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高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定污泥中的合成酚类抗氧剂
作者单位：
中国科学院生态环境研究中心 北京市海淀区双清路18号 100085
母体文献：
第十届全国生物医药色谱及相关技术学术交流会论文集
会议名称：
第十届全国生物医药色谱及相关技术学术交流会
会议时间：
会议地点：
主办单位：
中国化学会色谱专业委员会,北京色谱学会
在线出版日期：
万方数据知识服务平台--国家科技支撑计划资助项目（编号：2006BAH03B01）(C)北京万方数据股份有限公司
万方数据电子出版社主题：【第六届原创】蒸馏后滴定法测污泥中脂肪酸的两种蒸馏方法比较
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发表于： 17:00:59
维权声明：本文为kessel原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。
摘要：分别采用传统水冷六联电炉法与STEHDB型智能一体化蒸馏仪两种蒸馏方式，对污泥中脂肪酸离心后的污泥上清液样品进行蒸馏。对两种蒸馏方法针对不同的样品进行检测，两方法的相对偏差在-0.82%-1.55%，对同一样品进行8次重复性测定实验，六联电炉法和智能一体化蒸馏法的相对标准偏差分别为1.26%和1.02%，智能一体化蒸馏法的平行性较好。采用智能一体化蒸馏仪法测定脂肪酸，结果可靠准确，操作方便简单，节电节水环保。关键词：蒸馏；脂肪酸；智能一体化蒸馏仪；电炉0 前言脂肪酸(CnH2n + 1COOH 及CnH2n - 1COOH) 是污水处理厂污泥消化的主要产物。污水一级处理过程中沉淀产生的生污泥和生物处理过程中产生的活性污泥，混合后经浓缩进入消化罐，在密闭条件下，经中温或高温消化和厌氧菌的发酵作用，将其中的饱和及不饱和脂类、酯类、蛋白质、糖类等降解成为饱和或不饱和脂肪酸。脂肪酸（挥发性脂肪酸）属于可以在常压下蒸馏的水溶性脂肪酸，它是鉴定污泥消化好坏的标志之一。1 方法概述依据CJ/T 221―2005《城市污泥 脂肪酸的测定 蒸馏后氢氧化钠滴定法》[1]的要求进行实验对比。1.1& 方法原理将挥发性脂肪酸从污泥上清液中加热蒸馏出来，用水吸收后与标准碱反应，测定挥发性脂肪酸的含量。1.2测量器具水冷电炉法：25mL、50mL、100mL、200mLA级量筒，5mL定量器，100mL离心管、500mL烧瓶和直型冷凝管的蒸馏装置，250mLA级磨口三角瓶，25mLA级碱式滴定管，六联电炉，风冷消解器，离心机；& & & & & STEHDB型智能一体化蒸馏仪[2]法：25mL、50mL、100mL、200mLA级量筒，5mL定量器，100mL离心管、500mL配套蒸馏仪蒸馏装置，250mLA级容量瓶，25mLA级碱式滴定管，风冷消解器，离心机，STEHDB型智能一体化蒸馏仪；3.2& 结果分析3.2.1 我们对日常生产中的样品进行了对比实验，数据见表1。表1的结果表明，两种蒸馏方式数据偏差较小，相对偏差在C0.82%到1.55之间。3.2.2 对同一样品（样品A）进行重复性测定实验，数据见表2。我们用两种不同的蒸馏方式同时对同一种样品重复性测定实验（共重复性检测8次），数据对比结果见表2。表2的结果表明，两种蒸馏方式对同一样品重复性测定结果无明显差异。4&
传统水冷电炉法和智能一体化蒸馏仪法对比我们对两种蒸馏方法进行了对比分析，具体见表3：5结论分别用传统水冷电炉法和STEHDB型智能一体化蒸馏仪法对污泥中脂肪酸离心后的污泥上清液样品进行蒸馏，结果表明两种处理方法均有较好的精密度和准确度。传统水冷六联电炉法耗时长、安全性差，且水冷不仅浪费水资源，还需使用乳胶管，乳胶管在电炉烘烤后极易老化，需要经常更换，安全性差。STEHDB型智能一体化蒸馏仪法比传统水冷电炉法的精密度、准确度更高，且操作安全简便，蒸馏效率高、冷凝效果好，并能蒸馏终点检测和自动停止加热功能，适用于样品数量多、工作节奏高的情况。[参考文献][1] 中华人民共和国城镇建设行业标准CJ/T 221-2005《城市污水处理厂污泥检验方法》（5） 城市污泥 脂肪酸的测定 蒸馏后滴定法。[2] 济南盛泰电子科技有限公司 《智能一体化蒸馏仪 STEHDB-106-3》国家发明专利证书，专利号：ZL.4。
该帖子作者被版主
郭景t 加 10 积分，
2经验，加分理由：原创
17:01:55 Last edit by kessel
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这个跟城市污水处理厂，有关不
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楼主& 你这个表格时怎么整上来的& & 我就搞不好
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介绍的非常详细，值得参考学习
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原文由 wulin321(wulin321) 发表:楼主& 你这个表格时怎么整上来的& & 我就搞不好这种表格很简单，就是从word里面把表格选中，另存为图片。然后再在论坛发帖子时插入到文档中就可以了
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原文由 妮(v2721409) 发表:这个跟城市污水处理厂，有关不是北京一家排水集团的水质监测中心的实际数据
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原文由 盛泰电子(sh102299) 发表:原文由 妮(v2721409) 发表:这个跟城市污水处理厂，有关不是北京一家排水集团的水质监测中心的实际数据哦，我就觉得像是污水处理厂会做污泥的
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原文由 盛泰电子(sh102299) 发表:原文由 wulin321(wulin321) 发表:楼主& 你这个表格时怎么整上来的& & 我就搞不好这种表格很简单，就是从word里面把表格选中，另存为图片。然后再在论坛发帖子时插入到文档中就可以了也是用图片上传吗
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一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法
申请（专利）号：
申请日期：
公开(公告)日：
公开(公告)号：
主分类号：
G01N21/78,G01N21/00,G,G01,G01N,G01N21
G01N21/78,G01N21/00,G,G01,G01N,G01N21,G01N21/78,G01N21/00
申请（专利权）人：
北京工业大学
发明（设计）人：
李冬,张玉龙,范丹,张肖静,梁瑜海,何永平,张翠丹,吴青,门绚,杨胤,苏庆岭,周元正,曾辉平,张杰
主申请人地址：
100124 北京市朝阳区平乐园100号
专利代理机构：
北京思海天达知识产权代理有限公司 11203
国别省市代码：
一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法，其特征在于：1)试剂的制备：将0.1000g考马斯亮蓝G?250溶于50ml体积百分比浓度为95%乙醇溶液中，加入100ml质量百分比浓度为85%的浓磷酸，然后用蒸馏水补充至200ml，得到Bradford储备液，使用时，按体积比为1:5的比例用蒸馏水稀释Bradford储备液，即200ml储备液加800ml蒸馏水，得到Bradford使用液；配制0.15mol/L的NaCl溶液；2)标准曲线的测定：称取0.1000g牛血清蛋白溶于玻璃烧杯中，并移至1000mL的容量瓶中，蒸馏水定容，配制100μg/mL的牛血清蛋白标准液；在试管中分别加入0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL牛血清蛋白溶液，不足1ml者，添加0.15mol/L的NaCl溶液使成1ml；然后加入5.0ml?Bradford使用液，立即用漩涡振荡器摇匀；显色5?8min后，用分光光度计在λ=595nm测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，获得校正吸光度值，并以此绘制标准曲线；3)污泥的预处理：取50ml污泥样品于离心管中；另取一离心管，加自来水与污泥样品配平，在室温下以8000r/min离心机离心15min；倒掉上清液，加入磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液Na3PO4浓度为0.05mol/L，NaCl浓度为0.15mol/L且pH值为7，将污泥稀释至原体积；然后将污泥摇散，超声处理3min；4)蛋白质的提取：将预处理的污泥放在80℃水浴锅内，加热30min，每隔10min将污泥摇匀一次；然后冷却配平；最后在8000r/min离心机内离心15min，取上清液测定，剩余污泥测定MLSS和MLVSS；5)蛋白质的测定：取一定体积待测溶液于试管中，加入0.15mol/L
的NaCl溶液使成1ml；再加入5.0ml?Bradford使用液，立即用漩涡振荡器摇匀，另取1ml?NaCl溶液同法操作，加入Bradford试剂做空白对照；显色5?8min后，用分光光度计在λ=595nm测定吸光度值；用测得的吸光度值减去空白的吸光度值，得到最终的吸光度值，然后从标准曲线上查得相对应的值，计算出待测蛋白质的含量。
法律状态：
公开，公开，公开，实质审查的生效，实质审查的生效，实质审查的生效
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万方数据电子出版社生物污泥中蛋白质提取方法
专利名称生物污泥中蛋白质提取方法
技术领域本发明涉及一种城市污水生物处理过程中所产生的生物污泥中蛋白质提取方法，属于固体废物处理与资源化领域。
背景技术随着社会经济的发展与城市化进程的加快，城镇污水及其污泥数量快速增加。我国“十一五”规划报告中明确指出污水排放化学需氧量减排要在“十五”基础上减排10%。因此，近年来，我国污水厂数量得到飞快增加，随之而来的是大量的生物污泥。生物污泥是以微生物为主体，与污水中悬浮物、胶体物质组成的絮状混合物然，其中含有大量的蛋白质资源。文献报道剩余污泥中粗蛋白质含量可达40%以上，因此，其蛋白质资源具有较高的利用价值。目前，对于污泥蛋白质的用途主要有以下几类作为动物饲料，作为泡沫灭火器的原料，或制备生物胶粘剂。显然，这几种用途中，动物饲料的市场前景更为广阔。但作为动物饲料有严格的饲料标准，特别是对于重金属砷、铅、镉、汞以及铬等方面有较为严格的含量要求。目前文献报道的污泥蛋白质提前方法较多是碱法。该方法有利于污泥的溶胞破壁，释放出其中的蛋白质，但该方法存在的最大问题是存在较为严重的美德拉反应，产生较多的副反应，而且提取液颜色黑而粘，不利于蛋白质的分离，而且其蛋白质质量较差。酸法容胞则可以避免美德拉反应，提取液颜色较为清亮，蛋白质质量较好。但传统的酸法直接提取法存在重金属溶出问题，容易使蛋白质产品中重金属离子超标。因此，需要开发出一种新型生物污泥蛋白质提前与分离工艺。
本发明的目的是提供一种城镇污水生物处理过程中生物污泥中蛋白质提取于分离工艺，可为污泥的处理与资源化提供技术选择。本发明的技术方案如下一种生物污泥中蛋白质提取方法，步骤如下I)酸洗脱水的生物污泥加水，然后加入浓盐酸，使含水率和浓盐酸含量分别为96%和10%，随后搅拌30min，再进行离心分离，使污泥含水率为92% ；2)高温酸溶胞将第一步处理后的污泥放入容器中，然后放入高温消解装置中，加热至120°C后放置2h 8h，然后进行离心处理，得到离心溶液；3)等电点的确定取第二步得到的溶液至少6份，每份10ml，用氢氧化钠溶液调节一系列PH，室温下放置12h，随后进行高速离心分离，并测定的上清液的pH，然后采用Folin 一酚试剂法(Lowry法)测定上清液中蛋白质含量，以pH为横坐标、蛋白质浓度为纵坐标作图，以蛋白质浓度最低所对应的pH确定为其等电点pi ；4)等电点结晶用氢氧化钠溶液对第二步得到的离心溶液剩余部分进行滴定至第三步确定的等电点pH，析出蛋白质固体，放置4h，然后采用离心分离分离蛋白质固体，再用95%乙醇对该固体进行搅拌洗涤，洗涤后再次进行离心分离得到蛋白质固体；
5)干燥把得到的固体在烘箱中进行干燥，干燥温度为45°C。具体说明如下蛋白质等电点确定取每份IOml的溶胞提取液至少6份，采用氢氧化钠调节一系列不同PH值，pH范围为固体开始出现至固体开始减少，并放置12h，然后对上述多份式样进行离心分离，对上清液采用分光光度法在蛋白质的特征波长280nm处测定蛋白质含量，并测定对应上清液的PH，随后以pH为横坐标，蛋白质含量为纵坐标作图，依据数据确定蛋白质含量最小时对应的PH即为提取蛋白质的等电点。蛋白质等电点析出在常温条件下，依据实验确定的蛋白质等电点数据，采用氢氧化钠调节溶液的PH至等电点，此时蛋白质析出，随后进行离心分离，得到蛋白质固体。随后采用95%乙醇进行洗涤，并再次离心分离得到蛋白质。蛋白质固体干燥蛋白质为生物资源，其干燥温度不能太高，否则，蛋白质容易变性，使蛋白质的利用度大大降低。本工艺中蛋白质干燥温度为45°C。关于水和浓盐酸的加入方法是“先加入水后再加浓盐酸”，96%的含水率包括混合体系中所有水分，浓盐酸的质量含量是指约38%的浓盐酸在混合物中质量含量；对于步骤2) “加热至120°C”是依据试验过程中高压消解设备自身最高温度来确定的。由于酸法溶胞过程在低温下较慢，因此溶胞的实验设备采用了具有一定压力下可加热到120°C的设备进行热法酸溶胞。因此，主要是通过改变加热时间来调节其溶胞效果。等电点的确定过程中需要取部分溶胞液，通过调节不同的pH，析出蛋白质质后获得不同pH下溶液中剩余蛋白质浓度,通过蛋白质浓度和pH关系确定蛋白质浓度最低所对应的PH作为蛋白质的等电点。当然，在确定等电点过程中滤液份数越多越有利于等电点的准确确定，实验表明采用6份即可确定出等电点。本研究中等电点的确定只需要一次操作过程即可，其余实验中等电点均采用该数据。等电点结晶过程中“放置4小时”是研究中最小的放置时间，可以更长。理论上放置时间越长，蛋白质固体析出的量应该越多些，但时间太长，不利于操作，则固体的析出量的增加也不明显，因此太长的放置时间没有必要。洗涤溶剂用95%乙醇即可，如果用“无水乙醇”其价格要高，而“95%乙醇”是正规的商品，且相对于无水乙醇价格要低些。本发明所提供的生物污泥中蛋白质提取工艺包括酸洗、离心分离、洗涤、干燥等环节。洗涤采用丙酮或乙醇。本发明提供一种新的生物污泥中蛋白质提取与析出方法，其蛋白质产品中重金属含量符合国家饲料标准。该工艺得到的蛋白质产品纯度可达102% (以牛血清蛋白质为标准)。
图I蛋白质提取液等电点确定曲线。图2实施例I中蛋白质产品扫描电镜照片。图3蛋白质产品的红外谱图。图4蛋白质产品的X —射线荧光分析图谱。
具体实施例方式实施例I.取某污水厂脱水污泥500g (含水率80%)，加入蒸馏水1750g和浓盐酸250g，随后在常温下搅拌30min，并进行离心过滤，滤出滤液至含水率为92 %，然后，把泥放入容器中，再放入高温消解装置，在120°C，加热2h，冷却后进行离心过滤，得到滤液约450ml，取出滤液60ml (其余滤液放入冰箱中保存)，平均分为6份，各自放入50ml小烧杯中，用氢氧化钠溶液调节一系列pH，分别为3. 0,4. 2,5. 2,5. 6、6. 0和7. 0，室温下1放置12h，随后进行高速离心分离，保留上清液，并测定上述对应上清液的PH，分别为2. 9、3. 6、4. 7、5. 3、5. 6和6. 5，然后采用菲琳一酚法测定上清液中蛋白质含量(以牛血清蛋白质为标准)，以PH为横坐标、蛋白质浓度为纵坐标作图(见附图1)，确定其等电点Pl为5. 3。随后对剩余滤液，用10%的氢氧化钠调节PH至5. 3，常温放置4h，随后进行离心分离，再用95%乙醇对固体进行洗涤，随后在进行离心分离，得到的固体放入干燥表面皿中，放入45°C烘箱中进行干燥，干燥后称重得到淡黄色固体物质7. 02g。用菲琳一酚法测定其蛋白质的质量含量为103.8% (以牛血清白蛋白为监测标准)。红外图谱如图3所示。红外谱图中3406.31cm-l为蛋白质肽键中N-H伸缩振动，2967. 15cm-l为C-H键的伸缩振动，1656. 65cm_l为蛋白质肽键中的C=O伸缩振动，酰胺I谱带，1551. 16cm-l为蛋白质肽键中一 CONH—中的N-H键弯曲振动和C-N键伸缩振动引起的，酰胺II谱带。X—射线荧光分析图谱如图4所示。重金属铬、镉、汞以及砷元素均未检出，铅(以PbO计)在可监测的元素(原子序数大于11)中质量含量为0.02%，因此，该方法提取的蛋白质完全符合蛋白质饲料的重金属及砷的质量标准。实施例2.与实施例I相同，仅是加热时间分别为5h和8h，且无需再确定蛋白质等电点，得到的滤液直接在实施例I确定的等电点下进行蛋白质析出，随后采用95%乙醇进行洗涤，并进行干燥，得到的固体物质分别为14.43g和16.76g。其蛋白质含量分别为102. 1%和99. 8%。相应的重金属铬、镉、汞以及砷均未检出，铅(以PbO计)质量含量分别为0. 02%和
0.03%，符合蛋白质饲料对质量标准要求。本发明公开和提出的的生物污泥中蛋白质提取方法，是污水生物处理中排水中悬浮粒子浓度测定的一种简便、快速、准确的测定方法。本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变污泥悬浊液浓度的制备方法或检测目标即可实现。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
1.一种生物污泥中蛋白质提取方法，其特征是步骤如下
1)酸洗脱水的生物污泥加水，然后加入浓盐酸，使含水率和浓盐酸含量分别为96%和10%，随后搅拌30min，再进行离心分离，使污泥含水率为92% ；
2)高温酸溶胞将第一步处理后的污泥放入容器中，然后放入高温消解装置中，加热至120°C后放置2h 8h,然后进行离心处理,得到离心溶液；
3)等电点的确定取第二步得到的溶液至少6份，每份10ml，用氢氧化钠溶液调节一系列PH，室温下放置12h，随后进行高速离心分离，并测定的上清液的PH，然后采用菲琳一酚法测定上清液中蛋白质含量，以PH为横坐标、蛋白质浓度为纵坐标作图，以蛋白质浓度最低所对应的pH确定为其等电点pi ；
4)等电点结晶用氢氧化钠溶液对第二步得到的离心溶液剩余部分进行滴定至第三步确定的等电点PH，析出蛋白质固体，放置4h，然后采用离心分离分离蛋白质固体，再用95%乙醇对该固体进行搅拌洗涤，洗涤后再次进行离心分离得到蛋白质固体；
5)干燥把得到的固体在烘箱中进行干燥，干燥温度为45°C。
本发明公开了一种生物污泥中蛋白质提取方法，主要包括污泥酸洗、高温酸溶胞、等电点确定、等电点结晶、有机溶剂洗涤和低温干燥环节。分离得到的蛋白质固体呈淡黄色粉末，蛋白质采用以牛血清蛋白为标准的紫外分光光度法监测的纯度可大于99.8％。产品的红外光谱证明该固体粉末具有显著的蛋白质结构特征。产品的X－射线荧光分析表明该方法分离得到的蛋白质无重金属汞、镉、铬以及有毒元素砷，仅含有少量的铅，且铅(以PbO计)质量含量小于0.03％，符合蛋白质饲料对该指标的要求。本发明提出的污水生物处理过程中产生的污泥中蛋白质的分离与资源化方法，为城市污泥的资源化处理提供一个有益方法。
文档编号C02F11/00GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者刘勇, 郭祥 申请人:天津大学