继续请问，载体构建步骤克隆时，fs 是什么意思

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-08-14 17:38 标签： 同源重组载体构建
T载体的作用是什么?克隆时为什么要用T载体?
轰轰yeah0452
T载体又叫T质粒载体,是指T4噬菌体DNA连接酶,作用是在有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接.DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶.两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来.T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后,酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来.连接反应通常将两个不同大小的片断相连.形象的说,DNA水解酶相当于剪刀,剪断DNA,而T载体（DNA连接酶）就相当于针线.如果克隆时不用,就不能将DNA连接起来.
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我做过几个克隆，没用过T载体，直接将酶切后纯化的产物进行连接，照样可以连接成功，基本上都会有10-50个克隆长出来。我用的是Sal I和Nde I这两个酶切位点，似乎这两个都是平端的哦。
扫描下载二维码基因表达载体构建步骤
你的问题真的不知如何回答.超表达载体的构建：设计引物加接头,扩增目的基因,连接到T载体上测序.正确无误,切下来,酶切载体质粒与目的基因连接,阳性克隆鉴定,测序无误后构建完毕
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扫描下载二维码为什么要先构建克隆载体再用表达载体
WOW￠噜啦m褪
构建克隆载体是大量扩增DNA片段,用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作,构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质.为什么要先构建克隆载体,再用表达载体,我猜是因为：①得到大量的DNA,虽然PCR也可以,但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR,而且每次都要重新提DNA和RNA才行,而且,PCR反应的试剂盒又不便宜,用PCR来制备大量DNA有点得不偿失.尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR）,成功率不是极高,而且还要筛选,但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌,你就可以保存了,你想什么时候用,摇个菌,就可以制备到大量的DNA.②测序需要.你想转表达,你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的,不要以为你设计了个特异性引物,然后跟你mark的长度就可以确定了,这也只是推测,在科学上不严谨.扩增出的基因片段保险起见或者经费允许,要拿去测序,而一般送测的序列都是构建到载体上的序列,克隆载体上一般也都带有测序引物,已确定这就是你要的那条序列.你要写论文必须要给人真凭实据.
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这样才能选取合适的克隆载体，提高克隆效率，增大表达量，从而高效的得到所需的表达产物。
不是可以用PCR扩增吗？
扩增需要有合适的引物和目的基因。没有合适的目的基因，扩增效率也很差。根本P不出条带。
先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信...
你最早的目的基因、质粒什么的都是拿去公司合成的，很少量，所以要先克隆，把它变多，再做实验，去表达
扫描下载二维码君，已阅读到文档的结尾了呢~~
) 线粒体中的 ; )67!, 为 采用 /; 载体克隆其他目的基因扩增片断提供了经 验, 也为细胞穿透肽介导的 )67! 转导提供了一对 照载体....
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克隆载体构建
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