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肿瘤免疫治疗时代的来临
&&&&&& 激活免疫系统以达到肿瘤的治疗效果，是免疫学与肿瘤学上的一个长远的目标。由于近期概念验证的临床试验的成功，近十年的失败这种情况最终得以改变。最显著的当属抗&CTLA4抗体，ipilimumab，与传统治疗相比，在提高患有转移性恶性黑色素瘤的病人的生存期上有明显的疗效。在耐受、免疫和免疫抑制如何调节抗肿瘤免疫反应机制的进展及靶向治疗的出现的背景下，这些成果意味着有效免疫治疗代表了可在肿瘤病人中达到持久的长效的反应的一种方法。
&&&&&& 在异源性骨髓移植的基础上输注抗肿瘤单克隆抗体和供体T细胞是对多种血液肿瘤和实体肿瘤的有效治疗方法。尽管没有将其考虑为&免疫治疗&，这些生物治疗剂的效果可能表明供体T细胞或抗体可诱导直接抗肿瘤反应而回避了内源性免疫的激活。这些免疫疗法在肿瘤学上得到认可已达数十年，而且抗体和T细胞工程的持续发展将在未来的时间中对临床有更大的影响。（Box1）
BOX1 已确立的免疫治疗方法
&&&&&& 针对六种肿瘤相关蛋白（Her2/neu，EGFR，CD20，CD52和CD33）的九种单克隆抗体被批准应用于实体和血液恶性肿瘤的治疗。除了抑制肿瘤形成通路，这些生物治疗法还可能促进肿瘤细胞的调理作用以及促其死亡或利用抗体依赖的细胞毒或吞噬作用来消除肿瘤细胞。先阶段在哺乳动物模型和病人中的研究表明它们在某些特定的条件下还可能有激活适应性免疫反应的功能。最近，已成功的实现了毒素与抗体的结合，它们可以诱导对单用抗体没有反应的病人出现临床反应。同时给予免疫激活细胞因子例如IL-2和GM-CSF可能也能提高抗体治疗的效果。
&&&&&& 异源性骨髓移植和输注供体淋巴细胞是一种对某些白血病和淋巴瘤的高效治疗方法。移植物抗白血病效果包括供体淋巴细胞的直接杀肿瘤细胞，以及随后诱导的广泛的固有和适应性免疫。在这些临床效果基础上，许多机构正在探索利用自体同源条件下的过继性T细胞治疗。有前景的方案包括T细胞输注前的淋巴耗尽（lymphodepletion）和CARs诱导出T细胞新特异性工程。
&&&&&& 其它通过FDA批准的免疫治疗方法包括重组细胞因子例如IL-2（Proleukin），应用于黑色素瘤和肾细胞癌。反应率低（~15%），严重的系统性感染的几率非常大，需要像住院病人一样给药。干扰素-&是另一种通过批准的用于&免疫肿瘤&（即黑色素瘤或肾细胞瘤）的药物。尽管伴随着低反应率和高剂量毒性，黑色素瘤病人中的一小部分，他们也预先接受了自身免疫治疗，表现出惊人的生存提高反应。但是预先判断哪些病人适合使用这种方法非常困难。然而，可以看到的是这些反应是持久性的，表明他们建立了主动的抗肿瘤免疫。
&&&&&& 与这些被动性免疫治疗方法相比，主动激活特异性和持久性的抗肿瘤免疫已并证实为不可能。在1891年，纽约的一个年轻的外科医生Willian Coley，向肿瘤中注入活性的或失活的酿脓链球菌和粘质沙雷氏菌，试图复制出少数患有丹毒的肿瘤病人肿瘤自发缓解这种现象。鉴于Elie Metchnikoff当时的学说，免疫系统引起炎症并杀灭入侵的细菌，&Coley 毒素&利用激活抗细菌吞噬作用可能杀死旁边的肿瘤细胞来起效。在之后40年中，一些有意义的反应被报道，但却是偶然的，难以复制的，不能再科学严密方式下获得。膀胱表皮癌是一个例外，手术切除后向膀胱内注射活的芽孢杆菌Calmette-Guerin，明显提高了病人的生存期。除了这种特定的临床环境，这种方法从没被肿瘤医生所接受，他们继续依赖手术，很快依赖于其它有效的新方法，例如，放射治疗和基本化疗。相关的感染风险和至少高热对已经很虚弱肿瘤病人的危险将Coley的方案的效果大打折扣；这种治疗的确有意义，但考虑到其所带来创伤，这种意义也变得非常讽刺。这样开始了癌症免疫治疗的历史。在继续下去前，概括如何建立肿瘤的保护性免疫反应以及解释难以克服这些障碍的原因，这是非常必要的。
建立抗肿瘤免疫是一个多步骤的挑战
&&&&&& 基于我们现阶段对免疫应答的了解，无论是建立自发地还是有治疗性的有效抗肿瘤免疫需要经过三个特定的步骤。（Fig 1）对于初次免疫，树突细胞需要收集肿瘤来源的抗原，这些抗原可以从原位摄取也可以作为治疗的疫苗从外源传递。这些抗原可能是瘤特异性变异蛋白中的一种或几种，肿瘤优先表达的非变异基因的产物（例如，肿瘤睾丸抗原）或是肿瘤起源组织相关的分化抗原，但是针对它们的胸腺和外周耐受都没有完全建立（例如，黑色素瘤中黑素体相关蛋白）。与抗原向接触后，树突状细胞同时会接受一种合适的活化信号（&成熟&），这种信号使得它们广泛的分化以促进免疫同时对抗耐受，其中包括提高处理和表达肿瘤抗原来源多肽的数量。活化信号可以是外源性治疗性提供的配体（例如，Toll样受体），活化受体主动诱导产生的抗体（例如CD40），或外源性的死亡或坏死肿瘤细胞释放的因子（例如，高速泳动族蛋白或ATP），它们被认为可以导致树突状细胞的免疫源性变异。除此之外，肿瘤细胞可能表达本应定位内质网的蛋白，易位于质膜上（例如，钙网织蛋白），它们会促进吞噬作用，可能保证主要组织相容性复合物（MHC）Ⅰ和Ⅱ分子高速泳动族蛋白与肿瘤抗原的结合。某些化疗或靶向治疗可能促进更易产生免疫性的表现型。
Figure 1 抗肿瘤免疫的产生和调节
&&&&&&& 在对于产生和调节抗肿瘤免疫的了解下表明至少有三处可以进行治疗性干预。提高树突状细胞的抗原提呈功能，提高保护性T细胞应答数量和对抗肿瘤中的免疫抑制。抗肿瘤免疫应答起始于树突状细胞对肿瘤相关抗原的捕获，这些抗原可以是外源性传递也可是从死亡或接近死亡细胞中捕获的。树突状细胞处理捕获的抗原并分别提呈或交叉提呈给MHCⅡ和Ⅰ分子，并迁移到淋巴结内。如果在免疫源性成熟刺激的条件下发生捕获和提呈，树突状细胞会在淋巴结中建立抗肿瘤效应T细胞应答；如有没有这种刺激，树突状细胞会诱导耐受而导致T细胞数量下降，无效能或T reg细胞的产生。在淋巴结中，抗原提呈给T细胞会建立应答，这依赖于树突状细胞所受到成熟刺激的种类以及T细胞的共刺激分子与树突状细胞表面受体的共同作用。因此，CD28或OX40与CD80/86或OL40L的相互作用将会促进保护性T细胞应答，而CTLA4与CD80/86或PD-1与PD-L1/PD-L2的相互作用会抑制T细胞应答，而且有可能促进T reg细胞形成。识别过抗原的T 细胞（与B细胞和NK细胞一起）会离开淋巴结进入肿瘤& ，在& 中有许多由肿瘤（或浸润骨髓细胞）产生的免疫抑制防御机制，导致拮抗效应T细胞的功能。这些机制包括上调肿瘤细胞表面PD-L1/L2的数量以及VEGF（部分有肿瘤内缺氧产生）的释放。VEGF会抑制T细胞从脉管系统中渗出浸润到肿瘤 。
&&&&&& 接下来在淋巴样器官中，荷载肿瘤抗原的树突状细胞必须产生保护性T细胞应答。这种必需的T细胞应答准确类型并不知道，但是它们肯定包括有细胞毒性的CD8+效应T细胞的产生。树突状细胞可能同时引发抗体、自然杀伤细胞或自然杀伤T细胞应答而可能导致肿瘤免疫。淋巴结是第二个治疗干预的可能性靶点，它提供了可能帮助指导T细胞应答的场所。然而，这种情况下，树突状细胞仍是个重要位点，它们必需由佐剂刺激而成熟从而有引起所需要的T细胞的产生。树突状细胞在稳定水平下提呈抗原（即树突状细胞没有免疫源性成熟信号刺激）将产生拮抗抗肿瘤免疫应答的调节性T细胞（T reg）而导致耐受。
最后，肿瘤特异性T细胞必需进入肿瘤 以发挥它抗肿瘤作用，在此免疫抑制就成为了最大的挑战（Box 2）。肿瘤可能（推测通过影响树突状细胞的成熟）阻碍免疫，导致&错误&免疫应答或局部富集或扩散对抗效应T细胞作用的T reg细胞。T reg细胞的浸润的确与许多上皮类肿瘤类型预后较差有关。肿瘤可能下调它们MHCⅠ分子的表达或靶向肿瘤抗原的表达，也可以产生许多表面分子（例如，PD-L1或PD-L2）与活化的T细胞表面受体（PD-L1）相结合而导致T细胞的无能或耗尽。这些抑制配体的表达通常与许多肿瘤变异相关（例如，PTEN丢失）。除此之外，肿瘤会释放免疫抑制分子，如吲哚胺 2,3-加双氧酶（IDO），这种酶消耗色氨酸并限制T细胞的功能。骨髓来源的抑制细胞同时可以募集于肿瘤中并释放额外的T细胞抑制因子，例如精氨酸和亚硝酸氧化合酶。肿瘤微环境中缺氧可能促进腺苷的生成，腺苷以同样的方式抑制T细胞功能。缺氧同时产生CCL28，可以诱导T reg细胞的迁移。最后，肿瘤基质细胞也能抑制效应淋巴细胞的功能。例如，间叶干细胞阻碍效应T细胞的增殖和作用，而肿瘤血管细胞可抑制T细胞的粘附（与肿瘤内皮）并阻碍其相肿瘤内归巢。这种作用部分由血管内皮生长因子（VEGF）和内皮素-B受体（ETBR，同时也作EDNRB）共同调节。
BOX 2 免疫抑制机制
&&&&&& 肿瘤逃逸免疫攻击通过许多相互互补的免疫抑制机制，这些机制的作用大多都是平行的。在旁分泌递质中，腺苷、前列素E2，TGF-&和VEGF-A发挥了许多直接和间接地免疫抑制作用。这些递质通过抑制树突状细胞而起作用，间接抑制T细胞渗入肿瘤床或直接抑制效应T细胞活化并同时提高T reg细胞的功能。例如，腺苷是由肿瘤细胞在缺氧状态下产生的，会导致T细胞活化抑制和T reg细胞扩散。VEGF-A同时抑制正常的T细胞形成和功能：在T细胞激活时小鼠脾细胞用VEGF-A处理后表现出诱导T细胞产生IL-10而抑制IFN-&的产生。肿瘤细胞也可以下调MHCⅠ的数量或破坏抗原处理过程中的一些成分来直接逃逸T细胞识别。封闭可溶性NKG2D配体例如MIC-A或MIC-B可以严重减弱效应T细胞在肿瘤微环境中的功能。除此之外，肿瘤细胞可以上调表面配体包括PD-L1和与其它抑制性T细胞受体结合的配体来使T细胞无能（或耗尽）。许多白细胞亚型（leukocyte subsets）浸润肿瘤同时可以抑制T细胞的功能。除了T reg 细胞（这种细胞的集聚与肿瘤预后差相关）之外，其它被报道的抑制性淋巴细胞亚型包括分泌IL-10的B细胞、调节性B细胞、Ⅱ型NKT细胞、NK细胞、&&细胞。髓系细胞同时引起肿瘤中的免疫抑制。这些细胞主要是了解较少的骨髓来源抑制细胞（MDSC）。对它们的描述最终依据于它们抑制T细胞和NK细胞的能力，它们可能通过NO、活性氧、精氨酸酶、IL-10和TGF-&来产生抑制作用；也有报道说MDSC可能特异性诱导T reg细胞的扩散。肿瘤基质细胞有一种重要的免疫调节作用。所谓的肿瘤相关成纤维细胞可以通过分泌CCL2和CXCL12来促进免疫抑制细胞的募集及提高其功能。最后，骨髓来源网状干细胞通过阻碍效应T细胞的增殖和减弱其作用而起到重要的免疫抑制功能。我们需要深入的研究以了解通常是这些机制中的哪种起最重要的作用以及在个体病人中起决定免疫状态的机制。
&&&&&& 综上所述，免疫治疗似乎不可能实现。所有方法都需要克服许多重大的阻碍：肿瘤相关抗原之间非常相似或与自身抗原相同；分辨治疗性效应与病理性自身免疫效应非常困难；中枢性和外周性耐受同时参与减弱或使T细胞所有功能失活；以及肿瘤微环境固有的免疫抑制作用。然而，现在看来却有临床成果。
肿瘤疫苗崭露头脚
&&&&&& 疫苗有两种形式：预防疾病的和治疗性的。预防性（保护性）疫苗已经在预防病毒感染所致的肿瘤,例如乙肝病毒和人乳头瘤病毒上取得了明显的效果，这种情况下，致病的结构已知。相比之下，治疗已知疾病的治疗性疫苗的发展显得不确定。在许多肿瘤学家看来，长期的失败已经使得整个免疫治疗策略岌岌可危。
&&&&&& 治疗性疫苗最初来源于发现病人肿瘤中有针对肿瘤睾丸抗原或分化抗原所表达的CD8+和CD4+ T细胞。疫苗可能适当地增加这些已存在的应答的频率和强度或诱导新的应答。除此之外，临床病理研究表明肿瘤内CD3+或CD8+毒性T细胞核一种干扰素-&（IFN-&）的存在与病人生存期的延长相关。因此，如果疫苗可以引起这些类型的T细胞应答，临床上的治疗效果将可以期待。
&&&&&& 不幸的是，因为对免疫机制缺乏了解，特别是对树突状细胞作用的了解，许多初期的尝试都夭折了。许多研究机构对数千例病人使用含有短肽但没有有效的树突状细胞激活佐剂的疫苗治疗。单纯的肽类的药代动力学特性大多都较差，半衰期较短，可能在与树突状细胞结合前很快就被清除了。在没有佐剂的情况下，树突状细胞静止或产生耐受与激活免疫有着同等的概率。所以就产生了特异性较差的免疫，对所选出的肿瘤抗原（假定它们是正确的）应答很少以及很小的治疗效果。最近，将作为一种免疫激活剂的IL-2与一种黑素细胞分化抗原，糖蛋白 100（gp100）来源的短肽联合使用，与单用IL-2相比，提高了肿瘤应答和患者无进展生存期。这些成果表明利用肽类疫苗来增加免疫活化作用是提高治疗效果的重要步骤。
&&&&&& 对于树突状细胞在激活T细胞应答中的重要作用的了解使得近期疫苗试验设计得更为合理。一种有较大前景的方法利用寡肽（&20氨基酸），这种寡肽稍微长于结合于MHCⅠ分子的肽类（10-12）。在适当的树突状细胞激活佐剂的存在下，这些寡肽被认为能更有效的刺激生成效应T细胞，可能是因为某些处理中所必需的。最近一项研究将从HPV-16 E6和E7 病毒蛋白获得的寡肽与不完全弗氏佐剂同时使用，发现在19个会阴部上皮内肿瘤女性患者中，有15个出现临床反应。肿瘤的减小与HPV特异性并能分泌 INF-&的CD4+和CD8+T细胞同时出现。这些有利的结果可能在某种程度上反应出应选择病毒基因产物来免疫，因为这些蛋白可能更易被机体认为是外来物。的确，一些小型的试验利用从肿瘤中经常出现变异的抑癌基因TP53(现在的p53)得到的长肽与Montanide（一种乳化佐剂）在进展期卵巢癌患者中同时时候，诱导出一种非常弱的分泌IFN-&的T细胞应答而且没有出现肿瘤减小，这表明我们需要更进一步优化我们的方案，或者是在这种情况下单用p53不能有效地诱导出免疫反应；与病毒抗原相比，p53可能需要同时克服自己的免疫耐受。
&&&&&& 完整的长链蛋白也被作为肿瘤疫苗的靶点，因为它们有可能被DC细胞提呈且范围较广的抗原决定基。在这些研究中，GlaxoSmithKline 最近在进行一项大型（&2500例）随机三期临床试验，在HLA-A2阳性的非小细胞肺癌病人中使用一种重组融合蛋白，这种蛋白是一种单一肿瘤睾丸抗原（MAGE-3）的一部分，同时使用的还有含有皂素/脂质（TLR4与TLR9激活剂结合的乳剂）的ASO2B佐剂。二期试验（180例）的前期结果显示生存提高（27%），但这并没有统计学意义。无论是目标T细胞应答并还是在实验组中可靠的的数据或同种MAGE-A3的表达都没有实现；后者尤其重要，因为对无MAGE-3表达的肺癌细胞亚群的免疫攻击需要由额外的肿瘤抗原诱导的不同种类T细胞来完成。
&&&&&& 另一种引起关注的靶点是B细胞淋巴瘤（特异基因型）上的抗原识别受体，它是克隆表达的肿瘤特异性抗原中的一个代表。三个三期试验正在进行中，检测重组特异基因型（每个病人不同）联合使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）趋化DC细胞的作用。其中一个试验限制只能是先接受过细胞毒性化疗并得到完全缓解的患者参与，表明疫苗可能延长无进展生存期。而另外两个试验没有得到临床效果，可能是因为病人、疫苗生产方法的不同，或是这种方法根本就没有足够的作用。
&&&&&& 编码肿瘤抗原的病毒载体是正在评估的另一种生产疫苗的平台。这些方法寻求直接由病毒成分引起较强免疫应答以达到提高肿瘤抗原免疫性。由Bavarian-Nordic和美国国立肿瘤研究所开展的一个这类二期试验（125例）首先联合使用了编码前列腺特异性抗原的重组疫苗病毒和粘附分子B7-1、ICAM-1和 LFA-3；类似的重组鸡痘病毒载体随后使用在初免-加强（prime-boost）方案中，为达到更大的免疫激活效应同时使用了GM-CSF（全称为PROSTVAC）。除了疱疹病毒基因产物的反应，粘附分子的使用是为了让其进入被感染的细胞，使被感染的细胞拥有DC细胞的功能。尽管DC细胞在T细胞应答中的特异作用并不是仅仅这三种粘附分子的作用所能达到的。尽管疫苗并没有有效延长无进展生存期，但却对总生存期有所提高：25.1个月与对照组（使用空载体和盐水）16.6个月相比。一个大型的三期试验准备使用载体、载体加GM-CSF（DC佐剂或趋化剂）或空载体加CM-CSF。
&&&&&& 许多早期试验正在进行，它们联合使用确定的抗原和许多佐剂。这些抗原与DC细胞靶向单克隆抗体（例如DEC-205）或更进一步多种佐剂联用的长肽和病毒载体结合，能被传递给DC细胞。这种方案促进持续抗肿瘤免疫应答的效果还有待说明，特别是单用时的效果。
&&&&&& 疫苗治疗还包括以细胞为基础的方法。这种方案暗示了这样一种思想，活动的肿瘤细胞已经拥有了一套范围较广的肿瘤相关抗原（包括变异蛋白），如果肿瘤细胞被直接用作疫苗，那么选择抗原的难题将大大下降。对已公布的多种实质性肿瘤配对回顾性免疫治疗试验共173例进行meta分析发现，用所有肿瘤抗原对患者进行免疫虽然免疫率较低（8.1%），但仅要明显高于仅用分子学上确定的肿瘤抗原进行免疫所得到的目的临床反应（3.6%）。尽管这种方法中同源自体的肿瘤细胞是最好的免疫源，但是针对个体的疫苗生产较复杂，导致了异源性肿瘤细胞系的应用。在这些发难方案中，走在临床发展最前端的是Cell Genesys（已经不存在）公司开发用于治疗前列腺癌的GVAX。这种疫苗产品有两个工程化稳定分泌GM-CSF的前列腺癌细胞系组成。在经历了早期出现有前景的结果后，GVAX因为没有临床疗效而失败。这表明这种方法可能缺乏有效的致免疫性以及在商业化扩大生产这种疫苗制品所需要的改进，或是异源性肿瘤细胞系不能够有效覆盖个体前列腺病人的抗原特点谱。
&&&&&& 科学家们特别是在学术组织对开发DC细胞疫苗非常感兴趣。这种方案中DC细胞被单独从肿瘤病人体内分离，外源性载入抗原（肽类甚至肿瘤溶解产物）并激活，然后回输入病人体内。尽管存在一些效果和反应上的可观迹象，但还是没有阳性结果报道，同时鉴于细胞分离、体外操作和回输的复杂性，这种方法还没有得到生物技术制药公司的广泛认可。但是还是有一个值得注意的地方，将在后面做简单的讨论。
&&&&&& 总而言之，肿瘤疫苗作为&单药&取得成功或至少能量化这种成功还需要克服许多困难。首先，明确最佳肿瘤抗原标准还需要进一步完善。仅在特定靶肿瘤中表达可能不能充分评估产生保护性T细胞应答的能力。通过大规模光学谱确定肿瘤上与MHCⅠ相连的肽类可以识别那些潜在抗原靶点，但是这些肽类MHCⅠ复合体可能不是能充分激活免疫的排斥抗原（即可激活有效T细胞应答）。而且，肿瘤床中抗原的表达可以不同。实际上基于这种方法的异源性肿瘤细胞系是有局限性的，因为一个既定的病人肿瘤可能包含着疫苗产品没有的变异抗原。第二，用于激活抗肿瘤CD8+T细胞应答的最理想佐剂是否可以安全有效地用于人体这点还没有明确。设计的佐剂（合成佐剂）将成为其中一种物质，能刺激DC细胞成熟并达到能够促进肿瘤反应性CD8+T细胞产生的状态的。最后，尽管免疫所需要的条件最终都达到了，由于肿瘤中多种杀T细胞的免疫抑制机制，肿瘤特异性T细胞群的作用可能仍受限制。这并不是要将疫苗清除在免疫治疗之外，而是在没有其它免疫调节药物的情况下强调取得胜利所要面临的挑战。与肿瘤其它形式靶向治疗相同，发现和应用预测性生物标志物或诊断方法以确定可能从给定疫苗中获益的病人，这将是未来发展中的一个重要挑战。
前列腺癌有效的细胞疫苗？
&&&&&& 药物成功开发的最终标准时其在临床上的应用。作为肿瘤治疗可行方法的有效免疫治疗首先被批准的是治疗进展期前列腺癌的Provenge（sipileucel-T），它是在2010年4月被美国药品食品监督管理局（FDA）批准的。Provenge原来是作为自体DC细胞疫苗（由其同名公司Dendreon所开发），然而它实际上包含了一种没有完全了解的复杂混合物，这种混合物包括外周血单核细胞和细胞因子及肿瘤来源的分化抗原。这关键的三期试验中，分别在第0,2,4周利用白细胞去除法采集病人所有外周血单核细胞，回输前在37℃下于含有前列腺酸性磷酸酶（PAP，肿瘤相关分化抗原）与GM-CSF融合蛋白的培养基中培养36-44小时。这个结果与安慰剂结果对比，安慰剂组仅用三分之一的& 在2-8℃培养而且没有加入融合蛋白（剩下的三分之二被低温储藏，为随后补救方案的疫苗生产准备）。因此对照组不仅缺乏假定的免疫抗原，而且处理的方法也不同。
&&&&&& 临床结果肿瘤缩小或病程进展延迟的迹象较少。根据实质肿瘤反应评价准则的标准，341例试验组中只有1例得到部分反应。至少两例表现出前列腺特异性抗原下降至少50%，下降率2.6%与安慰剂组1.3%相比。然而中位生存期提高了4.1个月（25.8VS21.7），FDA认为这种方法对只有很少其它有效治疗方法的病人非常有意义。
&&&&&& 尽管Provenge很明确是一种以细胞为基础的治疗方法，但可能还包含其它机制。尽管大多数（66%）活着的患者表现出一种对融合蛋白的抗体反应，但能够产生可识别内源性PAP的抗体的人数却不多（28.5%）。而且无论是对融合蛋白还是PAP都没有产生T细胞应答。这些矛盾的地方可能反应出与肿瘤微环境相比外周血的监视抗肿瘤免疫应答的局限性。但是它们同时也反应出细胞制品中的其它未确定的成分可能起着重要作用。我们需要对Provenge的治疗机制做更进一步的研究，并利用安慰剂来确定不同细胞处理过程的作用。
&&&&&& 肿瘤缩小代表性地评估肿瘤治疗效果的标准，虽然缺乏肿瘤缩小与生存期提高相比令人诧异，但对于免疫治疗来说并不稀奇。通过临床前实验发现，当一种免疫应答形成时，对已存在肿瘤的作用可因为免疫调变（immune manipulation）而延迟。而且对一些使用疫苗后的临床病例的转移处进行活检发现存在着免疫浸润调节肿瘤死亡，这些肿瘤死亡通常伴随着广泛的水肿，随后是纤维化。这些组织病理学上的发现表明仅监测肿瘤的大小并不能充分地评价疫苗的整体治疗效果。随后将会讨论到这些想法应用于对CTLA-4抗体阻断作用的评价，并强调了根据免疫治疗生物学的新观点来修改肿瘤疗效标准的需要。
直接&驾驭&淋巴细胞的可能
&&&&&& 过继性输入有杀肿瘤能力的淋巴细胞理论上可以避开消除肿瘤抗原耐受并高效产生高活性效应T细胞这个难题。宿主淋巴耗尽会促进过继地输入T细胞移植成功，这个发现使恶性黑色素瘤患者体外培养扩增的肿瘤浸润淋巴细胞得以成功回输，并拥有显著的临床效果，其中一些得到了彻底而持久的疗效。
&&&&&& 逆转录病毒载体携带的克隆T细胞受体或由共刺激信号结构域扩增的嵌合抗原受体（CARs）使得T细胞培养方法和T细胞工程得以发展，这些进步将可以接受过继性T 细胞治疗患者的范围从含有活化的T细胞的可切除肿瘤患者扩大到了表达同源靶点的实质肿瘤患者这个更大的范围中。CARs的出现避开了肿瘤细胞有功能性抗原处理机制和通过MHCⅡ或Ⅰ类分子表达抗原的需要。转化T细胞可以通过人工CAR的亲和结构域（通常为一种scFv抗体）来识别完整的表面蛋白。然而，靶点选择的安全问题、这类靶点的缺乏、生产难度和成本以及许多病人中缺乏长期反应这些问题表明，在肿瘤微环境下适当地引导和激活T细胞还需要额外的干预。
&&&&&& 一种更为便捷的方法是治疗性的使用双特异性抗体，这种抗体可以同时结合TCR和肿瘤表面上的一种抗原。在B细胞淋巴瘤和白血病中，MicroMet已经应用了这种方法并取得了显著的临床疗效。然而这种方法有一系列的缺点，包括神经毒性和因为抗体片段快速清除而需要持续泵推输入。而且这种& 抗体更加强调为取得治疗效果而改变T细胞特异性的可能性。
有效疗法Ipilimumab的出现
&&&&&& 最近对晚期转移性恶性黑色素瘤ipilimumab三期试验的结果，是免疫治疗最重要的发展成果并给许多肿瘤病人带来希望。不仅在没有接受其它治疗的病人中观察到了明确的生存优势，而且这种优势的产生机制几乎可以肯定包括内源性T细胞应答调节。这个结果被认为非常有意义，在2011年3月FDA批准这种药的使用，并大力支持它在转移性恶性黑色素瘤病人身上使用，无论是应用于首次治疗还是复发治疗。
&&&&&& Ipilimumab是一种针对CTLA4的单克隆抗体，它的作用是调节T细胞功能，它经过了多年多机构研究，其中最为有名的是Allison与他的同事。CTLA4是一个关键的负调节因子，它在T细胞活化时募集于细胞膜表面，并与表达于DC细胞和其它抗原提呈细胞上辅助分子中B7家族的成员相结合。（Fig 2）CTLA4的有效封闭抑制进一步的激活和扩散，可以控制免疫反应过程和减少发生慢性自身免疫炎症的机会。能够诠释CTLA4在控制T细胞作用上重要功能的是表现型为Ctla4-/-小鼠，这种小鼠在早期死于进行性淋巴增殖紊乱。有趣的是CTLA4的封闭对T reg细胞的免疫抑制作用也非常重要，能够更进一步帮助弱化T细胞应答。抗CTLA4同时也能阻碍T reg的作用。
Figure 2 CTLA-4抗体阻断的生物学作用
&&&&&&& a 当与表达同源肿瘤抗原来源肽的抗原决定基和B7共刺激分子（CD80，CD86）相遇时，特异性抗肿瘤T细胞通过TCR和CD28传递信号而被激活。 b CTLA-4随后上调并特异性与B7相结合已减弱T细胞应答。 c Ipilimumab 阻断CTLA-4功能从而增强T细胞刺激和更有效的抗肿瘤反应。Ipilimumab 拮抗调节性T细胞上的CTLA-4，限制它们抑制抗肿瘤T细胞效应反应的功能。d& CTLA-4抗体阻断损害一些对正常组织抗原的耐受，引发炎症毒性对病人皮肤、垂体、和肠道有影响。
&&&&&& 肿瘤治疗中应用抗CTLA-4的基本原理是不限制以存在的抗肿瘤T细胞应答并可能激发新的应答。恶性黑色素瘤（和其它疾病）中存在TILs，这被广泛认可，它们可以为肿瘤抗原提供特异性。临床前研究用了小鼠模型，取得了满意的结果，使得两个公司（Pfizer和BMS/Medarex）将两种不同的抗CTLA4投入临床。二期试验没能达到使肿瘤消失的目的，但是BMS/Medarex认为这有很大的可能达到长期疗效，因此一个长期的随机三期试验首先在复发难治转移性恶性黑色素瘤患者中开展，以确定整个生存期。一组给抗体Ipilimumab，一组给抗体加恶性黑色素瘤分化抗原短肽（gp100），对照组仅给短肽。尽管Kaplan-Meier（Kaplan-Meier plots of）生存期在前几个月不能分离，在给予抗体的两组中同时获得了2倍的生存提高，这种提高在2年半后仍持续并包括某些患者的完全反应。
&&&&&& 在BMS/Medarex第二个502例以前患有不能治疗的转移性恶性黑色素瘤患者随机试验中，标准达卡巴嗪治疗中加入Ipilimumab与单用达卡巴嗪相比，整个生存期得到延长（11.2vs9.1月）。而且联合治疗有效地提高了随诊至少三年的病人的比例（20.8%vs12.2%）。尽管只有相对较少病人获得临床疗效，但这些研究很清楚地确定了Ipilimumab是一种有效的药物，它能给予通常情况下处于疾病晚期病人临床上有意义的疗效以及可能提高长期生存率。而且结果证实了这样的一个观点，激活T细胞腔（T cell compartment）本身就能够起到有意义的治疗效果。
&&&&&& Ipilimumab使用确实呈现出一些临床和科研上的难题。首先是观察到靶点上产生毒性概率较高。大于23%使用Ipilimumab治疗的病人引起了严重的（3-4级）不良反应，包括因为诱发炎症（可能为实际上是自身免疫诱发）而导致的结肠炎和下垂体炎。与达卡巴嗪联合使用时，大约20%表现出有意义的肝功能指标上升。然而毒性反应并不能精确的反应治疗的阳性结果，表明许多病人可能在遭受炎症病理过程中并没有达到抗肿瘤效果。鉴于前面提到的敲出小鼠的CTLA4会导致恶性感染，这些毒性反应可以预见。Ipilimumab的不良反应谱与标准肿瘤治疗的不同意味着执业肿瘤医生需要具备炎症紊乱处理的额外经验。
&&&&&& Ipilimumab第二个临床难题是与其抗肿瘤活性有关。与传统直接杀伤肿瘤细胞而至快速肿瘤缩小的细胞毒性治疗相比，Ipilimumab所引起的T细胞应答刺激要几个月才会出现。在这段时间中肿瘤有可能增大，而且这种增大的原因有可能是由炎症反应引起的。实际上有10%使用Ipilimumab的病人，在进行性疾病使用修订的WHO（世界健康组织）肿瘤大小评估标准下，达到了疾病稳定和生存期的延长。这种不常见的治疗反应方式导致了新的免疫相关标准的提出，这种标准可帮助临床上关于治疗的持续做出决定。（Box 3）
BOX 3 临床免疫治疗评估
&&&&&& 肿瘤学家通常通过测量肿瘤位置或大小来评估肿瘤治疗的疗效。这些标准包括RECIST和修订过的WHO准则。细胞毒性治疗，例如化疗，放疗和某些靶向药物的临床反应一般比较快（几个星期或几个月内），因为它们推测的作用机制包括一种对肿瘤细胞的直接作用。而且这些治疗通常会引起肿瘤大小的减小，因为肿瘤细胞遭受了凋亡或其他模式的程序性死亡。尽管肿瘤消除表明治疗有效，但这并不等于生存期的延长，因为可能出现致命性的耐药细胞。与之相比，免疫治疗诱导的肿瘤破坏可能较迟或甚至经历一段肿瘤明显增大时期。在Ipilimumab的临床试验中，10-20%的病人在开始治疗的三个月后出现了肿瘤增大现象，但随后在没有任何其它干预的情况下出现了肿瘤控制或消退时间的延长。这些病人与获得更迅速肿瘤消退的病人相比，表现出长期生存。延迟反应隐藏的机制还没有完全了解，但可能包括肿瘤中免疫浸润反应或仅仅只是需要较长的时间来产生可以实现杀肿瘤作用的足够T细胞。这种与众不同的生物学特点导致了免疫相关反应标准的提出，这给予了在免疫治疗中出现肿瘤增大而宣布治疗失败前更大的弹性。
&&&&&& Ipilimumab单药治疗的基本原理是，它的使用目前假定了治疗前病人体内存在肿瘤保护性T细胞，并且这些细胞在CTLA4阻断的情况下可以引发抗肿瘤反应。前面所提到的临床研究在实行时没有伴随有效免疫。在某些组中用了恶性黑色素瘤分化抗原的游离肽，但没有加入佐剂或是DC细胞成熟剂。尽管可以预期到，仅在免疫后CTLA4才能被诱导表达于肿瘤效应T细胞，但是在前外源性疫苗缺失情况下的临床反应表明肿瘤效应TILs表达CTLA4对&监测点&阻碍的反应，并且TILs获得了有效的肿瘤排斥功能。外源性和内源性疫苗的概念将在后面讨论。
&&&&&& 除了这些缺点，Ipilimumab给予了恶性黑色素瘤患者，尤其是那些在晚期没有其它使活下去方法的病人，可实现的希望。更广的说，它给予了一般肿瘤免疫治疗明确的临床可行性。这个结果同时也能加强对阳性反应者的推测生物指标的研究。Ipilimumab的其它应用也在努力探索中，一大群其它潜在的免疫治疗策略的发展和探索之门已打开，其中一些可能比针对CTLA4更为安全和有效。最后有希望将这种治疗和其它免疫治疗体系，例如有效的疫苗，相联合，疫苗这可以证明地说比临床抗CTLA4研究更早。
下一代T细胞免疫调节剂
&&&&&& 抗CTLA4在恶性黑色素瘤上的成功应用引起了对其它可用于激活T细胞应答抗体评价的兴趣。包括4-2BB OX40 CITR CD27 CD28在内，已知大量可作为激活抗体靶点的受体。（Fig.3）然而后者提出了一个警告，因为早期的一个抗CD28（TGN1412）临床试验中意外的细胞因子的释放产生了严重的毒性甚至死亡。这些严重的事件突出了免疫系统的能力和极端谨慎以及在使用任何免疫激活剂时保守试验设计的需要。使用在体内清除较快的药物而不是完整IgG可能帮助缓和这些毒性的可能，或至少可以加快诱导药物的清除。同样的想法应用于抗CTLA-4的治疗，替代的给药策略可能帮助提高其治疗指数。
Figure 3 T细胞免疫调节抗体治疗靶点
&&&&&& 除了通过TCR的特异性抗原识别，T细胞激活同时通过共刺激受体的正负信号之间的平衡来调节。这些表面蛋白不是TNF受体就是B7超家族的代表性成员。激活抗体针对激活作用的共刺激分子，阻断抗体针对负调节共刺激分子，这样可以增强T细胞刺激并促进肿瘤破坏。
&&&&&& LAG-3是另一个类似于CTLA-4主要起抑制作用的T细胞受体。对LAG-3的研究没有像CTLA4那样透彻，LAG-3大概类似于限制CD4+和CD8+ T细胞作用，并扩大T reg细胞的作用。同CTLA4相似，细胞内存在一个相当大的LAG-3池。（ref 66）但是其下降的作用结果并没有很显著，因为它可能通过其它调节分子来作用（例如 PD-L1）。然而这种现象表明拮抗LAG-3可能是拮抗CTLA4一个替代方法并可能有更为安全的一面。
&&&&&& 另一个替代方法开始得到一些临床认可，它以肿瘤床的免疫抑制作用作为目标。尽管疫苗或T细胞调节治疗成功了，但肿瘤中和免疫效应物质的作用可能限制了临床疗效。现阶段临床上较感兴趣的是PD-1/PD-L1(-L2)连接。PD-1由T细胞尤其是活化的T细胞表达，与可能靶细胞表达的PD-L1/L2配体相连，从而导致了T细胞无应答或&耗尽&。此连接作用被精确定义为限制慢性病毒感染的T细胞应答，但很快被认为同时在肿瘤中有限制免疫反应的作用。许多包括恶性黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、肝细胞癌和恶性胶质瘤在内的肿瘤被发现表达PD-L1（偶尔是PD-L2）。PD-L1的表达被发现与较差预后相关，并增加致瘤性PI3K通路的激活（例如通过PTEN消耗）。针对PD-1的抗体已经走向临床。在早期一期试验，它们表现出对多种肿瘤类型好的效果。与Ctla4-/-小鼠相比，PD-1-/-小鼠中可以观察到降低的毒性和一般较温和的自身免疫表型。然而，在小鼠中观察到的肺部感染和心肌病是临床上所需要关注的。一个重要的生物学的和临床问题是，肿瘤反应性TIL共表达多种抑制受体的效应功能是否能通过把单一受体作为目标而达到完全恢复还是需要相结合的&检查点&阻断来达到持续的肿瘤保护。
&&&&&& 其它针对T细胞免疫抑制的可能方法包括以诱导T reg细胞无效或耗尽为目标，因为在多数肿瘤床中，T reg细胞浸润可能同效应细胞（如PD-L1）表面的负调节分子一样能抑制效应T细胞的功能。然而目前还没有发现T reg特异性表面标志，像GITR和OX40这些蛋白短暂地表达可能可作为靶点（尽管它们同样表达与人类激活的效应T细胞上）。抗CD-25抗体可选择地消耗T reg，至少达到短期治疗，而且可帮助提高主动免疫的效果。最后低剂量的环磷酰胺可特异性针对T reg并在免疫方案中起减弱T reg的作用。
&&&&&& 如前所述，肿瘤床可产生例如IDO（吲哚胺2,3-加双氧酶）、精氨酸酶和前列腺素E2等许多可溶性调节因子以拮抗T细胞功能；在此这些化合物可诊断性地认为是有预测作用的生物标志物。通过小分子或抗体抑制剂来抑制它们作用，这些努力都可能增加到肿瘤免疫治疗组合中。而且随着对肿瘤脉管系统免疫调节功能认识的增加，&正常化&肿瘤血管与免疫治疗结合的治疗策略看上去是一个有意思的发展。的确，VEGF阻断导致了T细胞向肿瘤归巢的增加并且提高了小鼠中免疫治疗的效果。最后，例如STAT3和NF-кB信号通路和包括IL-6、IL-17、IL-23和肿瘤坏死因子&（TNF-&）的细胞因子这些肿瘤激活的炎症通路的重要性已被证明。对这些通路的抑制可能不仅能遏制肿瘤进展而且能提高免疫治疗的疗效。
联合免疫治疗
&&&&&& 传统上化疗药物的联合使用是肿瘤学的主要支柱。甚至在靶向药物治疗出现的近期，联合用药的发展被证明对增强反应和治疗耐药情况有益。理论上不同之处是靶向药物的联合可以在科学指导模式下合理地结合。没有理由不相信这同样可适用于免疫治疗。
&&&&&& 近期另一个小分子领域成功出现在恶性黑色素瘤治疗上。对于有V600E激活的BRAF变异的病人，Roche抑制剂vermurafenib在大于50%的病人中表现出显著的反应。然而很快就出现耐药（&1年），以致需要其它的治疗。尽管一种可行的有效办法是加入第二个作用于MEK的小分子抑制剂，以此来阻止肿瘤激活其它替代途径，但猜想肿瘤同样可以绕过这种方法。因此在缓解期产生长期持续的保护性免疫的前景令人瞩目，ipilimumab与vemurafinib联合使用的试验已在准备阶段。由于vemurafinib诱导的肿瘤死亡被认为可释放内源性肿瘤抗原，使得利用BRAF抑制作用激发初级新的T细胞反应然后由抗CTLA4促进的小分子和免疫治疗可能起增效作用。然而，这种联合用药的成功建立在这样一个假设上，BRAF抑制剂不会抑制免疫反应，在这种情况下两种药物可在临床上联合应用。
&&&&&& 在这例和其它所有免疫治疗与靶向或化疗药物相结合的实例中，评价联合用药的可能相互作用非常有争议。和细胞毒性化疗相似，小分子抑制剂可能作用于免疫系统的细胞阻碍DC细胞或T细胞功能，或是调节肿瘤或肿瘤微环境以达到抑制免疫的形成。另一方面这些抑制剂或细胞毒性药物可能成为T细胞的免疫激活剂，如最近提到的IAP拮抗剂或较出乎意料通常用于移植后免疫抑制药物的mTORC 1抑制剂雷帕霉素。同样地，尽管传统的观点认为化疗作用肯定是对免疫机制有害的，但是这种作用是药物剂量和（或）疗程依赖的。刺激的有效或无效依赖于针对免疫应答不同的阶段以及所使用的剂量/疗程，所以在设计临床试验方案时需要小心谨慎，以免有效的药物因为负相关作用或非最佳剂量疗程而被排除。
&&&&&& 传统化疗对免疫系统的影响较以前所认为的更为微妙。许多证据表明肿瘤细胞通多种方式死亡，一些方式的（凋亡）死亡实际上导致了对肿瘤的一种免疫应答提高。所谓的免疫源性细胞死亡在某种程度上是以ATP和高速泳动族蛋白B1的释放为特征的，它们通过嘌呤受体或TLR4分别激活局部浸润骨髓细胞核DC细胞。可以引起这种死亡痕迹的细胞毒性药物可能可以帮助诱导抗肿瘤免疫应答，因此是更好的可与免疫激活药物相联合的候选者。需要重申的是需要小心谨慎地确保在其剂量和疗程不抑制效应CTLs的情况下使用这些药物。
&&&&&& 最后需要考虑免疫治疗药物自身结合的可能。为使其更为合理化，我们需要回到免疫应答的多步骤，这些步骤需要用来说明抗肿瘤免疫形成,（Fig 1）思考在每种药所控制下的步骤，评估可能的降低而不是升高治疗指标的重叠或毒性增效作用。例如，联合抗CTLA4和抗PD-1在生物学上合理，因为这两种药物在两个不同的阶段去除了T细胞活化的阻碍：增殖（CTLA4）和效应物功能（PD-1）。然而可能同时出现相似的有害反应，强调需要仔细明确可能的严重毒性。
改良疫苗使用
&&&&&& 作用于效应物阶段的药物（例如，抗PD-1或免疫抑制拮抗剂）只能重激活已存在的T细胞。作用于增殖或激活阶段的药物（例如ipilimumab）不仅可能加强已存在的应答而且可能激活新的应答。因此无论哪一种都可以与疫苗联合，因为疫苗作用的位点是肿瘤免疫治疗的起点。然而有争议的是在这种目的下，该选择外源性还是内源性疫苗。
&&&&&& 外源性疫苗包括在以DC细胞为靶点的抗体传递媒介中引入预先选择的抗原，可以在病毒载体中编码也可作为合适的佐剂和载体中的肽类或蛋白给药。这种方法在产生针对感染源预防性和保护性免疫非常有效。实际上这些疫苗代表了医学界中的最伟大成就。未能引起最理想的DC细胞抗原处理或提呈的不佳方案，非最佳佐剂的使用，或是没有联合使用的可促进T细胞应答或克服肿瘤床中免疫抑制作用的药物，这些使得疫苗在肿瘤治疗中很少引起注意。除此之外，抗原选择可能错误，因为耐受屏障太强而不能产生保护性T细胞和高亲和T细胞受体，或不能在肿瘤细胞表面上产生足够数量的T细胞受体配体（MHCⅠ复合物）。
&&&&&& 内源性疫苗包括原位产生的病人自身肿瘤游离抗原。这需要通过在帮助内源性DC细胞捕获、处理和提呈肿瘤来源抗原的情况下诱导肿瘤细胞死亡来完成。尽管比外源性疫苗更难操控，但内源性疫苗在使肿瘤细胞内成打上百变异的提呈上有明显的优势。甚至只是这些的一小部分形成作为T细胞抗原提成肽的MHC连接肽，新抗原，它们肯定不会受到中枢耐受的抑制。单用化疗是否做够诱导这种原位免疫并不确定。因为肿瘤微环境中强大的免疫抑制通路作用，可能需要额外的信号以极化肿瘤浸润抗原提呈细胞，这可以通过病原体来源信号或其它DC细胞成熟药物来实现。
&&&&&& 另一项最近在尝试的内源性疫苗利用肿瘤内注射设计的可分泌GM-CSF的条件性复制疱疹病毒。这些溶细胞病毒（OncoVex）以进入临床三期试验，引起感染的肿瘤细胞溶解，此时GM-CSF释放可能提高肿瘤微环境中DC细胞的功能，以此激活针对自体肿瘤抗原的应答。第二种方案利用细胞毒治疗联合CD40竞争性抗体。然而这种方法被预期是DC细胞引起的抗肿瘤T细胞的增加，但结果却是巨噬细胞调节杀伤的重要功能在其中表现出来。最后化疗与TLR激活剂可提供肿瘤抗原释放和肿瘤抗原提呈细胞激活的重要物质。
&&&&&& 尽管有较长的历史，却不经常引起人注意，肿瘤免疫治疗仍处在新科学与临床实践的早期。然而作为同时受到生物制药厂和临床肿瘤协会青睐的令人心动的治疗策略，最近的研究结果使得肿瘤免疫治疗的时代最终来临。这种转变与另一项肿瘤免疫治疗领域中的发展同时出现。在鉴于主流观点认为免疫系统在控制肿瘤中有能到自我平衡，二十世纪的多数时间都关注在肿瘤&免疫监视&上。当致瘤性或其它变异出现时，免疫系统理论上应当反应并阻止肿瘤的形成，至少在免疫系统正常时应该这样。这个概念被修改为&免疫编辑&，在包括耐受可能的整个疾病发展过程中识别肿瘤和宿主之间复杂和动态的相互作用。然而在二十一世纪，我们认为相继出现的前临床和临床数据直接弱化了&耐受和免疫抑制&的主要作用。这就将免疫应答是否有预防性的自我平衡功能这个问题搁置下来。肿瘤发生和逃脱控制既不是因为肿瘤细胞与其相应正常组织过于相似以致于无法激发足够的免疫功能，也不是因为它们擅于诱导外周性耐受。然而ipilimumab既可作用诱导新应答也可以增强已存在的应答，抗PD-1抗体的临床作用似乎更倾向于克服耐受而不是产生抗肿瘤T细胞的全部功能。
&&&&&& 肿瘤治疗时代的来临恰到好处。特异性针对肿瘤起源途径的一系列抑制剂的出现，开始在一些方面展现出有意义的有时甚至惊人的反应。然而即使在诊断明确的人群中，这些反应可以使短暂的或需要持续用药。这些治疗方案可以适当的免疫治疗相匹配，在肿瘤缩小和缓解时激活病人的免疫系统，这可能是保证反应转变为长效持久获益的最好办法。同准备和指导免疫反应的附加药物的发展一样，需要有合适的药代动力学生物标志来判断一个给定的免疫治疗是否达到预期的效果，以及用来确定哪种方案适合哪种患者的合适的诊断标准。最后科学家、药物研发者和肿瘤学家需要一起制定出评价免疫治疗效果的新标准。它们的作用机制如此独特，与传统的细胞毒性药物相比既机械又短暂，以致于不能期待它们按照前一代所制定的标准一样起作用，即便是结果可能最终是有效的。