考点：有机物的结构和性质
专题：有机物的化学性质及推断
分析：有机物含有酚羟基，可发生取代、氧化和显色反应，含有碳碳双键，可发生加成、加聚和氧化反应，含有羟基，可发生取代、消去和氧化反应，含有羧基，具有酸性，可发生中和、酯化反应，含有酯基，可发生水解反应，以此解答该题．
解：A．分子中含有羟基、酯基、羧基和碳碳双键，含有苯环，芳香族化合物，分子有4种官能团，故A正确；B．分子中含有羧基，可与Na2CO3、NaHCO3反应，含有酚羟基，可与FeCl3溶液反应，故B正确；C．能与氢氧化钠反应的官能团为酚羟基，酯基和羧基，则0.1mol绿原酸最多与0.4mol NaOH反应，故C错误；D．含有碳碳双键，具有还原性，可发生加成反应，含有羟基，可发生取代、消去反应，故D正确．故选C．
点评：本题考查有机物的结构和性质，是高考中的常见题型和重要的考点之一，属于中等难度的试题，意在考查学生对官能团与物质性质的关系及常见的有机反应类型的判断能力，注意把握有机物的结构特点以及同分异构体的判断．
请在这里输入关键词：
科目：高中化学
（1）已知Fe（OH）3能与次氯酸盐发生如下反应（未配平）：Fe（OH）3+ClO-+OH-→FeO4n-+Cl-+H2O①已知有10.7g&Fe（OH）3参加反应，共转移了0.3NA个电子，则n=，FeO4n-中铁元素的化合价为．②根据所学的知识，推测FeO4-能和下列（填序号）物质反应．A．KMnO4　　　　　B．SO2　　　　　C．H2S　　　　　D．O2（2）一定条件下，向含硝酸的废水中加入CH3OH，将HNO3还原成N2．若该反应消耗32g&CH3OH，转移6mol电子，则参加反应的还原剂和氧化剂的物质的量之比是．
科目：高中化学
A、B、C、D均为中学所学的常见物质且均含有同一种元素，它们之间的转化关系如图所示（反应条件及其他物质已经略去）：（1）若A为淡黄色固体，D为强酸，则D为（填写化学式）．写出B→C转化的化学方程式（2）若A的水溶液能使湿润的红色石蕊试纸变蓝，D的稀溶液能使蓝色的湿润石蕊试纸变红．则A为，写出A→B转化的化学方程式：．
科目：高中化学
写出下列有机物的名称：（1）（2）CH2=C（CH3）2（3）（CH3）2CBrCH2Br（4）．
科目：高中化学
I、苯炔（）与蒽（）反应生成如图所示化合物X（立体对称图形），请用字母符号填空．（1）蒽与X都属于．a．环烷烃&&&&&&&&b．烷烃&&&&&&&&&&&&&c．不饱和烃．（2）苯炔的分子式为，苯炔不具有的性质是．a．能溶于水&&&&&&b．能发生氧化反应&&&&&&&c．能发生加成反应（3）能证明苯中的化学键不是单双键交替排列的事实是．a．苯是平面六边形结构b．苯的邻位二元取代物只有一种c．苯的核磁共振氢谱只有一个吸收峰（4）下列属于苯的同系物的是．（5）能起加成反应，也能起取代反应，同时能使溴水因反应褪色，也能使酸性高锰酸钾溶液褪色的是Ⅱ、科学家常采用将药物连接在高分子载体上，制成缓释长效药物．已知某种解热镇痛类药物的结构简式为A，把它连接到高分子聚合物B上，形成缓释长效药物C．A：&&C：①HO-CH2-CH2-OH的名称为．②高分子聚合物B的单体的结构简式为．③A与B反应生成C的反应类型是．④在酸性条件下，A可水解成CH3COOH和（填结构简式）．
科目：高中化学
下表是部分短周期元素的原子半径及主要化合价，根据表中信息，判断以下叙述正确的是（　　）
原子半径/nm
主要化合价
A、L2+与R2-的核外电子数相等B、M与T形成的化合物既能与强酸反应又能与强碱反应C、氢化物的稳定性为H2T＜H2RD、单质与浓度相等的稀盐酸反应的速率为Q＞L
科目：高中化学
下列物质的类别与所含官能团都正确的是（　　）
A、酚类-OHB、羧酸-COOHC、醛类-CHOD、CH3-O-CH3醇
科目：高中化学
下列哪一项试剂在两个实验中作用相同（　　）
A、酒精在“观察植物细胞有丝分裂”和“检测生物组织的脂肪”中的作用B、硫酸铜在“检测生物组织中的还原糖”和“检测生物组织的蛋白质”中的作用C、盐酸在“观察植物细胞有丝分裂”和“低温诱导植物染色体数目的变化”中的作用D、蒸馏水在“提取纯净的动物细胞膜”和“探究生长素类似物促进插条生根的最适浓度”中的作用
科目：高中化学
分子式为C5H12O的饱和一元醇的同分异构体中，其中能被催化氧化成酮的数目是（　　）
A、2B、3C、4D、5
精英家教网新版app上线啦！用app只需扫描书本条形码就能找到作业，家长给孩子检查作业更省心，同学们作业对答案更方便，扫描上方二维码立刻安装！谈抗衰老与SOD清除氧自由基的利弊--《生物学通报》1998年10期
谈抗衰老与SOD清除氧自由基的利弊
【摘要】：人为什么会衰老？其原因和说法很多，有遗传与环境论、免疫机能低下论、内分泌功能减退论、胶原蛋白聚积论、蛋白质变性论，最早还有有机体大肠中毒和代谢中毒论及细胞组织伤害论等。近年由哈曼（Ｄ．Ｈｏｒｍａｎ）提出的氧自由基过多使人衰老的理论盛行，因而清除氧自由...
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R977.9【正文快照】：
人为什么会衰老？其原因和说法很多，有遗传与环境论、免疫机能低下论、内分泌功能减退论、胶原蛋白聚积论、蛋白质变性论，最早还有有机体大肠中毒和代谢中毒论及细胞组织伤害论等。近年由哈曼（Ｄ．Ｈｏｒｍａｎ）提出的氧自由基过多使人衰老的理论盛行，因而清除氧自由基
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式，仅支持PDF格式
【引证文献】
中国期刊全文数据库
秦达明;[J];江西教育学院学报;2000年03期
杨卫健,张双全;[J];淮阴师范学院学报(自然科学版);2002年04期
谢文海,甘耀坤;[J];玉林师范学院学报;1999年03期
【同被引文献】
中国期刊全文数据库
李文魁，罗崇念，林新，肖培根;[J];中药药理与临床;1995年03期
李荣,李俊;[J];安徽医药;2005年07期
李荣芷;何云庆;;[J];北京大学学报(医学版);1991年06期
申慧亭,王跃丰;[J];光明中医;2005年03期
易蔚,陈大舜,袁力,喻嵘;[J];湖南中医学院学报;2004年04期
董剑英,杨静,赵春芝,单俊杰,王宏军;[J];军事医学科学院院刊;2005年05期
薛明,冯怡,徐德生;[J];江苏中医药;2005年05期
李晔;籍保平;郑杰;李博;张晓峰;;[J];食品科学;2006年06期
张德华;;[J];生物学杂志;2006年03期
赵梅英;[J];陕西中医;2005年06期
中国硕士学位论文全文数据库
李磊;[D];浙江大学;2008年
崔英俊;[D];东北农业大学;2003年
冯雅琪;[D];河北农业大学;2005年
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库
申煜,魏建民,常弘;[J];动物学杂志;2004年05期
高红明;吴晓霞;张彪;张毅;徐平;孙国荣;;[J];植物研究;2006年03期
吕琳,何聪芬,刘家熙,董银卯;[J];中国农学通报;2004年06期
中国博士学位论文全文数据库
吴景东;[D];辽宁中医药大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库
产祝龙;[D];安徽农业大学;2003年
王慧;[D];浙江大学;2005年
欧成坤;[D];江南大学;2005年
武补兰;[D];山西大学;2005年
彭少华;[D];苏州大学;2005年
弓素梅;[D];河北农业大学;2006年
张利;[D];内蒙古农业大学;2006年
裴轶琨;[D];吉林大学;2006年
孙婷婷;[D];山东大学;2006年
陆俊;[D];中南林业科技大学;2006年
【相似文献】
中国期刊全文数据库
李秉功;[J];山东医药;1994年05期
依秋;[J];医药与保健;1997年05期
徐远祥;[J];华西药学杂志;1994年02期
邹宪,刘庆伟,曹菁,左思恒,戴唐明;[J];医学临床研究;1988年06期
许士凯,李广俊;[J];现代中西医结合杂志;2005年18期
姚文兵,高向东,周慧萍,陈琼华;[J];中国药科大学学报;1991年03期
平成斌;;[J];医药导报;1991年02期
麦国荣;[J];中华养生保健;2002年03期
贺振泉;[J];中国保健营养;2005年02期
;[J];发明与创新(综合科技);2010年11期
中国重要会议论文全文数据库
冀清发;孙彪;李忠鹏;;[A];第六届全国SOD学术研讨会论文集[C];2009年
王建平;;[A];浙江省药剂学术会议论文集[C];2006年
郭瑛;;[A];2008年中国中西医结合医学美容学术研讨会论文集[C];2008年
崔旭;左萍萍;杨楠;;[A];生物膜与重大疾病学术研讨会论文集[C];2004年
张明霞;李效忠;杲海霞;;[A];全国中医药科研与教学改革研讨会论文集[C];2004年
巫冠中;张文平;吕正兵;刘国卿;;[A];浙江省生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2005年
吴艳;李春英;贾旭峰;何颖;;[A];中国药理学会第十一次全国学术会议专刊[C];2011年
张松彪;周汝明;钟海玉;;[A];第七届全国老年医学学术会议暨海内外华人老年医学学术会议论文汇编[C];2004年
姚滢;魏江洲;王俊;张建鹏;冯伟华;焦炳华;;[A];第八届全国复合糖生物化学与分子生物学学术会议论文摘要论文集[C];2004年
李玉中;;[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
中国重要报纸全文数据库
夏冰冰;[N];医药导报;2007年
鹿坊;[N];中国医药报;2009年
陈朴林;[N];大众卫生报;2007年
陈朴林;[N];大众卫生报;2007年
实习生 雷柳倩;[N];科技日报;2007年
邬时民;[N];大众卫生报;2001年
江一舟;[N];健康时报;2007年
吕斌;[N];大众卫生报;2005年
美国北达科他大学医学院
张晓;[N];健康报;2002年
张晓;[N];科技日报;2002年
中国硕士学位论文全文数据库
董疑;[D];福建医科大学;2007年
谢玉慧;[D];新疆医科大学;2007年
高瑞;[D];苏州大学;2009年
张舸;[D];浙江大学;2006年
王媛;[D];吉林大学;2008年
王仁忠;[D];重庆医科大学;2007年
王建军;[D];天津医科大学;2008年
师军;[D];四川大学;2006年
杨丽;[D];大连医科大学;2007年
谢永伟;[D];福建医科大学;2007年
&快捷付款方式
&订购知网充值卡
400-819-9993
《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司
同方知网数字出版技术股份有限公司
地址：北京清华大学 84-48信箱 知识超市公司
出版物经营许可证 新出发京批字第直0595号
订购热线：400-819-82499
服务热线：010--
在线咨询：
传真：010-
京公网安备75号137442 人聚集在这个小组
(张张张张张zZ)
(來一碗.喵醬)
第三方登录：连翘提取物在制备具有抗uva辐射和抗衰老功效的保健食品或化妆品中的应用的制作方法
连翘提取物在制备具有抗uva辐射和抗衰老功效的保健食品或化妆品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了连翘提取物在制备具有抗辐射和抗衰老功效的保健食品或化妆品中的应用，本发明中的连翘提取物具有抗UVA辐射作用，能显著降低UV辐射引起的细胞损伤，同时对巨噬细胞炎症因子表达具有明显的抑制作用，可发挥抗炎抗衰老作用；本发明还从细胞和分子水平阐明了连翘提取物具有抗UV辐射和抗衰老作用。另外，本发明还公开了上述具有抗辐射和抗衰老功效的连翘提取物的一种优选的制备方法。
【专利说明】连翘提取物在制备具有抗UVA辐射和抗衰老功效的保健食品或化妆品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于连翘【技术领域】，具体涉及连翘提取物在制备具有抗UVA辐射和抗衰老功效的保健食品或化妆品中的应用。
[0002]近年来，来源于植物的活性成分已越来越多的用于以药物、治疗和美容等为目的的组合物仲。
[0003]衰老是一种生理性现象，生理上表现就是各器官的功能衰退，导致各种老化疾病的产生。而最直观的证据即皮肤的老化。在分子水平表现为细胞的衰老，这是与机体老化相伴的一个渐进的事件。衰老不但导致机体的生理功能退化，机体的免疫体统也在逐渐退化。在人体衰老过程中不但由于自身的生理和免疫系统的原因，还有很多外因也会加速衰老，其中紫外的辐射就是引起衰老最为常见的原因，并且由于老化引起的慢性炎症也是免疫系统退化的一个表征。
[0004]紫外线照射是导致皮肤衰老最主要的环境因素，紫外线照射使皮肤组织内产生大量氧自由基，使组织抗氧化防御体系能力减弱，最终导致皮肤衰老。自由基极易侵害细胞膜中的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，形成过氧化脂质，脂质过氧化物的降解产物丙二醛(MDA)与氨基酸，核酸，蛋白质和磷脂等和游离氨基反应形成脂自由基，它广泛地参与机体的生理与病理过程。在正常生理状态下，体内氧自由基不易发生蓄积和过氧化损伤，其中SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，当机体长期受紫外线辐射，体内超氧阴离子自由基的产生与清除便失去平衡，氧自由基产生过多时，会对机体产生毒害作用。并且紫外线的辐射还可以引起DNA的损伤。
[0005]衰老或老化是机体代谢过程中的一个必然阶段，主要表现为机体对环境的适应能力减弱以至丧失。衰老的机制颇为复杂，涉及到机体的各个系统的结构与功能的改变，有关老化的假说颇多。主要包括神经内分泌学说，自由基学说，免疫学说，体细胞突变学说，应激学说等。随着近现代免疫学的发展，人们开始认识到衰老和老年性疾病在许多方面与免疫功能的改变有密切关系。认为免疫系统与体内大多数器官和细胞保持持续接触，它的改变势必影响这些器官和组织细胞。随着年龄的增长，免疫机能减退，由此诱发出一些严重影响组织器官的疾病，加剧了机体各系统的衰老过程。阻止或逆转免疫功能的衰竭，可以延缓衰老，并改变衰老病变组织器官的严重程度。衰老的免疫学表现有免疫器官功能衰退，随着年龄增加，各免疫器官的功能日渐衰退，其中最明显的是胸腺，胸腺萎缩是老年人免疫功能下降的关键。细胞免疫和体液免疫功能也在衰老的过程中有所改变，细胞免疫是依赖胸腺分化成熟的T细胞发挥作用的，因此随着年老胸腺萎缩，T细胞的质和量都受到影响是无疑的。免疫和衰老的关系密切，从免疫的角度提高机体的免疫力来抗衰老和延缓衰老有着重要的意义。
[0006]另外，衰老和炎症之间也有着密切的联系，炎性衰老受到越来越多的关注，炎症衰老是指随着年龄的增长机体出现一个慢性炎症的过程。炎症是宿主系统对病原体感染以及各种组织损伤等产生的一系列复杂的应答事件，它通过影响机体微环境中多种细胞与因子的相互作用，调控机体多种生理与病理信号网络的平衡走向，表现出了高度的两面性:在一般情况下当致炎因素如感染或组织损伤消除后，炎症反应随即终结，之后转变成为一种高度活跃、精细调控的平衡状态，这种炎症被称为可控性炎症。但是在某些不确定因素的作用下，如持续的或低强度的刺激，靶组织处于长期或过度反应时，炎症无法从抗感染组织损伤模式下转变成为平衡稳定的状态，导致炎症反应的持续进行表现为非可控性炎症状态。炎性衰老的炎症具有非可控炎症的特征。炎症如同免疫反应一样是机体的正常生理功能，适度的炎症反应对机体有利，反之则有害。炎症细胞因子网络包括促炎症细胞因子网络和抗炎症细胞因子网络。这两个既相互对立又相互依存的子网络的变化控制着炎症的有利或有害作用的方向。正常情况下他们之间处于一个动态平衡的关系，炎性衰老中的病理性炎症是炎症细胞因子网络失衡所致，还与炎症介质的异常密切相关。
[0007]免疫衰老与炎性衰老相伴而行，炎性衰老的机制可以归纳成如下:应激学说，应激是机体在各种内外环境因素及社会心理因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应。应激是一把双刃剑，对机体有利也有害。炎性衰老进程中机体长期处在应激原所形成的环境中。应激原是导致和维持慢性促炎性反应状态存在的原因。氧化炎症学说，氧化应激、炎性衰老与免疫衰老三者密切相关。细胞因子学说，促炎症细胞因子在慢性炎症所致机体的炎性衰老中发挥着重要的作用。
[0008]由于辐射引起炎症，而炎症可以引起衰老，目前，植物连翘提取物被用于各种医药和保健方面，但是将连翘提取物用于抗辐射，抗炎症和抗衰老方面的研究还暂未发现。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是提供连翘提取物在制备具有抗辐射和抗衰老功效的保健食品或化妆品中的应用。
[0010]本发明对连翘提取物进行了抗辐射和抗衰老的功效细胞生物学验证，由于辐射引起炎症，而炎症可以引起衰老，因此
申请人:研究了连翘提取物抵抗UVA辐射作用，并且目前关于此类的应用很少。本申请提供的连翘提取物具有抗UVA辐射作用，显著降低UVA辐射引起的真皮细胞和表皮细胞损伤，另外，衰老与炎症之间也有密切的联系，
申请人:同时研究了连翘提取物在体外的抗炎效果，发现其能有效地抑制巨噬细胞炎症因子表达。促炎细胞因子能诱导细胞衰老，促炎细胞因子(如TNF- a，IFN- y，IFN- β )等通过产生活性氧和激活ATM/P53/P21信号通路诱导上皮细胞衰老，趋化因子受体CXCR2通过P53通路诱导成纤维细胞衰老，DNA损伤激活NF-KB等信号通路产生促炎细胞因子(IL-1，IL_6，IL-8等)，从而阻滞细胞周期，诱导和维持细胞衰老表型。DNA损伤学说，由于DNA损伤积累使得干细胞和基质成纤维细胞分化为促炎症细胞因子过表达细胞，使多层状细胞因子网络崩溃，导致炎性而导致衰老。
[0011]本发明中上述具有抗辐射和抗衰老功效的连翘提取物，可以采用市售的产品，也可以优选采用本发明提供的下述优选的方法制备的连翘提取物。
[0012]作为本发明的一种优选方案，本发明中所述的连翘提取物，其可通过如下方法制备获得:[0013](I)前处理将原料连翘清洗后，粉碎；
[0014](2)超声波处理用乙醇水溶液超声提取后，过滤，浓缩得浓缩液，在浓缩液中加水稀释后，过滤，得到B过滤液；
[0015](3)大孔树脂柱上样:将B过滤液上到PIP0-02大孔树脂分离柱上；
[0016](4)分离:用乙醇水溶液洗脱以除去大孔树脂中的杂质，再次用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，得到D分离液；
[0017](5)浓缩干燥:真空减压浓缩D分离液，并真空干燥得到连翘提取物。
[0018]在上述步骤中:
[0019]本发明步骤(I)中粉碎后优选过筛至30-60目。
[0020]本发明步骤(2)中乙醇水溶液超声提取时，乙醇水溶液的用量优选为原料总重量的8-10倍，乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量优选为40-80%，超声提取两次，每次优选20-40分钟。
[0021]本发明步骤(2)中浓缩优选得3-5倍原料重的浓缩液，在浓缩液中加水稀释时，水的用量优选为浓缩液总重量的2-4倍。
[0022]本发明步骤(3)中PIP10-02大孔树脂分离柱优选为两根，且相串联；以双柱串联模式，先洗脱极性杂质，尽可能浓缩连翘中的连翘苷成分。
[0023]本发明步骤(4)中除去大孔树脂中的杂质时乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量优选为5-12%，其用量优选为连翘原料重的0.8-4.8倍；再次用乙醇水溶液洗脱时乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为25-45%，其用量优选为连翘原料重的0.4-2.4倍。
[0024]本发明步骤(5)中优选在40_70°C真空减压浓缩D分离液。
[0025]本发明步骤(5)中连翘提取物中经HPLC检测连翘苷的质量百分含量在70%以上。
[0026]本发明具有如下优点:
[0027](I)本发明方法提取的连翘提取物中连翘苷的含量高于70%，在保健食品或化妆品中应用量小，含量明确容易质量控制；
[0028](2)本发明连翘提取物色泽浅谈，适合化妆品中应用，不影响化妆品的原有色泽；
[0029](3)本发明提取效率高，能充分利用资源；
[0030](4)本发明的连翘提取物生产制备成本低，宜于在保健食品或化妆品中应用，具有市场竞争力。
【专利附图】
【附图说明】
[0031 ] 图1是本发明实施例4中(1.2)连翘提取物对UVA照射下的3T3细胞保护作用；
[0032]图2是本发明实施例4中(1.3 )彗星电泳检测细胞DNA损伤的实验结果，其中左图为加入了连翘提取物，中图为有UVA照射的3T3细胞，右图为无UVA照射的3T3细胞的DNA
产生彗星拖尾率；
[0033]图3是本发明实施例4中(1.4)流式细胞仪检测连翘提取物对UVA辐射3T3细胞周期的保护作用，其中A图为无UVA照射的3T3细胞，B图为有UVA照射的3T3细胞，C图为加入了连翘提取物的3T3细胞的流式细胞结果图；
[0034]图4是本发明实施例4中(1.5) MTT法检测连翘提取物对RAW264.7细胞毒性；
[0035]图5是本发明实施例4 (1.5)中PCR检测连翘提取物在转录水平抑制或降低炎症因子IL-6的产生；
[0036]图6是本发明实施例4 (1.5)中PCR检测连翘提取物在转录水平抑制或降低炎症因子IL-1的产生；
[0037]图7是本发明实施例4 (1.5)中PCR检测连翘提取物在转录水平抑制或降低炎症因子TNF-alpha的产生；
[0038]图8是本发明实施例4 (1.5)中PCR检测连翘提取物在转录水平抑制或降低炎症因子MCP-1的产生；
[0039]图9是本发明实施例4 (1.5)中PCR检测连翘提取物在转录水平抑制或降低炎症因子MCP-1的产生。
【具体实施方式】
[0040]下面是结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0041](一)本发明优选的连翘提取物的提取方法
[0042]实施例1
[0043]本实施例提供的连翘提取物的优选的制备方法，含以下步骤:
[0044]A:前处理:将原料连翘用水洗净，粉碎，过筛至30-60目，称重I千克；
[0045]B:提取:用8-10千克乙醇体积百分含量为40-80%的乙醇水溶液超声提取2次，每次20-40分钟，过滤，合并提取液，将提取液浓缩得到3-5千克浓缩液，在浓缩液中加入6-20千克水稀释浓缩液，过滤，得到9-25千克B过滤液；
[0046]C:上样:将B过滤液上到200-600毫升柱体积的PIP0-02 (分离材料重200-600克)大孔树脂分离柱，相同体积和装有双柱节串联中；
[0047]D:分离，用体积百分含量为5-12%的乙醇水溶液洗脱800-4800毫升，除去前杂，用体积百分含量为25-45%%的乙醇水溶液洗脱，收集400-2400毫升，得到D分离液；
[0048]E:浓缩干燥:在40-70°C真空减压浓缩D分离液，并真空干燥得到连翘提取物，用HPLC连翘苷对照品测试发现，连翘提取物中连翘苷的含量在70%以上，称重为60-120克。
[0049]实施例2
[0050]本实施例提供的连翘提取物的优选的制备方法，含以下步骤:
[0051]A:前处理:将原料连翘用水洗净，粉碎，过筛至30-60目，称重10千克；
[0052]B:提取:用80-100千克乙醇体积百分含量为40_80%的乙醇水溶液超声提取2次，每次20-40分钟，过滤，合并提取液，浓缩得到30-50千克浓缩液，在浓缩液中加入60-200千克水稀释浓缩液液，过滤，得到90-250千克B过滤液；
[0053]C:上样:将B过滤液上到毫升柱体积的PIP0-02 (分离材料重克)分离柱，相同体积和装有双柱节串联中；
[0054]D:分离，用乙醇体积百分含量为5-12%的乙醇水溶液洗脱毫升，除去前杂，用乙醇体积百分含量为25-45%%的乙醇水溶液水洗脱，收集毫升，得到D分离液；
[0055]E:浓缩干燥:在40-70°C真空减压浓缩D分离液，并真空干燥得到连翘提取物，用HPLC连翘苷对照品测试发现，其中连翘苷的质量百分含量在70%以上，称重为600-1200克。
[0056]实施例3[0057]本实施例提供的连翘提取物的优选的制备方法，含以下步骤:
[0058]A:前处理:将原料连翘用水洗净，粉碎，过筛至30-60目，称重100千克；
[0059]B:提取:用800-1000千克40_80%乙醇超声提取2次，每次20_40分钟，过滤，合并，浓缩得到300-500千克提取液，加600-2000千克水稀释提取液，过滤，得到900-2500千克B过滤液；
[0060]C:上样:将B过滤液上到毫升柱体积的PIP0-02 (分离材料重克)分离柱，相同体积和装有双柱节串联中；
[0061]D:分离，用5-12%乙醇洗脱80-480升，除去前杂，用25_45%%乙醇水洗脱，收集40-240升，得到D分离液；
[0062]E:浓缩干燥:真空减压在40-70度浓缩D分离液，并真空干燥得到连翘提取物，用HPLC连翘苷对照品测试发现，其中连翘苷的质量百分含量在70%以上，称重为原料重量的6-12千克。
[0063](二)连翘提取物的功效验证
[0064]实施例4连翘提取物抗辐射和抗衰老功效验证
[0066]以下采用本发明实施例1中制备获得连翘提取物，进行抗辐射和抗衰老功效验证。
[抗辐射功效验 证 实验
[0068]采用本发明实施例1中制备得连翘提取物对UVA辐射3T3细胞的防护作用，方法如下:
[0069]通过MTT法检测细胞增殖情况来测定化合物对UVA辐射3T3细胞的防护作用。
[0070](I)收集对数期3T3细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μ L，铺板使待测细胞调密度至孔；
[.5%C02，37°C孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，梯度浓度依次为:200 μ g/mL , 100 μ g/mL , 50 μ g/mL , 25 μ g/mL , 12.5 μ g/mL , 6.25 μ g/mL,每个梯度设置3个复孔，每组设置3个空白孔，对照组不作处理5%C02，37°C孵育16-24小时；
[0072](3)辐射组各组细胞按UVA辐射剂量条件摸索实验的得到的紫外条件进行紫外辐射:辐照时间45辐射剂量1.4J/cm2，对照组不作处理，5%C02，37°C孵育16-24小时；
[0073](4)每孔加入10 μ LMTT溶液，继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液；
[0074](5)每孔加入100 μ L 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪0D570nm处测量各孔的吸光值；
[0075]结果如图1中所示，试验结果表明，采用本发明实施例1中提取的连翘提取物对UVA辐射3T3细胞具有防护的活性(≤90%cell viability)。
[抗炎抗衰老作用功效验证实验
[0077]采用彗星电泳检测本发明实施例1中制备得连翘提取物对UVA辐射3T3细胞DNA的保护作用，方法如下=DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。
[0078](I) 3T3细胞预12孔板，细胞密度为70% ；[0079](2)化合物处理:将上述实验筛选出的化合物稀释至200 μ g/mL (我们采用有效最大浓度作为该实验的药物工作浓度)，吸弃培养基，加入稀释的化合物稀释液，每孔lmL，37度，5%C02的培养箱培养24h ；
[0080](3)将处理的细胞UVA辐照lh，60uff/cm2, 37°C，5%C02的培养箱培养24h ；
[0081](4)胰酶消化细胞，含血清的培养基终止消化，将细胞液转入15mL离心管内，1000rpm/min,离心5min,弃上清,加入适量PBS重悬细胞，同上离心5min,弃PBS,加入适量的PBS重悬细胞，调细胞浓度至106cells/mL ；
[0082](5)制胶:溶解0.7%浓度的正常熔点琼脂糖，快速滴加70 μ L至干净的载玻片，快速用盖玻片压胶，4°C凝胶20min，轻轻剥离盖玻片，将细胞悬液和0.8%低熔点琼脂糖混匀，快速滴加至第一层胶上，快速盖玻片压胶，4°C凝胶20min ；
[0083](6)轻轻剥离第二层胶上的盖玻片，将胶放入碱性裂解液中，4°C裂解1.5?2
[0084](7)轻轻取出载玻片，用单蒸水洗胶2次；
[0085](8)将胶放入碱性电泳液中，静置20min，25V，电泳15min，pH7.5的Tris-HCl中和三次，每次5min ；
[0086](9) PI染色镜检，拍照。
[0087]彗星电泳检测细胞DNA损伤的实验结果如图2中所示，本发明实施例1中制备得连翘提取物对UVA辐射引起的DNA损伤具有显著地抑制作用。
[抗炎抗衰老作用功效验证实验
[0089]流式细胞仪检测药物本发明实施例1中制备得连翘提取物对UVA辐射3T3细胞周期的保护作用，方法如下:细胞DNA损伤，发动细胞基因组修复机制，调节细胞周期进而完成基因组的损伤修复，保证细胞基因组的完整。UV辐射对细胞的基因组DNA造成断裂损伤，必将导致细胞周期发生变化。因此利用细胞流式仪来检测化合物对变化的细胞周期是否具有调节抑制作用。
[0090](I) 3T3细胞预12孔板，培养过夜；
[0091](2)细胞药物处理:将药物做浓度稀释，加入细胞，24h后UVA辐射lh，60yW/cm2，细胞培养箱培养24h后收样品；
[0092](3)胰酶消化细胞，转至1.5mL离心管，1000rpm/min离心5min，弃上清，PBS洗两遍，离心条件同上，弃PBS，加入500 μ L的70%乙醇4度固定过夜；
[0093](4)弃PBS，加入500 μ L的70%乙醇4°C固定过夜；
[00rpm/min, 4°C,离心5min,弃乙醇，加入PBS重悬，同上离心；
[0095](6)弃PBS，加入含有DNA酶I和PI染料的PBS中，200目的筛网过滤；
[0096](7)上细胞流式仪测周期；
[0097]流式细胞仪检测细胞周期,结果如图3中所示,其中Gl是DNA合成前期,细胞静止期；S为DNA复制时期；G2是DNA合成后期，为增殖期的细胞。如果Gl加药前&G1加药后，S期和G2期的细胞比例增加，细胞则表现增殖活跃。
[0098]图3中的流式结果表明:本发明实施例1中制备得连翘提取物与UVA组数据相比，连翘提取物具有保护作用。
[抗炎抗衰老作用机理验证实验
[0100]MTT法检测筛选的本发明实施例1中制备得连翘提取物对RAW264.7细胞毒性，方法如下:
[0101](I)收集对数期RAW264.7细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μ L，铺板使待测细胞调密度至孔；
[.5%C02，37°C孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，随机分为60组，每个药物一组，每组加入浓度梯度的连翘提取物，梯度浓度依次为:200 μ g/mL、100 μ g/mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL、12.5 μ g/mL、6.25 μ g/mL,每个梯度设置3个复孔,每组设置3个空白孔，5%C02，37°C孵育16-48小时；
[0103](3)每孔加入10 μ LMTT溶液，继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液；
[0104](4)每孔加入100 μ L 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪0D570nm处测量各孔的吸光值；
[0105]本发明实施例1中制备得连翘提取物对RAW264.7细胞的毒性如图4中所示，从图4中可以看出，连翘提取物对细胞无毒害的最大无毒浓度。
[抗炎抗衰老作用功效验证实验
[0107]PCR检测本发明实施例1中制备得连翘提取物在转录水平抑制或降低炎症因子的产生，方法如下:对筛选得到的具有抗UVA辐射的化合物连翘提取物在巨噬细胞RAW264.7细胞模型进行抗炎活性实验。
[0108](I)取对数期RAW264.7细胞，预24孔板，铺板调整细胞密度为3X 105cells/mL ；
[0109](2)加入50ng/mL的PMA，培养48h，在显微镜下观察细胞形态；
[0110](3)小心吸去孔内培养基，用PBS冲洗2遍后，加入无血清的1640培养基，培养24h ；
[0111](4)加入100ng/mL的LPS以及连翘提取物，培养18?24
[0112](5)抽提给药组细胞的RNA，使用real-time PCR法对IL-6和IL-1 (Interleukin-6, nterleukin-1，白细胞介素 6 白细胞介素 I)，TNF- a (tumor necrosisfactor-alpha,肿瘤坏死因子)，MCP-1 (monocyte chemotactic protein-l,巨卩遼细胞趋化蛋白I)、和iNOS进行定性定量分析，观察活性物对炎性因子表达的影响，本发明实施例1中制备得连翘提取物对炎症因子的表达的抑制作用。
[0113]IL-6 和 IL-1 (Interleukin-6, nterleukin-1,白细胞介素 6 白细胞介素 I)的结果如图5和6中所不,TNF-a (tumor necrosis factor-alpha,肿瘤坏死因子)的结果如图7中所不，MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1,巨卩遼细胞趋化蛋白I)和iNOS结果如图8和9中所示，
[0114]从图5-9中可以看出:检测本发明实施例1中制备的连翘提取物表现出不同的抑炎作用，本发明实施例1中制备的连翘提取物对IL-1、IL-6和TNF-a的抑制作用显著。
[0115]实际上，本发明
申请人:还同时对其他来源的连翘提取物如市售的连翘提取物或其他方法制备获得连翘提取物进行上述试验，结果表明，也具有上述抗辐射和抗衰老功效。
[0116]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
【权利要求】
1.连翘提取物在制备具有抗UVA辐射和抗衰老功效的保健食品或化妆品中的应用。
2.根据权利要求1所述的连翘提取物在制备具有抗UVA辐射和抗衰老功效的保健食品或化妆品中的应用，其特征是:所述的连翘提取物中连翘苷的质量百分含量在70%以上。
3.一种具有抗UVA辐射和抗衰老功效的连翘提取物的制备方法，其特征是含以下步骤:(O前处理将原料连翘清洗后，粉碎；(2)超声波处理用乙醇水溶液超声提取后，过滤，浓缩得浓缩液，在浓缩液中加水稀释后，过滤，得到B过滤液；(3)大孔树脂柱上样:将B过滤液上到PIP0-02大孔树脂分离柱上；(4)分离:用乙醇水溶液洗脱以除去大孔树脂中的杂质，再次用乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液，得到D分离液；(5)浓缩干燥:真空减压浓缩D分离液，并真空干燥得到连翘提取物。
4.根据权利要求3所述的具有抗UVA辐射和抗衰老功效的连翘提取物的制备方法，其特征是:步骤(I)中粉碎后过筛至30-60目。
5.根据权利要求3所述的具有抗UVA辐射和抗衰老功效的连翘提取物的制备方法，其特征是:步骤(2)中乙醇水溶液超声提取时，乙醇水溶液的用量为原料总重量的8-10倍，乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为40-80%，超声提取两次，每次20-40分钟。
6.根据权利要求3所述的具有抗UVA辐射和抗衰老功效的连翘提取物的制备方法，其特征是:步骤(2)中浓缩得3-5倍原料重的浓缩液，在浓缩液中加水稀释时，水的用量为浓缩液总重量的2-4倍。
7.根据权利要求3所述的具有抗UVA辐射和抗衰老功效的连翘提取物的制备方法，其特征是:步骤(3)中PIP10-02大孔树脂分离柱为两根，且相串联。
8.根据权利要求3所述的具有抗UVA辐射和抗衰老功效的连翘提取物的制备方法，其特征是:步骤(4)中除去大孔树脂中的杂质时乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为5-12%，其用量为连翘原料重的0.8-4.8倍；再次用乙醇水溶液洗脱时乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为25-45%，其用量为连翘原料重的0.4-2.4倍。
9.根据权利要求3所述的具有抗UVA辐射和抗衰老功效的连翘提取物的制备方法，其特征是:步骤(5)中在40-70°C真空减压浓缩D分离液。
10.根据权利要求3所述的具有抗UVA辐射和抗衰老功效的连翘提取物的制备方法，其特征是:步骤(5)中连翘提取物中经HPLC检测连翘苷的质量百分含量在70%以上。
【文档编号】A61Q17/04GKSQ
【公开日】日
申请日期:日
优先权日:日
【发明者】赵宏伟, 王一飞, 吴志韻, 袁晓, 邹士玉, 马忠华
申请人:无限极（中国）有限公司