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蛋白质的紫外吸收和呈色反应
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蛋白质的紫外吸收和呈色反应：
蛋白质含芳香族氨基酸，在280nm波长处有特征性吸收峰，用于定量测定。
蛋白质分子中的多种化学基团具有特定的化学性能，与某些试剂产生颜色反应，可用于定性医|学教|育网搜集整理、定量分析。如蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，在碱性溶液与硫酸铜反应产生红紫色络合物（双缩脲反应）。酪氨酸含酚基，与米伦试剂生成白色沉淀，加热后变红色。Folin-酚试剂与酪氨酸反应生成蓝色。色氨酸与乙醛酸反应，慢慢注入浓硫酸，出现紫色环。
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　|　　|　　|　蛋白质的定量测定实验（Lowry法、考马氏亮蓝G－250染色法、紫外分光光度法和双缩脲法）
蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：
物理性质：紫外分光光度法
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体金法
染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法
其他性质：荧光法
蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。
常用的测定蛋白质含量方法的比较
（μg/ml）
蛋白的差异
特&&&&&&&&&&&&&&&&
凯氏定氮法
标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定
紫外分光光度法
灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响
重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大
Folin-酚试剂法
灵敏，费时较长，干扰物质多
考马氏亮蓝G-250
灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移
灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长
由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。
一、 Folin－酚试剂法（又名Lowry）法
目前实验室较多用用Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。
【原&&& 理】
蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。
【操&&& 作】
1、标准曲线的制备：
按下表操作，在中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml蛋白标准溶液，用生理盐水补足到
1ml。加入5ml的碱性酮试剂，混匀后室温放置20分钟后，再加入0.5ml酚试剂混匀。
编&&&&&&&&
蛋白标准（ml）
0.9% NaCl（ml）
碱性酮试剂（ml）
混匀后室温(25℃)放置20分钟
酚试剂（ml）
30分钟后，以第1管为空白，在650nm波长比色，读出吸光度，以各客的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。
2、蛋白质测定。
稀释（或其它蛋白样品浓度）：准确吸取0.1ml血清，置于50ml中，用生理盐水释释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只，分别标以1、2、3号，按下表操作：
稀释标本(ml)
稀释标准液(ml)
0.9%NaCl(ml)
碱性酮液(ml)
混匀后于室温放置20分钟
酚试剂(ml)
混匀各管，30分钟后，在波长650nm比色，读取吸光度。
【计&&& 算】
1、以测定管读数查找标准曲线求得血清蛋白含量。
2、无标准曲线时，可以与测定管同样操作的标准管按下式计算蛋白含量：
血清蛋白含量（g%）＝
【试剂配制】
1、碱性酮溶液：
甲液：Na2CO32g溶于0.1mol/L NaOH 100ml溶液中。
乙液：CuSO4&5H2O 0.5克溶于1％酒石酸钾100ml中。
取甲液50ml，乙液1ml混合。此液只能临用前配制。
2、酚试剂：
取Na2WO4&2H2O
100g和Na2MoO3&2H2O
25g，溶于水700ml中，再加85％H3PO4，50ml和HCl（浓）100ml，将上物混合后，置1500ml园底烧瓶中温和地回流10小时再加硫酸锂（Ll2SO2&H2O）150g，水50ml及溴水数滴，继续沸腾15分钟以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml，然后过滤，溶液应呈黄色（如带绿色者不能用），置于棕色瓶中保存。使用标准NaOH滴定，以酚酞为指示液，而后稀释约一倍，使最后浓度为lN。
3、蛋白标准液（0.1mg/ml）
准确称取10mg牛血清蛋白，在100ml中加生理盐水至刻度。溶后分装，放于－20℃冰箱保存。
【注意事项】
1、缓冲液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、丙酮……等均会干扰Folin-酚反应。
2、当酚试剂加入后，应迅速摇匀（加—管摇一管）以免出现浑浊。
3、由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红外光区呈现较宽吸收峰区。不同实验室选用不同波长，有选用500或
540nm，有选用640nm，700或750nm。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选用波长650nm。
二、考马氏亮蓝G－250染色法
此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。
【原&&& 理】
考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与
595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。
【操作步骤】
1、标准曲线的制备：
按下表操作，在试管中分别加入0、20、40、80、100微克蛋白标准溶液，用水补足到100微升，加入3ml的染色液，混匀后室温放置15分钟。
编　　　号
蛋白标准(ml)
染色液(ml)
在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。
2、血清蛋白质测定
稀释血清（或其它蛋白样品溶液），准确吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作。混匀后室温放置15分钟，在595nm波长比色，计算蛋白质浓度。
试剂(毫升)
蒸　馏　水
蛋白质标准
染　色　液
每100毫升血清中蛋白质的含量（g％）＝
1、考马氏亮蓝G－250染色液：
称取100mg考马氏亮蓝G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100 毫升85％的磷酸，加入稀释到1升。
2、蛋白标准（0.1mg/ml）
准确称取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装，－20℃冰箱保存。
【注意事项】
1、常用试剂的干扰：有些常用试剂在测定中会受到不同程度的干扰。、巯基乙醇、蔗糖、甘油、及少量有较少影响，而1％、1％
TritonX-100及1％Hemosol的干扰严重。
2、显色结果受时间与温度影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行。
3、考马氏亮蓝G－250染色能力很强，特别要注意的清洗。颜色的吸附对本次测定影响很大。可将测量杯在0.1mol/L
HCl中浸泡数小时，再冲洗干净即可。
三、紫外分光光度法
紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是将蛋白质溶液直接在紫外中测定的方法，不需要任何试剂，操作很简便，而且样品可以回收。
【原&&& 理】
蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种含量的支配。另外或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。
【操&&& 作】
将待测蛋白质溶液适当稀释K倍，在紫外分光度计中分别测定样品在10mm光径石英中，分别在280nm及260nm两种波长下的吸光度值A280和A260。
【计&&& 算】
1、当蛋白样品的吸光收比值A280／A260约为1.8，可用下面的公试进行计算：
蛋白质浓度（mg/ml）＝（1.45A280
－0.74A260）&K
2、也可以先计算出A280／A260的比值后从下表中查出校正因子
“F”值，由下面的经验公式计算出溶液的蛋白质浓度。同时从表中还可以查出样品中混杂的核酸的百分含量：
蛋白质浓度（mg/ml）＝F&A280 &K
注：一般纯净蛋白质的光吸收比值A280/A260约为1.8，而核酸A280/A260的比值约为0.5。
【方法评价】
操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。但核酸含量小于20％或溶液混浊、则测定结果误差较大。在使用上表和公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在
280nm及260nm处的光吸收值也不尽相同，故计算结果有一定误差。
四、双缩脲法【原&&&
利用半饱和硫酸铵或27.8％硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质—酶、蛋白等的分离和纯化。
蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。
但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物
以及分子内有—CH2—NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。本实验用27.8％硫酸钠—亚硫酸钠溶液稀释血清，取出一部分用双缩脲反应测定蛋白质的含量，剩余部分则用过滤，使析出的球蛋白与白蛋白分离，取出滤液用同一反应测定白蛋白的含量。与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白与球蛋白之比即所谓的白／球比值。
【操&&& 作】
1、取中试管4支，分别标以“1”、“2”、“3”、“4”，吸取27.8％硫酸钠—亚硫酸钠1ml，置“1”管中备用。
2、吸取血清0.2ml于另一试管中，加27.8％硫酸钠一亚硫酸钠4.8ml，用拇指压住管口倒转混合5～6次，放置约15秒，用1ml刻度管吸取1ml置于管
“4”中（测定管）。
3、将剩余的血清混悬液（如滤液不清，可重复过滤，直至澄清为止），用另一支1ml刻度取此液1ml，置于管
“3”（白蛋白测定管）。
4、另用一支1ml刻度吸取标准血清1ml，置管“2”中（标准管）。
5、于上述4支试管中分别加入双缩脲试剂4ml，混匀。
6、在室温下放置10分钟后，以管“1”（空白管）调零，在540nm的波长下进行比色，分别记录“2”、“3”、“4”管的光密读数
【计&&& 算】
血清球蛋白含量（克／100ml）＝总蛋白含量—白蛋白含量
白：球比值＝白蛋白含量／球蛋白含量。
【临床意义】
正常人每100ml血清中含蛋白质6～8克，平均7克左右，白／球比为1.5～2.5:1。长期营养不良，肝脏疾病，慢性肾炎时，总蛋白含量降低；大量失水（如呕吐、腹泻）时则升高。肝脏疾病、慢性肾炎以及慢性传染病有大量抗体生成时，白／球比值变小，甚至倒置。
【试剂与器材】
（一）器材
1、中试管 6支。
2、刻度吸管：0.2ml、5ml、10ml、1ml。
（二）试剂
1、27.8％硫酸钠—亚硫酸钠溶液：取浓硫酸2ml加到900ml蒸馏水中，将此含酸蒸馏水加于盛有无水硫酸钠208克及无水亚硫酸钠
70克，的中，边加边搅拌，待液解后全部移至1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。取此溶液1ml，加蒸馏水24ml，检查其pH，应为7或略高于
7，本试剂应贮于25℃温箱中。
2、双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5克及石酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）6克，分别用适量蒸馏水溶解，混合后加入10％NaOH溶液300ml，最后加蒸馏水至1000ml。
3、标准血清：取经凯氏定氮标定后的血清用15％的 NaCl溶液稀释25倍，贮于冰箱中备用。
【注意事项】
（一）硫酸钠的溶解度与温度有关，温度低于30℃易结晶析出，故室温较低时应在37℃或进行保温。
（二）血清样品必须新鲜，如有细菌污染或溶血，则不能得到正确的结果。
（三）含脂类较多的血清，可用乙醚3ml抽提一次后再进行测定。
自：－250.htm
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以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。第一章 蛋白质的结构与功能
蛋白质的结构与功能
一、目的要求
掌握蛋白质在生物体中的重要性及其特点。掌握氨基酸的基本结构和分类、氨基酸的重要理化性质；掌握蛋白质的分子结构；蛋白质结构与功能的关系及蛋白质的重要理化性质。
二、授课内容及时间分配（50分钟×6）
　1．蛋白质的元素组成及氨基酸&
　3．蛋白质的一级结构
　4．蛋白质的二级结构&
　5．蛋白质的三级结构&
　6．蛋白质的四级结构&
　7．蛋白质的一级结构与功能的关系&
　8．蛋白质空间结构与功能的关系&
　9．蛋白质的理化性质&
　10．蛋白质的分离纯化&
　11．多肽链中氨基酸序列分析&
　12．小结&&
三、讲授重点
　1．蛋白质的分子组成
　2．蛋白质分子的一、二、三、四级结构
　3．蛋白质的结构与功能的关系
　4．蛋白质的理化性质
四、讲授难点
　　1．蛋白质的空间构象
　　2．蛋白质空间结构与功能的关系
　　3．蛋白质分离纯化的方法和原理
　　4．多肽链中氨基酸序列分析
五、教学法
　　充分利用多媒体课件、动画等多种教学手段，加强分子模型直观教学。讲课要采用启发诱导，实例分
析，习题作业，课堂讨论等多种形式，生动活泼，突出重点和难点，以调动学生的思维活动，培养分
析问题和解决问题的能力。
　　多媒体教学课件、动画短片、投影仪、分子模型、粉笔、黑板刷、激光教鞭、洁净白大衣等
七、授课教师
八、授课对象
九、授课地点
十、教科书
人民卫生出版社，
十一、参考书
&&& 1．王镜岩主编，《生物化学》第三版，北京，高等教育出版社，2002，上册
&&& 2．童坦君等&
北京大学医学出版社，北京2003
&&& 3．贾弘A等
北京大学医学出版社，北京2003
&&& 4．David
L. Nelson, et al. Lehninger Principles of Biochemistry. 3rd
ed. Worth Publishers, New York. 2000
&&& 5．Jeremy
Berg, John Tymoczko, Lubert Stryer. Biochemistry. 5th ed.
W. H. Freeman and Company, New York
十二、讲稿
蛋白质的结构与功能
Chapter 1& Structure
and function of protein
蛋白质(Protein)是生物体的基本组成成分之一，约占人体固体成分的45％。蛋白质在物质代谢（metabolism）、机体防御（defence）、血液凝固（coagulation
of blood）、肌肉收缩（construction
of muscle）、细胞信息传递（transduction
of cellular signal）、个体生长发育（growth
and development）、组织修复（repair
of tissues）等方面发挥着不可替代的重要作用，它是生命活动的物质基础，没有蛋白质就没有生命。
蛋白质元素组成的特点：各种蛋白质的含氮（nitrogen）量很接近，平均为16％。测定生物样品的含氮量就可按下式推算出蛋白质的大致含量。
每克样品中含氮克数×6.25×100=100克样品中蛋白质含量(克%)
氨基酸(amino
acid)是组成蛋白质的基本单位。组成人体蛋白质的氨基酸有20种，它们都有自己的遗传密码，不同的氨基酸其侧链(R)各异，除甘氨酸外均属L-α-氨基酸
(L-α-amino acid)，其结构通式如下：
(六)超速离心
超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的&&&
分子量。它是利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation
coefficient，S)表示，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。
三、多肽链中氨基酸序列分析
蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级结构的测定，主要有以下几个步骤：
分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品；
取一定量的样品进行完全水解，再测定蛋白质的氨基酸组成；
3. 分析蛋白质的N-端和C-端氨基酸；
采用特异性的酶（如胰凝乳蛋白酶）或化学试剂（如溴化氰）将蛋白质处理为若干条肽段；
5. 分离纯化单一肽段；
测定各条肽段的氨基酸顺序。一般采用Edman降解法，用异硫氰酸苯酯进行反应，将氨基酸降解后，逐一进行测定；
至少用两种不同的方法处理蛋白质，分别得到其肽段的氨基酸顺序；
将两套不同肽段的氨基酸顺序进行比较，以获得完整的蛋白质分子的氨基酸顺序。
近年来，由于核酸的研究在理论上及技术上的迅猛发展，人们开始通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列。蛋白质中的氨基酸顺序是从信使RNA(mRNA)中核苷酸序列翻译过来的，因此只要找到相应的mRNA测出它的核苷酸顺序，氨基酸序列也就清楚了。
此方法先分离编码蛋白质的基因，测定DNA序列，排列出mRNA序列，按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列。目前多数蛋白质的氨基酸序列都是通过此方法而获知的。
四、蛋白质空间结构测定
通常采用X射线晶体衍射法(X-ray
diffraction)，首先将蛋白质制备成晶体。X射线射至蛋白质晶体上，可产生不同方向的衍射，X线片则接受衍射光束，形成衍射图(电子密度图)。然后借助计算机对这些斑点的位置、强度进行计算，可得出其空间结构。此外，近年建立的二维磁共振技术，也已用于测定蛋白质三维空间结构。
由于蛋白质空间结构的基础是一级结构，近年来根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构，受到科学家的关注。预测蛋白质空间结构的方法主要有两类。第一类方法是采用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。第二类方法是通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出――级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。
1。蛋白质是重要的生物大分子，在体内分布广泛，含量丰富，种类繁多。每一种蛋白质都有其特有的生
白质的基本组成单位为20种a氨基酸。氨基酸为两性电解质，在一定的pH条件下，其分子上的净电荷为零时，称为该氨基酸的等电点（pI）。氨基酸通过肽键相连而成肽。小于10个氨基酸组成的肽称为寡肽，反之则称为多肽。人体内有许多重要的生物活性肽。
白质根据组成成分可分为单纯蛋白和结合蛋白，后者含有非氨基酸辅基成分
级结构是蛋白质构像的基础，亦是其功能的基础；次级键对于蛋白质构像的维持亦起着重要的作用
一级结构是指蛋白质氨基酸的排列序列，他们以肽键相连，形成肽键的6个原子构成一个肽平面或肽单元
二级结构是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，主要形式有
、β-折叠、β-转角和无规卷曲。蛋白质分子中两个或三个具有二级结构的肽段相互接近，形成一个具有特殊功能的空间结构称为模序（motif）
，它具有具有特征性的氨基酸结构，并发挥特殊的功能。多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常在空间折叠中靠近，彼此相互作用形成规则的二级结构聚集体，称为超二级结构。在较大的蛋白质分子中，相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个空间上明显突出的局部区域，与分子整体以共价键相连，具有不同的生物学功能，称为结构域
(domain) 。
三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，主要靠次级键维持
四级结构是指蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，主要靠疏水键维持
蛋白质特定的生物学功能是由其氨基酸序列（即一级结构）决定的，空间构像亦可影响其理化性质及生物学活性
用多种成熟的技术与方法对蛋白质进行纯化、分析和功能鉴定
十三、复习思考题
1.名词解释：
肽单元(peptide
变（别）构效应(allosteric
蛋白质的变性（protein
denaturation）
蛋白质pI（protein
isoelectric point）
2.蛋白质的基本组成单位是什么？按侧链的结构和功能不同可分为几类？
3.蛋白质的二级结构有几种？各有何特征？
4.蛋白质变性的本质是什么？变性因素有哪些？变性后有什么改变？
5.蛋白质分离纯化有哪几种方法运用了蛋白质的等电点？根据是什么？
6.维持蛋白质一
、二、三、四结构的化学键各有哪些？
7．试以血红蛋白为例概述蛋白质空间构象与功能的关系。细胞库/细胞培养
ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
实验方法原理
由于蛋白分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。由于核酸在280波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260nm的光吸收，通过计算可能消除其对蛋白质测定的影响，因此溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm之光密度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱色谱分离中）广泛应用。此法的缺点是（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差，（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。
试剂、试剂盒
一、试剂1．标准蛋白溶液准确称取经微量凯氏定氮法校正过的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/ml的溶液。2．待测蛋白溶液配制成浓度约为1mg/ml的溶液二、操作1．标准曲线的绘制按下表分别向没支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2．样品测定取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出经稀释的待测蛋白质的浓度。三、其他方法1. 将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质浓度。计算蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260式中A280和A260分别是该溶液在280nm和260nm波长下测得的光吸收值。此外，也可先计算出A280/A260的比值后，从下表查出校正因子F值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将F值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。蛋白质浓度（mg/ml）=F×1/d×A280×N式中A280为该溶液在280nm下测得得光吸收度值，d为石英比色杯得厚度（cm），N为溶液得稀释倍数。紫外吸收法测定蛋白质含量得校正因子2. 对于稀蛋白质溶液，还可用215nm和255nm的吸收差来测定浓度。从吸收差△Ａ与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。吸收差△Ａ＝Ａ215－Ａ225式中的A215和A225分别式蛋白质溶液在215nm和225nm波长测得的光吸收值。此法在蛋白质含量达20-100μg/ml的范围内，是服从Beer定律的。氯化钠、硫酸铵以及1×10-1mol/l磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是1×10-1mol/l乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215nm波长下的吸收较大，不能应用，必须降至5×10-3mol/l才无显著影响。由于蛋白质的紫外吸收峰常因pH的改变而有变化，故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH，最好与标准曲线测定的pH一致。3. 如果已知某一蛋白质在280nm波长处的吸收值[A1%1cm]，则取该蛋白质溶液于280nm处测定光吸收值后，便可直接求出蛋白质的浓度。
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