有明显变化。而Ad?ODC?AdoMetDCas处理组中ODC和AdoMetDC表达在两种细胞中都受到了明显抑制。    2.4  腺病毒对细胞内多胺含量的影响  见表1。由表1可见，单独孵育Ad?ODCas 72?h后,A?549细胞中腐胺和精脒含量明显降低,尤以腐胺含量降低最为显著(P＜0.05),精胺也有下降,但无统计学意义(P＞0.05)。而在Ad?ODC?AdoMetDCas处理的2种细胞中,三种多胺的含量均有明显的减少。较Ad?ODCas处理组,精脒和精胺的降低也同样具有统计学意义（P＜0.05）。    2.5  TUNEL标记检测结果  见图5。由图5可见，Ad?ODC?AdoMetDCas作用后，A?549细胞出现较明显的凋亡，而加入空病毒组和未加病毒组不明显。    3  讨  论    基因治疗已是癌症治疗的研究热点，随着分子技术的不断提高，针对特意靶分子的反义基因治疗在癌症治疗中显示了良好的前景。利用ODC，AdoMetDC及多胺新陈代谢的调节为靶标进行肿瘤的治疗正成为近期的研究热点。作为多胺合成的两个关键酶ODC和AdoMetDC，主要受到多胺浓度的正负反馈调节。高浓度的多胺会抑制ODC和AdoMetDC的活性，而低浓度的多胺则会促进它们的活性，而两者之间也存在着制约和互补的关系。单独抑制ODC虽然会导致腐胺和精脒的含量降低，但精胺的含量却升高。其原因主要是抑制ODC可导致AdoMetDC活性升高，从而使精胺含量升高。同样，抑制AdoMetDC也能导致ODC活性和腐胺含量升高。因此要使三种多胺含量都降低，就必须同时抑制ODC和AdoMetDC活性。这也正是我们选择双反义腺病毒的原因之一。    我们研究结果表明，利用反义技术可以抑制肺癌细胞中ODC和AdoMetDC的活性。本实验通过Western Bolt检测表明，Ad?ODC?AdoMetDCas可明显降低A?549细胞中ODC和AdoMetDC蛋白的表达量。与对照组相比，Ad?ODC?AdoMetDCas可显著抑制A?549细胞的生长。国外许多研究已证明［4，5］，抑制ODC蛋白的活性和表达量，可减缓肿瘤细胞的生长。最近对多胺类似物的研究表明［6］，多胺类似物取代多胺能达到抑制细胞增殖的目的。Choi等［7］研究发现，ODC的主要调控者抗酶(Az)的抑制剂(AzI)在肺癌A?549细胞中高表达，通过减少AzI的表达，增加抗酶的活性，可抑制ODC,减少多胺的生成。Wallon等［8］实验证明，细胞内多胺的水平调控着机体对致癌物质的感应性。在许多肿瘤中抑制ODC和AdoMetDC可明显的抑制肿瘤生长，如前列腺癌、乳腺癌、大肠癌和胰腺癌等［9?12］。这些结果表明，抑制ODC和AdoMetDC可取得明显的肿瘤抑制效果，ODC和AdoMetDC可作为有前景的肿瘤反义基因治疗的靶基因。    尽管细胞内多胺含量是由合成、代谢、吸收和排出多个过程控制,但癌细胞中多胺含量的增多主要与ODC和AdoMetDC的活性升高有关。有研究表明［13］，前列腺癌、乳腺癌和大肠癌中ODC和AdoMetDC的活性升高，并且与癌症的复发关系密切［14］。我们最近研究表明［1,3］，ODC单反义腺病毒可以抑制ODC活性从而抑制肺癌的生长，但该病毒并没有抑制另一个多胺合成关键酶AdoMetDC的活性。该酶在肿瘤细胞中同样表达升高，因此我们推理，同时抑制ODC和AdoMetDC可能对肿瘤治疗更为有效。我们的体外实验已证明，在抑制ODC的基础上抑制AdoMetDC比单独抑制ODC具有更好的抗肺癌效果。感染Ad?ODC?AdoMetDCas的 A?549细胞中ODC和AdoMetDC表达量分别降低了50％和70％之多。三种多胺的含量也都明显降低。相反，Ad?ODCas只抑制了腐胺和精脒的含量，而精胺的含量与对照细胞相比并未有实质性的改变，这可能与Ad?ODCas只抑制ODC而不抑制AdoMetDC的表达有关。    为探讨ODC和AdoMetDC反义RNA抑制肿瘤作用的机制，本实验采用TUNEL标记检测法观察Ad?ODC?AdoMetDCas对细胞凋亡的影响。与对照组细胞相比，Ad?ODC?AdoMetDCas感染的细胞出现明显的凋亡。据报道［15］，在活性氧分子刺激后，细胞多胺水平的缓慢降低可导致其凋亡；而ODC过表达引起腐胺的增多，也可诱发凋亡。多胺的大量聚集或极度衰减可破坏细胞的许多功能，从而导致细胞凋亡［15］。因此，我们认为，诱导细胞凋亡是ODC和AdoMetDC反义RNA抑制肿瘤生长的机制之一。    总之，本研究结果表明，以ODC和AdoMetDC为靶标的反义腺病毒载体可以降低肺癌细胞内多胺含量，能减少ODC和AdoMetDC基因的表达,抑制肺癌细胞的体外生长和增殖, 并诱导细胞凋亡。因此采用基因治疗同时抑制ODC和AdoMetDC可能成为一种治疗肺癌的新方法。
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