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人类基因组DNA 的PCR扩增方法
人类基因组DNA 的PCR扩增方法与质粒的PCR扩增之间有何差异？由于人类基因组很大，不知扩增时是否有特殊要求，谢谢
08-09-18 &匿名提问 发布
从人类基因组DNA中扩增某基因，对于PCR体系及程序的要求比较高。首先，该基因组DNA模板的纯度要高。因为基因组DNA长度长，容易断裂，所以提取的时候要非常注意，避免猛烈震荡。其次引物的设计要求也高，两条引物的退火温度要合适，尽量都在55度左右，尽量减少dimer。而PCR体系中使用的酶要求活性较好，用量要适量，并不是越多越好。如果你的目的基因小于2KB，那么扩增不会非常困难的，否则建议使用巢式PCR扩增，即在目的基因前后位置的地方再设计一对引物，先用这对引物扩增，再利用产物为模板进行第二次扩增。PCR程序的设置上，可以用降落PCR方法（touchdown&PCR），先用较高的温度进行第一轮扩增，减少非特异性扩增，然后每一轮降0.5度或者1度，直到降到你认为合适的温度再继续完成。有时候当你要获取一个基因的克隆的时候，PCR这一步会花掉大量的精力。现在有很多公司都可以代做基因克隆的构建服务。可以大大缩短实验周期。我们百替生物提供各种分子生物学，细胞生物学，动物实验服务。有需要的话可以来公司网站上看看。
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我在做PCR扩增时会出现电泳所得条带很模糊的情况，排查了引物、酶和MIX都没有问题 ，哪个大侠知道是什么原因造成& 怎么解决？
问题补充:(补充时间: 16:37)
我没有使用Marker,而是用的阳性对照和阴性对照，结果阳性对照有条带，阴性对照无条带，但就是很模糊。
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秀友回答 (5)
拿产物在去P一次跑胶，要是条带很亮说明电泳实验本身没有问题，要是还是很模糊说明pcr有问题或者PCR和胶都有问题，胶有没有问题观察MARKER就知道了，
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我之前也遇到过类似的问题，我的解决方法是进行巢式PCR，设两对引物，一对大的一对小的，小引物扩增的片段包含在大引物扩增片段之内，先用大引物扩，之后用稀释的PCR产物为模板用小引物扩，这样就能得到清晰地条带了，不知对你是不适应。
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回答者： 一级 一星助者
有没有图啊？你的marker清晰吗？不会是仪器焦距的问题吧？
还有请问二楼的说的大引物扩增后PCR产物稀释，稀释多少倍呢？根据什么呢？
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回答者： 一级 一星助者
最好贴个图上来啊
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回答者： 一级 一星助者
同一块胶上阳性对照跑出带就说明不是胶的问题
引物、酶和MIX都没有问题就说明是你DNA的问题了，纯度不够，或发生降解都可能造成条带不清晰或涂带
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小弟最近在跑定量PCR标准曲线，现在内标的还没跑好。遇到的问题是扩增效率老是在80以下（溶解曲线和R2值都很好）。试过下调退火温度，从60度下调1度后没效果又调到57度也是没反应，扩增效率反而更低了。产物大小是163bp。哪位大侠知道这是怎么回事？这个问题困扰我很久，引物和内标基因种类都换过了，都有这个问题。小弟求解。。。不胜感激。。&
PS:引物浓度也调过的，没效果
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秀友回答 (2)
我也曾经遇到过这种问题，当时一开始怀疑RNA浓度不够，将浓度提高5倍扩增效率没有明显的升高，然而将浓度提高2倍，并将退火温度升至64℃时，得到了较好的结果，请参考。
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循环数之间差值大概是几啊，一般在三左右差不多，不过建议是试试宝生物的专门稀释梯度的Easy solution，之前我也是扩增效率低，用那个之后立马见效，你试试看哦
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回答者： 一级 一星助者
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生物秀旗下 [Website]一个关于PCR扩增的简单问题(特异性引物,简并引物,序列测定,序列分析)
02:51:40&&&来源：&&&评论：&&
[一个关于PCR扩增的简单问题(特异性引物,简并引物,序列测定,序列分析)] 请问各位老师:
我正在做一个基因的克隆表达,已经完成克隆,扩增的时候用的是简并引物,进行序列测定以后,经过序列分析重新设计了特异性引物扩增其完整序列.
我想请问一下各位老师的是:特异性扩增时扩增条件是不是应该一样呢?(例如退火温度等)另外,特异性引物扩增是不是应该一条DNA带呢?我的扩增怎么用原来一样的条件扩不出来呀?怎么也不是一条带.我可不可以用胶回收、纯化后直接进行与载体进行连接、 关键词:[特异性引物 序列测定 序列分析 简并引物 克隆表达 基因 克隆]…
请问各位老师:
我正在做一个基因的克隆表达,已经完成克隆,扩增的时候用的是简并引物,进行序列测定以后,经过序列分析重新设计了特异性引物扩增其完整序列.
我想请问一下各位老师的是:特异性扩增时扩增条件是不是应该一样呢?(例如退火温度等)另外,特异性引物扩增是不是应该一条DNA带呢?我的扩增怎么用原来一样的条件扩不出来呀?怎么也不是一条带.我可不可以用胶回收、纯化后直接进行与载体进行连接、转化呀？
回复这位同学,不知你简并引物的扩增的目的条带,是怎样拿去测序的?直接把条带纯化后测序还是连入T-Vector后测序的呢?一般我们都是把目的条带连入T-Vector后挑单克隆保种后拿去测序,这样在测序过后,设计特异引物,直接从连入目的片段的T-Vector上扩增即可.条件的控制兜不用很严格,就可以扩出来.回复仔细看了两遍，大体明白了你的意思：你是先用兼并引物得到了所要的基因（估计应该是回收的优先扩增的特异条带去测序），根据测序结果又设计了特异性引物进行扩增，结果没有得到想象中的单一特异性条带。针对你的问题，我的看法是：1.特异性扩增时扩增条件没必要和兼并引物时一样，尤其是退火温度：因为我们都知道兼并引物的TM值是很难确定的，一般都需要做降落PCR，变动的温度范围相对比较大；而特异性引物的TM值是已知的，有时直接用引物合成报告单上给的TM值就可以得到非常特异的扩增条带，即使不特异，在给定的TM值上下很小的范围内稍微调整，也可以得到比较理想的条带。2.既然是特异性引物，严格来说，扩增后就应该得到单一的特异性条带，你只所以没有得到，很大原因就是因为PCR的TM值你没有选择好，这时的TM值和兼并引物时的应该有差别的，它应该范围更小、更特异、要求更高。如果你有梯度，作一个梯度PCR一般就可以摸索到理想的TM值。当然了，如果已经有了优势扩增的特异性条带，尽管有些非特异性杂带，但不影响整体的结果，你完全可以采取和兼并引物扩增回收一样的方法，直接用胶回收、连接去测序；如果你想要一个好的电泳图可以用回收的样品跑一个（样品充足的话），也可以再用特异性引物做一个菌落PCR，那个条带单一而且很亮（我经常这样做，呵呵）回复谢谢各位老师!我真是收益非浅!我打算用胶回收然后纯化的方法进行连接、转化，摸索条件太麻烦了，我主要是想要和表达载体连接后进行表达，所以是不是不用非得一条带呀？回复没必要非得单一的条带，回收纯化的单一、特异性条带可以和表达载体连接后进行表达
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【求助/交流】荧光PCR扩增曲线问题
我的一对引物探针，高浓度的扩增没有问题，而低浓度却扩增不好，荧光信号很低，为什么？图中那两条扩增曲线是模板浓度十倍稀释的！请大家帮我看看哦！
做了几个复孔啊， 第二条明显不对啊 Originally posted by silicare at
做了几个复孔啊， 第二条明显不对啊 做了很多重复，这对引物探针就是这样，高浓度的模板扩增挺好，就是低浓度的模板突然不呈梯度的荧光信号突然下降的厉害，体系优化似乎也优化不出来 最好还是多些数据，两条线不太好分析啊 Originally posted by silicare at
最好还是多些数据，两条线不太好分析啊
什么机子什么染料（探针标记染料）啊，荧光值现实好高啊
浓度低了的时候，ct值超过30的时候都容易出现这种情况
不知你这事rn还是delta rn
貌似ct值还比较正常，你换成半对数图看看吧，那样应该更直观好看一些 Originally posted by silicare at
什么机子什么染料（探针标记染料）啊，荧光值现实好高啊
浓度低了的时候，ct值超过30的时候都容易出现这种情况
不知你这事rn还是delta rn
貌似ct值还比较正常，你换成半对数图看看吧，那样应该更直观好看 ... ABI7500的，染料是FAM，荧光值和模板浓度一般也是会呈现梯度下降的，这个下降的太多了，所以图形很难看，我想知道或者想讨论的是，什么因素导致低浓度的扩增效率不高，我想可能是我的引物本身的问题，那么能否改变什么条件能改善呢？ Originally posted by love_st at
ABI7500的，染料是FAM，荧光值和模板浓度一般也是会呈现梯度下降的，这个下降的太多了，所以图形很难看，我想知道或者想讨论的是，什么因素导致低浓度的扩增效率不高，我想可能是我的引物本身的问题，那么能否改 ... 低浓度模板扩增效率问题是一个普遍的现象，和引物质量有直接关系
1，不管有没有扩增出目的片段，只要里边有模板，从第一个循环开始就会消耗引物，而且模板越多越复杂，消耗就越大，基因组远大于质粒的消耗。这样30个循环下来就消耗了大量的引物，越往后效率越低是难免的
2，引物的初始浓度也不能太高了，太高了就会增加非特异性和二聚体等杂带
3，如果引物本身的质量不是特别好，经过30轮的折腾，里边难免会形成一些引物自身的二级结构导致引物序列的改变（taq酶是很厉害的，只要有一点点的机会，他也能给你往上添加碱基。这个你应该可以理解）
所以，以上三点不难看出，为什么大家都知道低浓度模板扩增效果差，却无法解决了
貌似你的问题如果想彻底解决，推荐换一对更好的引物。
不过半对数的图也行会更好
个人观点:D 很可能是试剂与一起不匹配，重新优化下反应液吧 试剂与仪器不匹配，优化下反应液吧 我也遇到同样的问题，我们实验室的师姐建议我换一种酶试试，可我哪知道换什么酶效果好啊？ : Originally posted by 大甫哥 at
我也遇到同样的问题，我们实验室的师姐建议我换一种酶试试，可我哪知道换什么酶效果好啊？ 好点的热启动酶，不过这个问题我已经解决，换了个引物 : Originally posted by love_st at
好点的热启动酶，不过这个问题我已经解决，换了个引物... 我的是标准品质粒，浓度高时无引物二聚体，但当降到10^4拷贝就出现引物二聚体了，查询网上说的有加二甲亚砜的，有说优化体系的，还有的说引物二聚体基本难以避免换引物。
& && &优化体系你是用正交设计吗？还是固定其他条件，只变其中一个？ 我用的是taqman探针法， : Originally posted by 大甫哥 at
我用的是taqman探针法， 探针法你怎么知道有引物二聚体？ : Originally posted by love_st at
探针法你怎么知道有引物二聚体？... 扩增结果跑了个胶，发现低浓度的样品孔均有大小相同的条带， : Originally posted by 大甫哥 at
扩增结果跑了个胶，发现低浓度的样品孔均有大小相同的条带，... 只要荧光PCR影响不大就OK，如果你也像我上面的情况，建议你更换引物
var cpro_id = 'u1216994';
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